Typer av hemocyter hos syrsor

Figur 1A visar en DIC-mikroskopibild (Differential Interference Contrast) av syrsors hemocyter, som visar celler av olika storlek och form. För en noggrann identifiering av dessa hemocyter klassificerades cirka 1 000 celler utifrån storlek och morfologi (data visas inte) i sex typer (fig. 1B~G). Som framgår av fig. 1B observerades den typiska granulocyten i hemolymfen. Granulocyterna var vanligtvis runda eller ovala till formen och många polymorfa granuler observerades i cytoplasman. Små pseudopoder eller filopoder observerades på granulocyternas plasmamembran (Fig. 1B, markerade med vita pilar). Den cell som visas i fig. 1C ansågs vara plasmatocyter på grund av deras typiska spindelform och de långa, hårliknande strukturer som observerades i båda ändarna av plasmamembranet (markerade med vita pilar). Figur 1D visar en prohemocyt, som är de minsta runda cellerna som observeras i insektshämolymfen. Kärnorna var stora i förhållande till cellstorleken och befann sig i mitten av cellen (figur 1D). Prohemocyternas cytoplasma och kärna kunde således ofta inte särskiljas från varandra. Figur 1E visar en koagulocyt som innehåller olika cytoplasmatiska granuler. Koagulocyternas plasmamembran var släta, utan några strukturer, och deras kärnor var stora och lätta att observera. Oenocytoiderna var den största typen av hemocyter som observerades och var sällsynta i hemolymfen (fig. 1F). Oenocytoiderna hade vanligtvis en rund stekt äggform med många cytoplasmiska granuler. Figur 1G visar en sfärulocyt, som var rund och medelstor med många små mörka eller glänsande granuler i cytoplasman. Som framgår av figur 1D~G syntes inga strukturer på plasmamembranen hos prohemocyterna, koagulocyterna, oenocytoiderna eller sfärulocyterna, som var optiskt mycket släta.

De sex typer av hemocyter som observerats i syrsors blod. Hemocyternas övergripande form och relativa storlek i hemolymfen (A). De sex typerna av hemocyter som hittades i G. bimaculatus klassificerades som granulocyter (B ; GR), plasmatocyter (C ; PL), prohemocyter (D ; PR), koagulocyter (E ; CO), oenocytoider (F ; OE) och sfärulocyter (G ; AD) baserat på storlek och morfologi. De fläktliknande eller amöba-liknande strukturerna på granulocyternas och plasmatocyternas plasmamembran anges med vita pilar (B och C). Skalstreck = 25 µm (A) eller 10 µm (B~G).

Nodulering och inkapsling av hemocyter

I insekter utförs cellulära immunresponser såsom nodulering, inkapsling och fagocytos av immuna hemocyter såsom granulocyter och plasmatocyter. Efter exponering för patogener ändrar dessa hemocyter sin form och utvecklar stora amöba-liknande eller fläktliknande strukturer i sina plasmamembran. För att observera dessa snabba morfologiska förändringar i realtid har vi utvecklat en teknik som gör det möjligt att odla insektshemocyter i sju dagar samtidigt som den fysiologiska aktiviteten bevaras (beskrivs i Material och metoder). Även om vi inte kunde etablera stabila hemocytlinjer som kan passageras i flera år, kunde vi observera hemocyternas morfologi som svar på patogener in vitro. Den kompletterande filmen C visar endast hemocyter efter 12 timmars inkubation. De flesta odlade cellerna rörde sig aktivt. Vissa celler uppvisade nät runt cellmembranet under odlingen och befanns vara fästa vid odlingsglasen. Hemocyterna aggregerade sällan eller bildade stora kluster.

Figur 2A visar hemocyter odlade med E. coli (se även Supplementary Movie 1). Vissa hemocyter observerades vara mer aggregerade och rörliga. När inkubationstiden ökade producerades nät (amöba-liknande hår eller extracellulära fällor) av specifika hemocyter, och olika hemocyter samlades genom dessa nät för att bilda stora kluster (fig. 2A-1~A-6; amöba-liknande hår eller extracellulära fällor indikeras med svarta pilar). Som visas i fig. 2A-1 drogs tre grupper av hemocyter (indikerade med svarta cirklar) slutligen ihop till ett kluster av näten (fig. 2A-5 och A-6).

