Abstract

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) används i stor utsträckning i folkmedicin. Glycyrrhizin, en aktiv förening av G. glabra, har antiinflammatorisk aktivitet. I den här studien undersöks G. glabra metanol-extrakt och glycyrrhizin för behandling av korneal neovaskularisering (CNV). G. glabra extraherades i 70 % vattenhaltig metanol. Fytokemiska tester, tunnskiktskromatografi (TLC) och högpresterande vätskekromatografi (HPLC) användes för analys av kemisk sammansättning. Den topiska lösningen av G. glabra metanolextrakt (2 % w/v) och glycyrrhizin (1 % w/v) framställdes i normal koksaltlösning. Efter bränning av hornhinnan (1 N NaOH) lämnades djuren obehandlade i en vecka så att neovaskularisering uppstod i alla grupper. Behandlingarna inleddes dag 7 och fortsatte under de följande 21 på varandra följande dagarna. Djuren behandlades med 3 droppar av olika topiska lösningar tre gånger om dagen. Digital fotoanalys och histologiska studier användes för utvärdering av CNV. Fytokemisk analys av G. glabra metanol-extraktet visade förekomsten av saponiner, fenoler, kolhydrater, flavonoider och proteiner. TLC och HPLC bekräftade förekomsten av glycyrrhizin. Fotoanalys av den behandlade gruppen med extrakt och glycyrrhizin visade en avsevärd minskning av CNV. Histologisk undersökning av G. glabra- och glycyrrhizinbehandlade grupper visade inga blodkärl med ordentligt arrangerade kollagenfibrer. Denna studie visade att G. glabra och glycyrrhizin kan användas för behandling av CNV. Bioassaystyrd isolering kan leda till beredning av oftalmiska lösningar för behandling av CNV.

1. Introduktion

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) är infödd i Medelhavsområdet, centralt i södra Ryssland och Asien, och odlas nu i stor utsträckning i hela Europa och Mellanöstern. Lakrits har ett högt näringsvärde och har använts i livsmedel sedan antiken. I livsmedel används den främst som sötningsmedel. Den har också egenskaper för att hämma törstkänslan . Lakritsolja är godkänd av Food and Drug Administration (FDA) och används i olika livsmedelsprodukter som drycker, tandkräm, tuggummi och kosmetika . G. glabra har använts i stor utsträckning inom folkmedicinen för behandling av olika sjukdomar . G. glabra blad används för behandling av sår rötter för diabetes, Graves sjukdom och flatulens och stammen för behandling av tuberkulos . Den används också som afrodisiakum . Metanolutdraget av G. glabras luftdelar visade antimikrobiell aktivitet mot flera bakteriearter . Det vattenhaltiga metanolutdraget av G. glabra hämmade in vitro och in vivo spridningen av Ehrlich ascites tumörceller och visade antiangiogen aktivitet i in vivo, peritoneal och chorioallantoic membran assays . Lakrits visade också antitrombocytaggregationseffekter och har också använts som en hostlindrande medicinalväxt sedan urminnes tider . Kinesiska lakritsrötter visade sig hämma tillväxten av Plasmodium falciparum och Leishmania donovani i in vitro-studier . Dessutom har lakrits rapporterats ha antibakteriell och antiviral aktivitet.

G. glabra innehåller flera kemiska beståndsdelar, t.ex. saponin, flavonoider, isoflavonoider, stilbenoider och kumariner. De aktiva beståndsdelarna i saponiner är glycyrrhizin, liquiritsyra och glycyrretol. Bland flavonoiderna är de aktiva beståndsdelarna liquirtin, liquiritigenin och neoliquiritin. I isoflavonoiderna är de glabridin, glabrone, glyzarin och galbrene. De aktiva beståndsdelarna i kumariner är liqcoumarin och umbelliferon . I stilbenoider är den aktiva beståndsdelen dihydrostilbener . Glycyrrhizin är ett kalium- och kalciumsalt av glycyrrhizinsyra. Det är en saponinglykosid som vid hydrolys ger glycyrrhetinsyra . Glycyrrhizin, även känd som glycyrrhizinsyra, är den viktigaste (10-25 %) aktiva beståndsdelen i G. glabra rotextrakt . Glycyrrhizin hjälper till att hämma lungcancer och fibrosarkom . I Japan har den använts för behandling av hepatit C i mer än 60 år . Dessutom uppvisade glycyrrhizin proapoptotiska egenskaper i en hepatocytmodell av kolestatisk leverskada . Glycyrrhetinsyra visade sig vara en potent hämmare av gallsyrainducerad apoptos och nekros . Medlemmar av flavonoiderna som isoliquiritigenin och licochalcon har visat sig ha antioxidativa, antitumör-, antiinflammatoriska och antiangiogena aktiviteter .

