Är formamid en trolig prebiotisk prekursor?

Närvaron av de kemikalier som spelade rollen som prebiotiska prekursorer på den primitiva jorden är fortfarande ett omdiskuterat argument. I ett allmänt tillvägagångssätt för att lösa problemet bör man ta hänsyn till följande fysikaliska och kemiska egenskaper hos de enkla organiska föreningarna i fråga. Nämligen: (I) den relativa rikedomen av de biogena utgångsmaterialen, som ska anses vara en förutsättning för att de genetiska processerna ska ha börjat tidigt på denna planet, ii) deras stabilitet, iii) deras förmåga att reagera för att ge mer komplexa strukturer som följer reproducerbara vägar. Bildandet av prekursorer baserat på enkla kemiska processer och den kvasi-simultana närvaron av alla byggstenar som ska användas för att sätta ihop informationsmolekyler är andra viktiga förutsättningar.

(i) Tillgänglighet

Formamid (H2NCOH) uppfyller de nödvändiga kriterierna för abundans och spridning i universum. Analysen av den molekylära sammansättningen av kometer-asteroider och interstellära moln visar att de föreningar som består av de fyra vanligaste och biologiskt relevanta grundämnena H, O, C och N (utom He) är isocyanat HNCO och formamid H2NCOH . Formamid har upptäckts i gasfasen i det interstellära mediet , i den långperiodiska kometen Hale-Bopp och preliminärt i den fasta fasen av korn runt det unga stjärnobjektet W33A . Möjlig produktion av formamid under Europa-liknande förhållanden observerades (Hand, K.; Carlson, R. W., Department of Geological & Environmental Sciences, Stanford University; personlig kommunikation, juli 2006).

(ii) Stabilitet

Formamid uppfyller de nödvändiga kriterierna för stabilitet. Detta ämne måste beaktas i samband med kemin för vätecyanid (HCN). Sedan Oròs avgörande experiment om syntesen av adenin från HCN har många studier ägnats åt att bedöma vilken roll denna förening spelar för ursprunget till de ursprungliga nukleinsyrorna . Två problem är dock fortfarande olösta när det gäller HCN-kemins prebiotiska relevans: (i) HCN:s termodynamiska instabilitet under hydrolytiska förhållanden, (ii) den smala panelen av nukleobaser, begränsad endast till puriner som kan bildas genom dess kondensationsprocess. Mot bakgrund av den sistnämnda iakttagelsen föreslogs en helt purinbaserad föregångare till nukleinsyror, där de pyrimidiner som finns i befintliga nukleinsyror skulle vara postenzymatiska substitut för deras isoelektroniska och isogeometriska puriner . HCN är en gas under ett stort antal miljöförhållanden. HCN-kemi i homogen lösning (det i stort sett accepterade kemiska prebiotiska scenariot på den primitiva jorden) kräver därför först och främst absorption i vatten. Efter adsorptionsprocessen konkurrerar polymerisering och hydrolys av HCN, och resultaten bestäms av dess koncentration. De två reaktionerna är likvärdiga vid koncentrationer av HCN mellan 0,01 och 0,1 M (mellan pH 8 och 9). Hydrolys till formamid (figur 1, ekvation A) dominerar i utspädda lösningar medan polymerisationen tar över vid högre koncentrationer . Den stabila koncentrationen av HCN i det primitiva havet beräknades, på grundval av de uppskattade hastigheterna för dess produktion och hydrolys, till att vid pH7 vara 4 × 10-12 M vid 100 °C och 2 × 10-5 M vid 0 °C. Dessa koncentrationer är alldeles för låga för att polymerisering till nukleobaser ska kunna ske, vilket gynnar hydrolys till formamid .

Då HCN är mer flyktigt än vatten kan det inte koncentreras genom enkel avdunstning vid pH lägre än dess pKa (9,2 vid 25 °C). Detta föreslog eutektisk frysning som ett sätt för HCN att nå tillräcklig koncentration för polymerisering .

I samma studie uppskattades också hydrolyshastigheten (och steady state-koncentrationen) för formamid till ammoniumformiat (figur 1, ekvation B) till 2 × 10-18, 1 × 10-15 och 1 × 10-9 M, vid 200, 100 respektive 0°C, med antagandet att formamid i det primitiva havet bildades endast genom hydrolys av HCN.

Med utgångspunkt i dessa uppgifter föreslår författarna att ”det är osannolikt att formamid kan ha spelat en betydande roll i den prebiotiska kemin”, en ganska definitiv mening för denna förening!