Live-cellbilder av syrenhemocyter som infekterats med E. coli eller Sephadexpärlor. (A) Ljusmikroskopiska bilder som visar hemocyter som odlats med E. coli. När inkubationstiden ökade producerades nät (amöba-liknande hår eller extracellulära fällor; indikeras av svarta pilar) av specifika hemocyter. Alla sex typer av hemocyter aggregerades till stora kluster av dessa nät (A-1~A-6; markerade med svarta rutor). Filmen finns tillgänglig som Movie 1 (tid i minuter efter inokulering). (B) Ljusmikroskopbilder som visar hemocyter som odlats med Sephadexpärlor. Sefadexpärlor runt hemocyterna märktes slumpmässigt med SP1, SP2, SP3, SP4 och SP5. Med tiden blev Sephadexpärlorna (SP1, SP2, SP3 och SP4) omgivna av hemocyter och inkapslade av olika typer av nät (B-1~B-9; markerade med svarta pilar). Film tillgänglig som film 2 (tid i minuter efter inokulering). Skala = 25 µm (A och B). Film C visar hemocyter odlade ensamma, utan Sephadexpärlor. De flesta hemocyter rörde sig aktivt. Några få celler var fästa vid odlingsglasen med nät av plasmamembran. Stora kluster av hemocyter observerades dock inte.

Det var dock inte möjligt att avgöra om den samling av hemocyter som beskrivs ovan utlöstes av E. coli. För att besvara denna fråga aktiverades hemocyterna med Sephadexpärlor (120 μm diameter), som lätt kan observeras med ett DIC-mikroskop (Fig. 2B, Supplementary Movie 2). Som visas i fig. 2A fångades Sephadexpärlorna av de nät som genererades av specifika hemocyter (fig. 2B; näten indikeras av svarta pilar i de gula rutorna). Sefadexpärlorna runt hemocyterna märktes slumpmässigt med SP1, SP2, SP3, SP4 och SP5. Som framgår av en jämförelse mellan fig. 2B-2 och B-3 drogs SP1, SP2 och SP3 samman och in i det område som anges av den gula rutan. Dessutom blev SP1 så småningom helt omgiven av olika hemocyter (fig. 2B-9). Den pärla som var märkt med SP4 införlivades också i klustret med SP1, SP2 och SP3 (fig. 2B-4~B-9; indikerat av den gula rutan). Med tiden blev alla Sephadexpärlor (SP1, SP2, SP3 och SP4) omgivna av många hemocyter. Däremot observerades enskilda hemocyter i kontakt med SP5, men den drogs inte in i det område som anges av den gula rutan trots att den befann sig i ett liknande läge som SP1. Därför tycktes noduleringen av hemocyter ske slumpmässigt.

Granulocytaktivering av karboxylatmodifierade polystyrenlatexpärlor

Nästan undersökte vi vilka hemocyter som producerade näten och deltog i de olika stegen i immunsvaret, inklusive inkapsling och nodulering. För detta ändamål användes karboxylatmodifierade polystyrenlatexpärlor, som lätt kan observeras med ett DIC-mikroskop, i stället för patogener, och realtidsbilder av hemocyterna samlades in. Figur 3A visar hemocyter som stimulerats med karboxylatmodifierade polystyrenlatexpärlor i 12 timmar (Supplementary Movie 3). De nät som produceras av hemocyterna (markerade med svarta pilar) rörde sig aktivt runt latexpärlorna (markerade med röda pilar) (Fig. 3A-1). Med tiden absorberades pärlorna av näten och kunde så småningom ses i hemocyternas cytoplasma (fig. 3A-2~A-4). Det var dock inte alla karboxylatmodifierade polystyrenlatexpärlor som mötte ett nät som fagocyterades. De aktiverade hemocyternas rörelse tycktes alltså inte exakt motsvara pärlornas rörelse.