Hornhinnan är en genomskinlig, avaskulär och yttre vävnad i ögat. Dess transparens är nödvändig för att synen ska bli klar och tydlig. Under normala förhållanden upprätthålls hornhinnans avaskuläritet av en balans mellan angiogena och antiangiogena faktorer. Förskjutning av denna balans till förmån för angiogena faktorer orsakar corneal neovaskularisering (CNV) . CNV är ett patologiskt tillstånd där hornhinnan förlorar sin transparens på grund av att nya blodkärl växer in från ögats limbus. Utveckling av CNV leder till en minskning av hornhinnans genomskinlighet och orsakar följaktligen synnedsättning vanligtvis förlust av det centrala synfältet eller kan till och med leda till blindhet .

Och även om den exakta orsaken till CNV ännu inte är helt identifierad, kan flera patologiska tillstånd såsom inflammation, infektion, degeneration och traumatiska störningar framkalla CNV. Användning av kontaktlinser orsakar också hypoxi, vilket i slutändan kan leda till CNV. Bland dessa faktorer är infektionssjukdomar i hornhinnan den viktigaste orsaken till CNV . För närvarande omfattar behandlingsalternativen för CNV läkemedel som icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID), steroider och ciklosporin , laserbehandlingar som termisk argonlaserfotokoagulering , fostermembrantransplantation och limbaltransplantation . Alla tillgängliga behandlingar har dock nackdelar som hög kostnad, låg effektivitet och allvarliga biverkningar.

Det finns ett skriande behov av att hitta nya och alternativa behandlingar för CNV. Tidigare har man observerat att extrakt och föreningar med antiinflammatoriska och antiangiogena aktiviteter har potential att behandla CNV. Baserat på etnofarmakologisk och annan vetenskaplig information om antiinflammatoriska och antiangiogena aktiviteter hos G. glabra-extraktet och dess viktigaste kemiska beståndsdel, glycyrrhizin, genomfördes den aktuella studien för att bedöma deras potential för behandling av CNV. Man fann att G. glabra-extraktet effektivt stoppade CNV men att glycyrrhizin visade sig vara relativt mindre effektivt för att stoppa utvecklingen av CNV i djurmodellen.

2. Material och metoder

2.1. Växtmaterial

G. glabra-rötter köptes i juni 2015 från en autentisk örtbutik i Abbottabad, Pakistan. Identifikationen av exemplaret (kupongnummer gg-09-R/15) bekräftades av Dr. Abdul Nazir, biträdande professor, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Pakistan, och växtexemplaret deponerades till Department of Pharmacy, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Pakistan.

2.2. Kemikalier

Glycyrrhizin (renhet 75 %) köptes från Sigma Aldrich, USA. Ketamin HCl (Indus Pharma, Pakistan), xylazin HCl (FARVET, Peru), proparakain HCl (Alcon Laboratories, Inc., USA) och normal koksaltlösning (Otsuka Pakistan Ltd.) köptes från ett lokalt apotek.

2.3. Behandling och extraktion

Det torkade växtmaterialet maldes och extraherades genom att blötlägga pulveriserat material (745 g) i 70 % vattenhaltig metanol (3 L) vid rumstemperatur. Blandningen rördes då och då med en stav av rostfritt stål i två veckor för att få maximalt extrakt. Extraktet filtrerades genom en muslinduk följt av Whatman-filterpapper nummer 42 (125 mm). Extraktet koncentrerades med hjälp av en vakuumrotationsförångare (Yamato Rotary Evaporator, RE 801; Sydkorea) med vattenbadet inställt på 40 °C. Det slutliga procentuella utbytet av extraktet var 12,2 %.

