FPLC (snabbproteinkromatografi) och HPLC (högpresterande vätskekromatografi): två vätskekromatografiska metoder i direkt jämförelse. I denna artikel diskuteras skillnaderna mellan de två teknikerna med särskild tonvikt på kraven för deras respektive analyter.
Namnen fast protein liquid chromatography (FPLC) och high performance liquid chromatography (HPLC) ger en fingervisning om skillnaderna mellan dessa kromatografiska metoder. Medan HPLC arbetar med högt tryck för att analysera små kemiska föreningar renar FPLC stora biomolekyler som proteiner eller DNA. Kromatografi av biomolekyler är mycket krävande och känslig eftersom de inte tål höga temperaturer, höga tryck eller de lösningsmedel som vanligtvis används vid HPLC. Av dessa skäl kräver separationen av biomolekyler ett alternativt tillvägagångssätt till HPLC.
Flera termer används vanligen för snabb vätskekromatografi för proteiner, t.ex. biokromatografi, bioseparation eller biopurifiering. Denna speciella form av kromatografi används för att rena stora biomolekyler på flera kilodalton (kDa) såsom proteiner, nukleotider eller peptider (figur 1). Målet för FPLC-användaren är att få så mycket ren och nativ produkt som möjligt. Målen för klassisk HPLC, å andra sidan, är att identifiera och kvalificera analyter, vanligen små föreningar som varierar i storlek från några atomer upp till cirka 3 000 Da.
Utmaningen att få fram ett rent protein från ett celextrakt
Typiskt renas biomolekyler från bakterie- eller eukaryota celler, som är fullpackade med proteiner, DNA, RNA och cellmembran. Därför kan det vara en stor utmaning att rena det intressanta proteinet ur ett celextrakt. Biokemister tillämpar flera knep: ett är att använda rekombinanta proteiner, som överuttrycks av cellerna. Övexpression av det aktuella proteinet gör det möjligt att rena det i större mängder. Det andra knepet är att lägga till en tagg till det aktuella proteinet, som specifikt känns igen av hartset (kolonnmaterialet). Proteiner utan tagg binder inte till kolonnen och elueras omedelbart, medan det önskade proteinet anrikas och lätt kan separeras.
Biomolekyler renas från celllysat, vilket innebär mycket större provvolymer än vid analytisk HPLC. Därför används större provslingor eller till och med pumpar med högre flödeshastigheter för att injicera provet. Dessutom skiljer sig FPLC- och HPLC-kolonnmaterialen fullständigt åt. För HPLC används kiseldioxidpärlor med mycket små partikelstorlekar och med stor motståndskraft mot höga tryck, medan FPLC kräver agaros eller polymermaterial med större partikelstorlekar för de flesta metoder. De hartser som används för FPLC är inte lika tryckstabila som kiseldioxidpärlor och är mycket känsliga för luftbubblor. Dessutom skiljer sig inte bara kolonnmaterialet utan även kolonnens hårdvara åt. I klassisk HPLC används tryckbeständiga kolonner av rostfritt stål. Som redan nämnts är tryckstabilitet inte viktigt för FPLC och därför är det möjligt att arbeta med genomskinliga och biokompatibla glaskolonner. Detta är en stor fördel eftersom användaren kan kontrollera kolonnens luftbubblor eller övervaka materialets skick under en reningskörning.
Diverse Biomolecules, Diverse Purification Methods
Underskotten i kolonnmaterialet återspeglas också i metoderna. Vid analytisk HPLC är omvänd fas-kromatografi med hydrofoba stationära faser och polära rörliga faser den metod som väljs, medan man vid FPLC tillämpar ett större antal olika metoder (figur 2). En FPLC-metod är storleksexklusionskromatografi (SEC) där molekylerna separeras utifrån sin storlek. Mindre molekyler kan diffundera in i pärlornas porer, medan större molekyler passerar genom kolonnen nästan obehindrat. De mindre molekylerna elueras senare från kolonnen och skapar en gradient av dessa molekyler beroende på deras storlek. En annan separationsmetod är jonbyteskromatografi. Biomolekyler separeras och renas i enlighet med sin specifika laddning, som beror på buffertens pH-värde. Ju mer laddat proteinet är, desto bättre kommer det att binda till det motsatt laddade hartset. För att eluera proteinet från kolonnen ökas koncentrationen av saltjoner under körningen. Saltjonerna konkurrerar med proteinet om att binda till hartset. En annan viktig FPLC-metod är affinitetskromatografi där den intressanta molekylen kan binda specifikt till kolonnen medan de andra molekylerna inte kan det och kommer att eluera utan att binda. Här används kolonner med speciella medier som känner igen den önskade biomolekylen. En särskild form av affinitetskromatografi är immobiliserad metalljonaffinitet (IMAC). Det önskade proteinet måste förändras genetiskt genom att lägga till en tagg till proteinet, som vanligtvis består av sex histidiner. IMAC-hartset känner specifikt igen denna ”Hisâtag”. Elueringen sker genom att öka koncentrationen av imidazol som konkurrerar med de His-taggade proteinerna. Dessutom kan proteiner också separeras genom deras specifika hydrofobicitet med hjälp av metoden för separation genom hydrofobisk interaktion. Hartset är sammansatt på ett sådant sätt att de mest hydrofoba proteinerna binder starkast till kolonnen och elueras genom att minska saltgradienten.