Detta antagande tar dock inte hänsyn till att (i) formamid kan bildas från prebiotiska föreningar som till stor del diffunderade på den primitiva jorden, förutom HCN, och (ii) att formamid är flytande under ett brett spektrum av temperatur- och tryckvärden, med en kokpunkt på 210°C och mycket begränsade azeotropa effekter . Till skillnad från HCN kan alltså formamid i en modell med en torklagun lätt koncentreras, vilket ökar dess stabilitet vid koncentration och ger tillräcklig koncentration för att polymerisering till nukleobaser skall kunna ske. Hydrolysen av formamid i vatten undersöktes på nytt genom att studera den kinetiska isotopeffekten av deuterium i lösningsmedlet. Denna analys gav ett värde för konstanten khyd på 1,1 × 10-10 s-1, vilket motsvarar en t1/2 på ca 200 år vid 25°C och pH 7,0 .

(iii) Reaktivitet

Som en organisk förening som kan generera ”in situ” många andra enkla kemikalier som är användbara för syntesen av nukleobaser, kan formamid betraktas som en multifunktionell prebiotisk prekursor. Förhållandet mellan de bildade prekursorerna beror på de specifika miljöförhållandena.

Vid 190-210 °C under atmosfäriskt tryck sönderdelas formamid termiskt antingen till ammoniak (NH3) och kolmonoxid (CO) (figur 1, ekvation C) eller till HCN och vatten (figur 1, ekvation D). Bildningen av HCN gynnas vanligen i närvaro av lämpliga katalysatorer, dvs. med aluminiumoxider är utbytet vid temperaturer mellan 400°C och 600°C >90%, medan reaktionen som bildar NH3 och CO dominerar i avsaknad av katalysatorer. Ytterligare nedbrytningsprodukter upptäcks också. Dessa inkluderar polymera vätecyanidderivat som kan producera nukleobaser under hydrolytiska förhållanden. På grund av sin höga dielektriska konstant är formamid dessutom ett utmärkt lösningsmedel för både metalloxider och oorganiska salter, som kan fungera som katalysatorer under kondensationsprocesserna till nukleobaser.

Sålunda kan sammansättningen av en reaktionsblandning baserad på formamid som huvudkomponent anpassas genom sammansättningen av den miljörelaterade reaktorn som, med undantag av HCN, tillhandahåller alla prebiotiska prekursorer som är nödvändiga för syntesen av både purin- och pyrimidinnukleobaser. Sammansättningen av panelen av de dominerande produkterna beror på de specifika fysikaliska och kemiska egenskaperna hos de katalysatorer som finns i reaktionsmediet, vilket beskrivs närmare nedan.

Syntesen av nukleinprekursorer från formamid

Nukleinbaser, en aminosyra och ett kondensationsmedel

Nukleinbaser

Vi har observerat att formamid har den unika egenskapen att kondenseras till både purin- och pyrimidin-nukleobaser helt enkelt vid upphettning vid 110-160°C i närvaro av till stor del diffunderade metalloxider och mineraler . De erhållna produkterna är förtecknade i tabell 1, korsade med de testade katalysatorerna och grupperade som en funktion av (ungefärlig) ökande komplexitet. Purin är den enda förening som erhålls genom upphettning av formamid i avsaknad av katalysatorer. De mest relevanta aspekterna av denna stora ensemble av produkter är:

– panelen av föreningar som erhålls i närvaro av varje katalysator är ”ren”. Endast ett fåtal produkter observeras, och i vissa fall är syntesen mycket specifik, t.ex. när det gäller fosfatmineralet pyromorfit som enbart ger cytosin eller när det gäller childrenit som nästan enbart ger N-formylglycin. I andra fall erhålls rikare produktpaneler, som med pyrofosfat Na4P2O7 som ger (förutom purin) adenin, hypoxantin (en bioisoster av guanin), uracil, cytosin, N-formylglycin och karbodiimid; och med TiO2 som ger (förutom purin) adenin, N9-formylpurin, N9-N6-diformyladenin, cytosin, tymin och 5-hydroximetyluracil.

– Det är ganska intressant att TiO2 också katalyserar syntesen av purinacyklonukleosider (inte rapporterat i tabell 1, se Ref 23). Denna observation är av särskild prebiotisk relevans på grund av den kända svårigheten att under prebiotiska förhållanden bygga upp β-glykosidbindningen mellan separat syntetiserade nukleobaser och sockerarter . Även när det gäller blandningar med relativt högre komplexitet behåller produktprofilerna sin karaktär av renhet och innehåller vanligtvis inte nedbrytningsprodukter eller ytterligare klasser av föreningar.