2.4. Fytokemisk analys och fingeravtryck

Råextraktet genomgick en preliminär fytokemisk analys för alla viktiga kemiska beståndsdelar med hjälp av kemiska standardtester . För alkaloider skakades extraktet (500 mg) med 5 mL 1 % HCl och värmdes försiktigt i 1 min med hjälp av ett vattenbad. Därefter togs 1 mL av denna lösning och 0,5 mL av Wagners reagens tillsattes. Utvecklingen av turbiditet eller utfällningar indikerar förekomsten av alkaloider. För steroider användes Salkwoskis test där 2 mL kloroform tillsattes för att lösa upp 100 mg extrakt i ett provrör. Därefter tillsattes försiktigt 2 mL koncentrerat H2SO4 för att bilda det undre skiktet. En grön färg bildades i det övre skiktet, vilket indikerar förekomsten av steroider. För saponiner (skumtest) löstes 3 mg extrakt i 10 mL destillerat vatten och skakades kraftigt i ett provrör och fick stå i 1 minut. Om det bildas ett jämnt skum indikerar det att det finns saponiner. För flavonoider (blyacetatprov) tillsattes 1 mL blyacetatlösning (5 %) till 1 mg av växtextraktet i ett provrör. Blandningen fick stå ostört. Bildandet av gulfärgade utfällningar indikerade förekomsten av flavonoider. För fenoler (järnkloridtest) togs 2 mg extrakt i ett provrör och 3 droppar 10 % järnklorid tillsattes. Om en blåsvart färg uppstod visade det på förekomsten av fenoler. För glykosider (nitroprussidtest) tillsattes metanolutdraget med några droppar 10 % natriumhydroxid och därefter tillsattes natriumnitroprussid till ovanstående lösning. Om det uppstod en blå färg visade det på förekomst av glykosider i extraktet. För reducerande sockerarter tillsattes Fehlings lösning (A och B) till vattenhaltigt metanolextrakt (100 mg/mL) i ett provrör. Den resulterande lösningen värmdes på ett vattenbad i 10 minuter. Bildandet av en röd-orange utfällning var en positiv indikation på förekomsten av reducerande sockerarter. För att upptäcka proteiner behandlades växtextraktet med några droppar koncentrerad salpetersyra. Bildandet av en gul färg indikerade förekomsten av proteiner.

Tunnskiktskromatografi (TLC) användes för identifiering av olika föreningar, särskilt den viktigaste kemiska beståndsdelen, glycyrrhizin. Extraktet och glycyrrhizin applicerades på TLC-plattor belagda med kiselgel (60 F254) och utvecklades i n-butanol, ättiksyra och destillerat vatten (12 : 3 : 5) som rörlig fas. Ceriksyra sulfat användes som sprutreagens för visualisering av föreningar på TLC-plattor.

Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) (Perkin Elmer, Series 200 Auto sampler) användes för analys av extrakt och glycyrrhizin. Följande villkor tillämpades under HPLC-fingeravtrycksanalysen: UV-Vis-detektor (200-700 nm), kolonn (C18) (5 μm, 150 mm × 4,6 mm), rörlig fas som var acetonitril och vatten i förhållandet 10:90, injektionsvolym som var 20 μL, flödeshastighet som var 1 ml/min och membranfilter på 0,45 μm användes. Föreningarna detekterades vid en våglängd på 254 nm. För G. glabra togs 100 mg av extraktet i 25 mL 70 % vattenhaltig metanol i en mätkolv (50 mL) och sonicerades i 50 minuter vid rumstemperatur. Glycyrrhizinstandardlösningen framställdes genom att lösa 5 mg glycyrrhizin i metanol och slutvolymen gjordes till 10 mL genom ytterligare tillsats av metanol. Stamlösningarna av G. glabra-extrakt och glycyrrhizin filtrerades och avgasades med ultraljud före analysen.

2.5. Djur

Rabbar av båda könen (1,5-2 kg) användes som djurmodell i den aktuella studien. Dessa köptes från den lokala marknaden i Abbottabad City. Försöksprotokollet godkändes enligt bestämmelserna i CIIT Abbottabads etiska kommitté för djur med godkännandenummer PHM.Eth/SP.14-714-CIIT-ATD den 11 juli 2015, vilket följer alla rekommendationer i NIH Animal Ethical Guideline (1986). Kaninerna delades slumpmässigt in i fyra grupper med minst fem djur per grupp. Därefter märktes varje kanin ytterligare på örat inom grupperna för att garantera deras uppdelning under hela försöksförfarandet. Djuren placerades i standardförhållanden och fick fri tillgång till mat och vatten.