För att rena ett önskat protein används vanligtvis en kombination av metoder. I det första steget, det så kallade ”fångststeget”, renas proteinet från råextraktet. Vanligtvis används affinitetskromatografi för detta första reningssteg. I det andra steget, det s.k. intermediära steget, avlägsnas ytterligare föroreningar genom jonbyteskromatografi eller hydrofobisk interaktion. Syftet med det sista ”poleringssteget” – vanligtvis ett steg med storleksexklusionskromatografi – är att bli av med alla återstående föroreningar för att få en produkt med hög renhet. Denna proteinreningsstrategi beror helt och hållet på den specifika biomolekylen. I vissa fall kan en rening i två steg vara tillräcklig. Ju fler metoder som kombineras, desto mer av det intressanta proteinet går förlorat under reningen, men en högre renhet kan uppnås.
Efter reningen kan det uppnådda provet analyseras med avseende på renhet, koncentration och enzymfunktion eller enzymaktivitet med hjälp av HPLC, natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), enzymaktivitetsanalyser eller masspektrometri.
FPLC-krav
Proteiner är uppbyggda av aminosyror som står uppradade som en kedja. Denna kedja viks till en tredimensionell struktur, vilket är nyckeln till varje proteins funktion och aktivitet. Därför är det mycket viktigt att bibehålla denna proteinstruktur under reningsprocessen. Externa faktorer som hög temperatur, högt tryck, extremt pH eller lösningsmedel kan störa proteinstrukturen och undviks därför i FPLC. Arbetstemperaturen för proteiner är vanligtvis 4 °C. Därför placeras en FPLC-maskin ofta i en kylkammare eller ett kylrum där den inte bara utsätts för låg temperatur utan också för kondenserande fuktighet. Komponenterna i ett FPLC-system måste vara särskilt utformade för dessa förhållanden. Dessutom står FPLC-komponenterna inför ytterligare en utmaning, nämligen saltbuffertlösningar som används som eluenter. Isosmotiska pH-värden och saltkoncentrationer som liknar cellmiljön väljs vanligtvis. Kromatografisystem är i allmänhet tillverkade av rostfritt stål. Å ena sidan kan saltet i buffertarna leda till korrosion och å andra sidan kan metalljonerna från det rostfria stålet interferera med proteinet och störa dess struktur. Därför är det viktigt att undvika rostfritt stål och använda biokompatibla material som polyeteretereterketon (PEEK), keramik eller titan när man utför FPLC. Liksom HPLC-system styrs även FPLC-system av programvara. Det finns betydande skillnader mellan FPLC- och HPLC-programvara. Den senare används främst för att analysera proverna och innehåller många analysverktyg. I FPLC behövs dock inte många analysverktyg och det är vanligt att generera metoder baserade på volym eller till och med kolonnvolym (figur 3). För de flesta FPLC-tillämpningar är kolonnvolymbaserade metoder att föredra, vilket underlättar uppskalning. FPLC-programvara är oftast mycket intuitiv och användarvänlig och omfattar direktkontroll, vilket gör det möjligt att justera parametrarna under en körning. Användaren kan därmed reagera mycket spontant på olika situationer.
Det är därför uppenbart att det finns stora skillnader mellan dessa två kromatografiska områden (tabell 1). Metoder, hårdvara och programvara skiljer sig mycket åt beroende på om molekylen ska analyseras eller renas. För FPLC-tillämpningar bidrar provets känsliga natur och ambitionen att hålla dem så nativa som möjligt till utmaningen. På det hela taget är båda teknikerna mycket intressanta områden som alla som arbetar inom området bör känna till.
Stephanie Runde tog examen i biokemi vid Tekniska universitetet i München, Tyskland. Hon disputerade vid Freie Universität Berlin, Tyskland, och arbetar för närvarande på Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH som produktchef för FPLC.