Live-cellbilder av granulocyter som stimulerats med karboxylatmodifierade polystyrenlatexpärlor. (A) Ljusmikroskopiska bilder som visar hemocyter som odlats med karboxylatmodifierade polystyrenlatexpärlor i 12 h. A-1~A-4, odlade hemocyter efter 12~18 min. De nät som produceras av hemocyterna (svarta pilar) kan ses bildas runt latexpärlorna (markerade med röda pilar). Latexpärlorna slukades av näten och fångades så småningom in i hemocyternas cytoplasma (A-4). Filmen finns tillgänglig som film 3 (tid i minuter efter stimulering). Skala = 40 µm. (B) Förstorade bilder. (B-1) Efter 4 timmar fångades många karboxylatmodifierade polystyrenlatexkulor av hemocyter (latexkulor, röda pilar, och specifika hemocyter, vita cirklar). (B-2~B-6) Odlade granulocyter 0, 2, 4, 12 och 48 timmar efter stimulering. (B-2) Granulocyter i vila, som är runda eller ovala till formen. (B-3) 2 timmar efter stimulering började granulocyterna uppvisa morfologiska förändringar, och fläktliknande eller amöba-liknande plasmamembranstrukturer (vita pilar) kan ses. (B-4 och -5) Ett stort antal latexpärlor hade ansamlats i granulocyternas cytoplasma vid 4 och 12 timmar efter infektionen. (B-6) 48 timmar efter infektionen hade många latexpärlor ansamlats i granulocyternas cytoplasma, men nät observerades inte längre, och många granulocyter verkade vara inaktiva. Skalstreck = 15 µm (B-1) eller 10 µm (B-2~B-6).

Detaljerade observationer gjordes med hjälp av ett konfokalmikroskop med hög förstoring (fig. 3B). Vid 4 timmar efter infektionen kunde de karboxylatmodifierade polystyrenlatexpärlorna observeras inom vissa hemocyter (fig. 3B-1; pärlorna anges med röda pilar och specifika hemocyter anges med vita cirklar). Därefter observerade vi vilka specifika celler som slukade latexpärlorna mer i detalj (fig. 3B-2~B-6). Figur 3B-2 visar vilande granulocyter, som vanligen var runda eller ovala till formen, med många polymorfa mörka granuler i cytoplasman. Två timmar efter stimulering med karboxylatmodifierade polystyrenlatexpärlor började granulocyterna uppvisa morfologiska förändringar, inklusive fläktliknande eller amöba-liknande utskjutningar av plasmamembranet (fig. 3B-3; indikerat med vita pilar). Karboxylatmodifierade polystyrenlatexpärlor observerades i granulocyternas cytoplasma 4 timmar efter stimulering, och ett stort antal latexpärlor hade ackumulerats i cytoplasman hos många granulocyter 12 timmar efter stimulering (fig. 3B-4 och B-5; pärlor indikeras med röda pilar, och nät indikeras med vita pilar). Dessutom observerades att näten blev större och bredare med tiden (fig. 3B-4 och B-5). 48 timmar efter stimulering hade många latexpärlor ackumulerats i granulocyternas cytoplasma, men näten kunde inte längre ses och många granulocyter verkade vara inerta (fig. 3B-6; pärlor markerade med röda pilar).

Som framgår av fig. 2 tycktes granulocyterna fästa inte bara vid andra granulocyter, utan även vid olika typer av hemocyter med hjälp av dessa nät. Vi observerade inte fagocytos i någon annan celltyp med undantag för ett litet antal plasmatocyter (data visas inte). Dessutom observerade vi ingen immunologisk aktivitet eller morfologiska förändringar i någon annan celltyp än granulocyter och ett litet antal plasmatocyter.

Granulocyternas lysosomer aktiverades genom injektion av E. coli-partiklar

För att undersöka om de vakuoler som observerades i granulocyterna var patogenrelaterade fagosomer injicerades syrsor med E. coli-partiklar, som främst används som markörer för fagocytos och fluorescerar grönt när de når försurade organeller som intracellulära lysosomer. Samtidigt färgades totala hemocyter med LysoTracker Red, som markerar lysosomer. Som visas i figur 4A-1 observerades en grön fluorescerande signal (fagocyterade E. coli-partiklar) i granulocyternas cytoplasma omedelbart efter injektion av partiklarna. Samtidigt observerades också en röd fluorescerande signal, som indikerar aktiverad lysosombildning (fig. 4A-2). 4 timmar efter injektion kunde man se mycket polymorfa vakuoler i många granulocyter (fig. 4A-4 och A-5). Sammanslagna bilder av den gröna fluorescerande signalen (fagocyterade E. coli-partiklar) och den röda fluorescerande signalen (aktiverade lysosomer) visas (fig. 4A-6). 12 timmar efter injektion började den gröna fluorescerande signalen att avta, medan den röda fluorescerande signalen kvarstod (fig. 4A-7~A-9). Vid 24 timmar efter injektion hade båda fluorescenssignalerna dämpats (fig. 4A-10~A-12). Den röda fluorescerande signalen i granulocyter observerades dock återigen 48 timmar efter injektion (fig. 4A-13~A-15). Figur 4Aa~Ao visar insatserna i panelerna A-1~A-15 (markerade med vita rutor) i högre förstoring. Syrsor som injicerades med enbart PBS-buffert var negativa för röd och grön fluorescens vid alla tidpunkter efter injektion (fig. 4B).