2.6. Induktion av hornhinnebränning i kaninens öga

För induktion av CNV skadades de högra ögonen hos alla försöksdjur genom alkali-bränning (1 N natriumhydroxidlösning) med hjälp av det rapporterade protokollet . I korthet svalts försöksdjuren i 12 timmar innan försöket påbörjades. Djuren sövdes med en intramuskulär injektion av ketamin HCl (50 mg/kg) och xylazin (5 mg/kg) i kombination. Därefter öppnades kaninens högra öga med ett trådspekulum så att alkali-brännskadan kunde induceras ordentligt. Ungefär 2 minuter före brännskadan instillerades några droppar proparakain HCl i varje kanins högra öga för att minimera irritationen i hornhinnan. En pappersstans användes för att ta fram en 7 mm stor skiva av Whatman-filterpapper. Filterpappersskivorna doppades försiktigt i 1 N natriumhydroxidlösning i cirka 90 sekunder och placerades därefter centralt på hornhinnan i 2 minuter för att framkalla svåra brännskador. Ögonen tvättades med normal koksaltlösning för att fukta dem och för att uppnå sterilitet. Efter brännskadan på hornhinnan hölls kaninerna i en vecka för utveckling av CNV utan ytterligare behandling.

2.7. Förberedelser av ögondroppar och behandlingsprotokoll

Den aktuella lösningen av G. glabra-extrakt (2 % w/v) förbereddes i normal koksaltlösning med 10 % dimetylsulfoxid (DMSO) och några droppar Tween-80 och blandades med hjälp av vortexblandare. På samma sätt framställdes glycyrrhizin (1 % w/v) lösning i normal koksaltlösning. För beredning av vätskan blandades dimetylsulfoxid (DMSO) (10 % v/v) och några droppar Tween-80 i vanlig koksaltlösning. Dexametason (0,1 %) (ALCON-COUVREUR, Belgien) erhölls från den lokala marknaden och användes som positiv kontroll. Alla aktuella lösningar förpackades i speciella droppflaskor som köptes från den lokala marknaden och förvarades vid 4 °C. Behandlingarna påbörjades den sjunde dagen efter brännskadorna på hornhinnan och fortsatte under de följande 21 på varandra följande dagarna. Ögonen i de olika djurgrupperna behandlades lokalt med 3 droppar av de olika lösningarna tre gånger om dagen. Den första gruppen fick behandling med G. glabra-extrakt medan den andra gruppen behandlades med glycyrrhizin. Den tredje gruppen fick fordonet och den fjärde gruppen som behandlades med dexametason (0,1 %) betraktades som en positiv kontroll.

2.8. Mikroskopisk och fotografisk analys

Progressionen av CNV i alla grupper övervakades regelbundet genom ett spaltlampsmikroskop (Olympus-CX21) med en manuellt fäst artificiell ljuskälla. Fotografierna togs med en digitalkamera (DSC-W70, Sony, Japan) med förstoring ×12, 85 mm objektivavstånd, 100 % zoom och 29 cm fotograferingsavstånd. Fotografierna togs dag 1, 7, 14, 21 och 28 och sparades i datorn för vidare användning.

2.9. Histologiska studier av hornhinnevävnader

På försökets sista dag offrades djuren med cervikal dislokation. Hela ögon extraherades och förvarades i 10 % neutralt formalin. Efter konserveringen togs prover av hornhinnevävnad från hela ögat med hjälp av kirurgiska knivar. Vävnaderna överfördes sedan till perforerade burkar (kapsel) med hjälp av en tång. Vävnaderna sänktes ner i formalin (15 %) och sedan i alkoholisk formaldehydsaltlösning (15 %) i 3 timmar vardera. Vävnaderna torkades sedan med hjälp av stigande grader av alkohol (etanol). Under denna process behandlades vävnaderna med 70 % och 80 % alkohol i 2 timmar vardera och slutligen med 100 % alkohol i 6 timmar. I nästa steg klarades proverna i ren xylen i 6 timmar (3 byten varannan timme i olika burkar). Vävnaderna bäddades sedan in i paraffin med hjälp av en automatisk värmekabin med ett temperaturintervall på 58 ± 5 °C. Vävnaderna doppades i paraffin i 4 timmar (2 timmar i 2 skift och i olika burkar). Därefter togs snitt på 4 μm av hornhinnevävnaden fram med hjälp av en roterande mikrotom (Thermo Fisher Scientific, Tyskland). För korrekt fixering placerades äggalbumindroppar över objektglas och ett enskilt vävnadsavsnitt monterades på det. Därefter placerades objektglasen i 2 timmar i en precisionsmekanisk övertygelseinkubator (diavärmare) (modell 4EM kat. nr 31574). Histologisk hematoxylin & eosin (H&E) färgning utfördes genom olika steg inklusive avvaxning, hydrering, hematoxylinfärgning, avkolorering (eosinfärgning) och uttorkning.