Glycin och karbodiimid

Det α-aminosyraderivatet N-formylglycin påvisades i formamidbaserade synteser som katalyseras av fosfatmineraler och som ofta åtföljs av karbodiimid . Syntesen av karbodiimid, som är ett viktigt medel för kondensation av aminosyror till peptider, skulle kunna vara ansvarig för bildandet av formylglycin från in situ genererat glycin , vilket tyder på en roll för formamid-fosfat-systemet i den prebiotiska syntesen av peptider.

Intermediater av de syntetiska vägarna för komponenter av existerande nukleinsyror observeras också, dvs, 4-aminoimidazol-5-karboxamid (AICA), 4-formylaminoimidazol-5-karboxamid (f-AICA) och 5-hydroximetyluracil.

De kemiska mekanismer som alla dessa synteser bygger på beskrivs och diskuteras kritiskt i .

Kemomimesis-konceptet som selektor för prebiotiska prekursorer

Som nämnts ovan är identiteten på de första prebiotiska prekursorerna till nukleinsyror fortfarande föremål för debatt. Å andra sidan avslöjar analysen av reaktionsmekanismen för enkla organiska molekyler fall där viktiga intermediärer också produceras som motsvarar dem som observerats i existerande biologiska vägar. Begreppet kemomimesis är tillämpligt på dessa överensstämmelser. Denna term, som först introducerades av Eschenmoser och Loewenthal 1992, hänvisar i allmänhet till en kemisk reaktionsväg som kan användas som mall för de enzymatiska processer som kommer att dyka upp senare i evolutionen och som ger samma slutprodukter. Denna egenskap kan i princip skilja mellan två klasser av prebiotiska prekursorer: de prekursorer som kan generera en kemomimetisk process och de som inte kan göra det. Formamidkemin visar intressanta fall av kemomimesis.

Som exempel kan nämnas 5-aminoimidazol-4-karboxamid (AICA) och 5-formamido-imidazol-4-karboxamid (f-AICA), som erhålls med hög avkastning utöver hypoxantin vid upphettning av formamid i närvaro av montmorilloniter (tabell 1), är också viktiga intermediärer (som ribonukleotid-5′-monofosfater) i de sista stegen i den existerande biosyntesen av inosin-5′-monofosfat (IMP), den viktigaste vägen till purinnukleotider i cellen (figur 2).

På samma sätt är tillsatsen av formaldehyd till en förformad uracilställning under syntesen av tymin från formamid och TiO2 ett nyckelsteg för introduktionen av metyldelen, vilket stämmer överens med den existerande biosyntesen av tymidin. I denna reaktion läggs en formaldehydenhet till uridin, maskerad som den aktiverade metylenenheten av metylentetrahydrofolat (MTHF) för att ge 5-hydroximetyluracil-5′-monofosfat (HMU-5′-monofosfat). Thymidin erhålls genom successiva hydridförskjutningsomläggningar.

Möjligheten att tidiga kemiska händelser spelade en roll som mallar för utvecklingen av mer komplexa (men också mer effektiva och selektiva) enzymatiska vägar är ett fascinerande koncept som bör utvärderas ytterligare i studiet av den molekylära evolutionen av informationspolymerer.

Problem vid prebiotisk polymerisering

Aktiverade prekursorer

Evolutionen av genetisk information baserad på linjära polymerer förutsätter en mallmedierad replikationsmekanism. Genom mallbaserad reproduktion kan den ackumulerade informationen bibehållas och ibland modifieras, och på så sätt upprättas kemiskt baserade evolutionära regler. Icke-enzymatiska självreplikerande system baserade på schablonstyrd syntes av oligonukleotider har rapporterats (bl.a. de som rapporterats i , granskats i ), vilket ger ett principiellt bevis för att denna allmänna mekanism är rimlig. De första pregenetiska polymererna bestod inte nödvändigtvis av de sockerdelar som utgör dagens nukleinsyror, och nukleosiderna var inte heller tvångsmässigt sammankopplade med de fosforesterlänkar som vi upplever i dag. Omfattande analyser av de möjliga alternativen rapporterades . I avsaknad av direkta bevis eller solida indikationer på motsatsen kan man dock lugnt anta att den genetiska evolutionen uppstod på grundval av RNA-liknande polymerer, att ribose- och fosfodiesterbindningar var de faktiska komponenterna vars egenskaper möjliggjorde och satte igång evolutionen, att de molekylära hästarna inte ändrades under loppet. Skälen som talar för fosfat som förbindelseled är väl etablerade .