LysoTracker Red-märkning av granulocytlysosomer hos syrsor som injicerats med grönt fluorescerande E. coli-partiklar. (A) Utveckling av granulocytlysosomer 0 timmar, 4 timmar, 12 timmar, 24 timmar och 48 timmar efter injektion av E. coli-partiklar. (A-1, A-4, A-7, A-10 och A-13) E. coli-partiklarna, som används som markörer för fagocytos, fluorescerar grönt när de når försurade organeller som intracellulära lysosomer. (A-2, A-5, A-8, A-11 och A-14) Konfokala fluorescensmikroskopbilder av granulocyter färgade med LysoTracker Red (en lysosomal markör). (A-1 och A-2) De gröna och röda fluorescerande signalerna kunde observeras i granulocyternas cytoplasma med början 1 timme efter injektion. (A-4 och A-5) Många granulocyter visade grön och röd fluorescens i granulocyternas mycket polymorfa vakuoler 4 timmar efter injektion. (A-7 och -8) 12 timmar efter injektion hade den gröna fluorescerande signalen avtagit men den röda fluorescerande signalen fanns kvar. (A-10 och A-11) 24 timmar efter injektion hade både den gröna och den röda fluorescerande signalen nästan försvunnit. (A-13 och A-14) 48 timmar efter injektion hade den gröna fluorescerande signalen helt försvunnit men den röda fluorescerande signalen observerades igen. Sammanlagda bilder av de gröna och röda fluorescerande signalerna visas (A-3, A-6, A-9, A-12 och A-15). (a~o) Insatserna i panelerna A-1 ~A-15 (markerade med vita rutor) i högre förstoring. (B) Den röda fluorescerande signalen i granulocyter från syrsor som injicerats med PBS (negativ kontroll). (C) Flödescytometrisk analys 1 h ~ 48 h efter injektion. (C-1 och C-2) Den gröna fluorescerande signalen var 2,08 % vid 1 timme efter injektion och ökade till 24,6 % vid 4 timmar efter injektion. (C-3~C-5) Den gröna fluorescerande signalen minskade gradvis, till 10,87 % vid 12 timmar, 3,98 % vid 24 timmar och 1,74 % vid 48 timmar. (C-1-1~C-4-1) Den röda fluorescerande signalen ökade till 69,54 % vid 12 timmar efter injektion och minskade till 5,78 % vid 24 timmar efter infektion. (C-5-1) Den röda fluorescerande signalen ökade igen, till 30,25 %, 48 timmar efter injektion. (C-1-2~C-5-2) Den röda fluorescerande signalen i granulocyter från syrsor som injicerats med enbart PBS-buffert. (D) Flödescytometrianalyserna upprepades tre gånger.

För att kvantifiera de grön- och rödfluorescerande signalerna i PBS- eller E. coli-challengagerade syrsor analyserades hemocyter med flödescytometri 0~48 timmar efter injektion (Fig. 4C). Vid 0 timmar efter injektion var 2,08 % av hemocyterna positiva för grön fluorescens, och detta ökade till 24,36 % vid 4 timmar efter injektion (fig. 4C-1 och C-2). Den gröna fluorescerande signalen minskade gradvis till 10,87 % av hemocyterna vid 12 timmar, 3,98 % vid 24 timmar och 1,74 % vid 48 timmar (fig. 4C-3~C-5). Dessa resultat tyder på att E. coli-partiklar aktivt absorberades och smältes av granulocyter och var helt rensade 48 timmar efter injektionen. Vid 12 timmar efter injektion var 69,54 % positiva för röd fluorescens, och signalen minskade till 5,78 % av hemocyterna vid 24 timmar efter injektion (fig. 4C-1-1~C-4-1). I överensstämmelse med våra mikroskopiska observationer ökade den röda fluorescerande signalen till 30,25 % av hemocyterna 48 timmar efter injektion. Däremot var syrsor som injicerades med PBS negativa för grön och röd fluorescens vid alla tidpunkter (fig. 4C-1-2~C-5-2). Flödescytometrianalysen upprepades tre gånger (Fig. 4D).