3. Resultat

3.1. Fytokemisk analys av G. glabra

Fytokemisk analys av G. glabra-extraktet utfördes för att ta reda på förekomsten av de viktigaste klasserna av fytokemiska beståndsdelar. Resultaten visade på förekomsten av flavonoider, kolhydrater, protein, saponiner och fenoler enligt tabell 1. Förekomsten av alkaloider, fytosterol och glykosider bekräftades inte i den aktuella undersökningen (tabell 1).

Resultaten som erhållits från de kemiska testerna bekräftades ytterligare genom TLC-analys. Extraktet standardiserades med hänvisning till dess viktigaste kemiska beståndsdel, glycyrrhizin. Resultaten har visats i figur 1. Värdena för retentionsfaktorn (Rf) för extraktets beståndsdelar jämfördes med glycyrrhizin. Som framgår av figur 1 var Rf-värdet för den synliga fläcken A i G. glabra-extraktet 0,43 medan Rf-värdet för B var 0,15. Rf-värdet för glycyrrhizin (synlig fläck C) var också 0,15. På grundval av dessa resultat kan det bekräftas att glycyrrhizin fanns i extraktet som en av de viktigaste föreningarna.

Figur 1

TLC-profil för analys av G. glabra-extrakt och glycyrrhizin med kiselgelbelagda TLC-plattor och n-butanol : ättiksyra : vatten (12 : 3 : 5) som rörlig fas.

HPLC-analys av råextraktet som härstammar från G. glabra och glycyrrhizin utfördes för att få fram de viktigaste topparna för olika kemiska beståndsdelar i extrakten och för att bekräfta närvaron av den viktigaste föreningen (glycyrrhizin). Det resulterande kromatogrammet visade olika toppar vid olika retentionstider för G. glabra-extraktet (se figur 2 b). Kromatogrammet visade också en topp vid en retentionstid på 40 minuter för glycyrrhizin (se figur 2 a). I likhet med glycyrrhizin observerades också en topp i kromatogrammet för extraktet vid samma retentionstid (40 min) som visas i figur 2(a). Resultaten bekräftade förekomsten av glycyrrhizin som huvudkomponent i extraktet av G. glabra.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figur 2

HPLC-kromatogram av a) glycyrrhizin och b) G. glabra-extrakt. HPLC-förhållandena var våglängd (254 nm), rörlig fas (acetonitril : vatten), injektionsvolym (20 μL) och flödeshastighet (1 ml/min).

3.2. CNV-analys av G. glabra-extrakt, glycyrrhizin, fordon och positivt kontrollbehandlade grupper

För att observera effekten av G. glabra-extraktet och glycyrrhizinbehandlingen övervakades CNV-progressionen under mikroskop och genom fotografisk analys under olika behandlingsdagar. Fotografierna som togs under olika behandlingsdagar har visats i figur 3 för extrakt- och vehikelbehandlade grupper. Det observerades under mikroskopet och kan också ses på fotografierna att tjockleken på neovärdet (NV) ökar i den extraktbehandlade gruppen även under den första behandlingsveckan. En snabbare minskning av kärlets tjocklek sågs dock efter den andra veckan (figur 3) och fortsatte fram till experimentets slut. De erhållna resultaten visade att G. glabra-extraktet nästan helt försvann CNV på försökets dag 28 jämfört med kontrollgruppen med vehikel (figur 3). Den dexametasonbehandlade gruppen (positiv kontroll) (figur 3) visade också samma tendens som den behandlade gruppen med G. glabra-extrakt. Det framgick också av den mikroskopiska observationen samt den fotografiska analysen att glycyrrhizin också visade positiva effekter när det gäller att blockera CNV. När ögonen analyserades med hjälp av ett mikroskop med hög effektupplösning kunde man se att blodkärlen gradvis bleknade och återgick till normal form den sista behandlingsdagen (figur 3) med förekomst av endast ett fåtal NV. Dessa resultat visade att anti-CNV-aktiviteten hos glycyrrhizin var något lägre än hos råextraktet.