Reaktivering av granulocytlysosomer 48 timmar efter infektionen

Reaktiveringen av granulocytlysosomer 48 timmar efter infektionen undersöktes ytterligare genom mikroskopisk observation (Fig. 5A och B). Som visas i fig. 4A sågs den gröna fluorescerande signalen (fagocyterade E. coli-partiklar) och den röda fluorescerande signalen (aktiverade lysosomer) vid 4 timmar efter injektion (fig. 5A-1~A-3). De fluorescerande signalerna hade dämpats 24 timmar efter infektionen (fig. 5A-4~A-6). Vid 24 timmar efter infektionen observerade vi att celler kunde ses i granulocyternas cytoplasma (fig. 5A-4~A-6; indikerat med vita pilar). Detta fenomen var tydligare 48 timmar efter infektionen (fig. 5A-7~A-9; markerade med vita pilar). Dessutom var lysosomerna runt dessa uppslukade celler 48 timmar efter infektionen aktiverade (fig. 5A-8). Såsom visas i fig. 4A-14, 4C-5-1 verkar dessa mikroskopiska observationer förklara ökningen av den röda fluorescerande signalen 48 timmar efter infektionen. För att bekräfta detta färgades granulocyternas kärnor med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 48 timmar efter infektionen. Som framgår av figur 5B-1 observerades ofta granulocyter med två kärnor. Ibland observerades också granulocyter som innehöll mer än två kärnor, eller deformerade kärnor (fig. 5B-2 och B-3; markerade med vita pilar).

Reaktivering av granulocytlysosomer 48 timmar efter injektion. (A) Fluorescensmikroskopbilder av granulocyter 4 timmar, 24 timmar och 48 timmar efter injektion. (A-1 och A-2) Granulocyter visade gröna och röda fluorescerande signaler i de mycket polymorfa vakuolerna vid 4 timmar efter injektion. (A-4 och A-5) 12 timmar efter injektion hade den gröna fluorescerande signalen dämpats, men den röda fluorescerande signalen fanns kvar. Dessutom observerades några celler i granulocyternas cytoplasma (vita pilar). (A-7 och A-8) Detta fenomen observerades oftare vid 48 timmar efter injektion. Dessutom aktiverades lysosomerna som omgav dessa uppslukade celler (A-8). Sammanslagna bilder av de gröna och röda fluorescerande signalerna visas (A-3, A-6 och A-9). (B) Granulocyter färgade med DAPI 48 timmar efter injektion. (B-1) Två kärnor observerades i granulocyternas cytoplasma. (B-2 och B-3) Ibland observerades två eller fler kärnor, eller deformerade kärnor, i granulocyternas cytoplasma (markerade med vita pilar). Skalstreck = 10 µm (A) eller 20 µm (B).

Nekrosrelaterad granulocytcelldöd 48 timmar efter infektionen

Som framgår av figurerna 3B-6 och 5A-8 förändrade ackumuleringen av fagosomer i granulocyter deras form och framkallade celldöd. 48 timmar efter infektionen färgades hemocyterna med fluoresceinisotiocyanat (FITC)-konjugerat annexin V och propidiumjodid (PI) för att bekräfta apoptotisk eller nekrotisk celldöd (fig. 6A). Den gröna fluorescerande signalen (annexin V) ökade endast svagt mellan 12 timmar och 48 timmar (fig. A-10, A-7 och A-10), men den röda fluorescerande signalen (PI) uppvisade stark färgning 12 timmar efter infektionen (fig. 6A-5). Vid 24 och 48 timmar efter infektionen kvarstod den röda fluorescerande signalen (fig. 6A-8 och A-11). Sammanfogade bilder av den röda fluorescenssignalen (PI) och DIC-bilderna visas (fig. 6A-3, A-6, A-9 och A-12). Figur 6Aa~Ad visar insatserna i panelerna A-3, A-6, A-9 och A-12 som anges av rutorna i högre förstoring. Dessa resultat tyder på att ackumuleringen av fagosomer i granulocyter inte inducerade typisk apoptotisk celldöd utan nekrosrelaterad celldöd. För att kvantifiera PI-färgningen färgades hemocyter och undersöktes med flödescytometri 0 timmar, 12 timmar, 24 timmar och 48 timmar efter infektionen. Vid 12 timmar efter infektionen färgades 71,29 % av granulocyterna med PI, jämfört med 13,52 % vid 0 timmar (fig. 6B-1 och B-2). Vid 24 timmar efter infektionen hade PI-färgningen minskat något, till 45,97 %, men ökade återigen till 76,24 % vid 48 timmar (fig. 6B-3 och B-4). Flödescytometrianalysen upprepades tre gånger (fig. 6C).