Figur 3

Representativa fotografier av CNV hos G. glabra-extrakt, glycyrrhizin, vehikel och dexametason (positiv kontroll) behandlade gruppen på dag 0, 7, 14, 21 och 28. Det finns en gradvis minskning av NV:s diameter och tjocklek, och de försvann nästan på försökets sista dag. Den glycyrrhizinbehandlade gruppen uppvisade också en minskning av NV:s diameter och tjocklek, men aktiviteten var mindre än G. glabra-extraktet.

3.3. Histologisk analys av G. glabra och glycyrrhizinbehandlad hornhinna i jämförelse med fordon och positiv kontrollgrupp

Den histologiska analysen utfördes för att känna till förekomsten av inflammation, hornhinnans fiberåterställning och förekomsten av blodkärl. De H&E-färgade representativa mikrofotografierna har visats i figur 4. Histologin från varje djurs vänstra öga betraktades som referensvävnad eftersom inga alkali-brännskador inducerades och de hölls under normala förhållanden. I referenshornhinnan fanns det ingen epitel- och NV-tillväxt samt inga förändringar i morfologin, vilket visas i figur 4. I fordonskontrollgruppen (figur 4) fanns det omfattande blodkärl och kollagenavbrott, vilket visade på utveckling av CNV. Å andra sidan visade histologin på den hornhinna som behandlades med G. glabra-extrakt att hornhinnan nästan har återställts till det normala med blodkärl som nästan minskat och kollagen i normal form. Den histologiska analysen av den glycyrrhizinbehandlade gruppen (figur 4) visade att även om hornhinnan i stort sett har återfått sin normala form finns det vissa indikationer på att skador fortfarande finns kvar. Det fanns vissa tecken på epitelhypertrofi och färre blodkärl observerades också. Dessa resultat visade att glycyrrhizin är effektivt för att hämma CNV men i mindre utsträckning än G. glabra-extrakt. I jämförelse visade de H&E-färgade diabildernas mikrofoto av den dexametasonbehandlade (figur 4) hornhinnan en minskning av epiteltillväxten och blodkärlsbildningen i hornhinnan, men kollagenfibrerna var på något sätt i ett förstört tillstånd och slumpmässigt arrangerade.

Figur 4

Histologisk mikrofotografi av G. glabra-extrakt och glycyrrhizinbehandlad grupp i jämförelse med fordonskontroll och positiv kontroll.

4. Diskussion

CNV är en av de främsta orsakerna till blindhet i världen. Det har uppskattats att cirka 4,14 % av världens befolkning drabbas av denna sjukdom . Den viktigaste molekylära orsaken till CNV är obalansen mellan angiogena och antiangiogena faktorer. Bland dessa faktorer främjar vascular endothelial growth factor (VEGF) den vaskulära endotelcellens utbredning, passage och rörbildning . Det finns alltså en möjlighet att behandla CNV med anti-VEGF-medel, men det går inte att behandla CNV helt och hållet enbart med anti-VEGF-behandling eftersom det också finns ytterligare reglerare av angiogenes . Dessutom är inflammation och angiogenes beroende av varandra och därför kan det hända att anti-VEGF-behandlingen inte lyckas . Tidigare har man observerat att extrakt och föreningar med antitumör- och antiinflammatorisk aktivitet är användbara för att hämma NV och CNV . Råextraktet av G. glabra har visat en antiinflammatorisk effekt medan det vattenhaltiga extraktet av G. glabra har inhiberat angiogenes i in vivo tester . Därför antogs det att G. glabra-extraktet och dess viktigaste kemiska beståndsdel, glycyrrhizin, kan ha förmågan att kontrollera CNV och därför genomfördes den aktuella studien.

Det är viktigt att känna till den kemiska sammansättningen av alla extrakt innan man utvärderar dem med avseende på biologiska aktiviteter. Därför utfördes en fytokemisk analys av G. glabra-extraktet, vilket visade att det innehåller viktiga kemiska beståndsdelar som flavonoider, kolhydrater, protein, saponiner och fenoler. Tidigare studier rapporterade förekomsten av saponiner, flavonoider, alkaloider, terpenoider, tanniner och glykosider, men kolhydrater, proteiner, flobatanniner, fenolföreningar och antrakinoner upptäcktes inte. En annan studie visade att det fanns kolhydrater, fenolföreningar och proteiner tillsammans med andra beståndsdelar i G. glabra-extraktet . Orsakerna till dessa skillnader kan vara säsong och ålder på de insamlade växterna.

TLC och HPLC bekräftade förekomsten av glycyrrhizin i råextraktet. TLC- och HPLC-kromatogrammen av extraktet visade en förening med Rf-värde (0,15) och retentionstid (ca 40 min) som standard glycyrrhizin. Dessa resultat är en liten avvikelse från tidigare observationer där standardglycyrrhizin hade ett Rf-värde på 0,22 . Den främsta orsaken till detta kan vara användningen av olika reagens och förhållanden i den tidigare och den aktuella studien. I den tidigare studien användes kloroform, metanol och vatten som rörlig fas och anisaldehydsvavelsyra som sprutreagens medan i den nuvarande studien användes n-butanol, ättiksyra och destillerat vatten som rörlig fas och cerisulfat som sprutreagens.

Glycyrrhizin, en av de viktigaste komponenterna i G. glabra, har rapporterats ha antiinflammatoriska och anticanceraktiviteter . Resultaten av den aktuella studien visade att G. glabra-extraktet var framgångsrikt när det gällde att hämma CNV eftersom NV nästan minskade efter 21 dagars behandling (figur 3). Eftersom glycyrrhizin är den viktigaste föreningen trodde man att inhiberingen av CNV kunde bero på glycyrrhizin. Anti-CNV-analysen av glycyrrhizin visade vissa positiva effekter på inhiberingen av CNV men kunde inte helt minska blodkärlen i hornhinnan (figur 3). Glycyrrhizin är en triterpenoidglykosid (saponin) med glycyrrhetinsyra. Tidigare har det rapporterats att glycyrrhetinsyra har direkt effekt på mineralokortikoidreceptorer och ger inflammationsliknande effekter , vilket kan vara en av orsakerna till de lägre effekterna av glycyrrhizin. Denna studie tyder på att tillsammans med glycyrrhizin kan vissa andra föreningar vara ansvariga för inhiberingen av CNV i G. glabra-extraktet.

Det var också viktigt att studera effekterna av G. glabra-extraktet och glycyrrhizin på den mikroskopiska anatomin (mikroanatomi) av hornhinnevävnaden. Därför utfördes histologisk analys och dess resultat bekräftade G. glabra-extraktets anti-CNV-effekter. Dessutom fanns det inga tydliga tecken på toxicitet eftersom kollagenfibrerna var arrangerade i en rad i djurens hornhinna som behandlades med G. glabra-extrakt. Den mikroskopiska anatomin hos den G. glabra-extraktbehandlade hornhinnan var mycket lik den hos den normala kontrollen. Å andra sidan fanns det inga tecken på blodkärl i den dexametasonbehandlade hornhinnan (positiv kontroll), men kollagenfibrerna var fortfarande i oordning, vilket visade att dexametason kan ha vissa toxiska effekter på hornhinnan. Även om tidigare studier också rapporterade toxiska effekter av dexametason behövs ytterligare forskning för att bekräfta detta fenomen på mikroanatomisk nivå. Det är också viktigt att nämna att även om glycyrrhizin i stort sett lyckades kontrollera CNV, kunde det inte helt återställa den alkali-skadade hornhinnan och vissa blodkärl observerades också.

5. Slutsatser

Det kan dras en slutsats av resultaten att de oftalmiska dropparna med råextraktet av G. glabra hämmade tillväxten av kärl i hornhinnan, vilket tyder på att det skulle vara effektivt vid behandling av CNV. Dessutom kunde den viktigaste föreningen i G. glabra, glycyrrhizin, inte helt hindra CNV. Detta innebär att någon eller några andra beståndsdelar tillsammans med glycyrrhizin också kan vara ansvariga för extraktets anti-CNV-aktivitet. För detta ändamål krävs ytterligare forskning om bioassaystyrd isolering för att identifiera den eller de huvudkomponenter som är ansvariga för hämmandet av CNV. Vidare kommer molekylära studier också att vara till hjälp för att ta reda på den exakta molekylära mekanismen hos G. glabra-extraktet vid behandling av CNV.

Intressekonflikter

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Författarnas bidrag

Syed Luqman Shah och alla andra författare har bidragit i lika hög grad till detta arbete. Det slutliga dokumentet är godkänt av alla författare.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Christie Ronge, Department of Pharmacy, Froedtert & the Medical College of Wisconsin, 9200 West Wisconsin Avenue, Milwaukee, WI, för hennes hjälp med språkliga/grammatiska korrigeringar.