Ett generellt problem härrör från det faktum att bildandet av en fosfodiesterbindning är termodynamiskt uppförsbacke. Således krävde den mallstyrda proteinfria prebiotiska syntesen av fosfodiesterlänkade oligonukleotider troligen användning av kemiskt aktiverade nukleotider.

Formamidkatalyserad fosforylering av nukleosider

Den prebiotiska relevansen av de mekanismer som föreslagits för framställning av aktiverade nukleosider är tveksam . Den annars viktiga observationen att torkning av den kemiskt aktiverade nukleosiden 5′-fosforimidazolid-adenosin (ImpA) på ytan av en montmorillonitlera, där en förabsorberad dekanukleotid kunde förlängas med upp till 30 ytterligare nukleotider, och liknande resultat i jämförbara system i , lider av samma begränsning. Det rörde sig alltså troligen om en effektiv och robust katalytisk mekanism för aktivering (eventuellt fosforylering) av nukleosider. Vi har observerat att fosforylering av nukleosider lätt sker i närvaro av formamid och en fosfatgivare. Donatorn kan vara en löslig mono-, di- eller trifosfat, eller en annan fosforylerad nukleosid, eller ett av flera kristallina fosfatmineraler, bland annat hydroxylapatit, libethenit och pseudomalachit (uppgifter inte detaljerade, har lämnats in för publicering på annat håll). Fosforylering skedde på 5′-, 3′- eller 2′-c-atomerna i ribosesdelen och 2′:3′- och 3′:5′-cykliska fosfoesterformer observerades också. Baserat på den banbrytande observationen av Orgel att dinukleosiddifosfater bildades från cykliskt adenosin 2′:3′-fosfat, är detta cykliska fosfat-ribonukleotidsystem möjligen av särskild prebiotisk relevans.

Vattenhaltigt kontra icke-vattenhaltigt

Den kemiskt sett relativt enkla bildningen av linjära polymerer från aktiverade prekursorer löser inte problemet med deras ursprung. Problemet med standardtillståndets förändring av Gibbs fria energi (ΔG°’), som kritiskt utvärderats av van Holde , och den inneboende instabiliteten hos polymerer i lösning begränsar bildandet och överlevnaden av polymerer i vattenmiljöer. ΔG°’-problemet är det största hindret för polymeriseringar i flytande fas under prebiotiska förhållanden.

Fosforyleringen av nukleosider på mineralytor som nämns ovan erhölls i närvaro av formamid. Sålunda kan aktiverade nukleismonomerer bildas i en flytande icke vattenhaltig miljö under förhållanden som är kompatibla med polymerisationens termodynamik, vilket ger en fungerande lösning. Om formamid ger aktiverade prekursorer genom fosforylering av nukleosider och tillåter deras polymerisering genom en enkel transfosforyleringsreaktion (en fortfarande hypotetisk men kemiskt rimlig process), skulle den begränsande faktorn för utvecklingen av förgenetiska molekyler bli stabiliteten hos de resulterande polymeriserade formerna. Med andra ord är de fysikalisk-kemiska parametrar som gynnar eller tillåter överlevnad av det mycket polymera tillståndet av största betydelse när man överväger de förhållanden under vilka förgenetiska polymerer spontant skulle kunna polymeriseras, replikera och utvecklas. Därför är det intressant att definiera de inledande termodynamiska nischer där det polymera tillståndet kan ha gynnats framför det monomera tillståndet.

Dessa nischer identifierades för både deoxyribo- och ribo-systemen, vilket visar att definierade kombinationer av temperatur och lösningsmedel gynnar det polymera tillståndet. Dessa nischer är anmärkningsvärt bredare för RNA än för DNA (jfr data i kontra ).

Inom ramen för hypotesen om ”RNA-världen” visar detta fynd att utöver de tre viktiga egenskaperna hos RNA bör även egenskapen gynnad persistens beaktas. Denna fjärde egenskap består av en ensemble av termodynamiska och kinetiska parametrar som hänför sig till polymeriseringsprocessen och polymerernas stabilitet. De förhållanden som gynnar oligomerisk persistens skulle potentiellt kunna ge information om den miljö i vilken de urgenetiska molekylerna uppstod och överlevde.

Stabilitet som kritisk fenotyp för evolutionen av informationspolymerer

Vid rekonstruktionen av övergången från monomerer till de informationsbärande polymerer som vi känner till i dagsläget och vid en sammanfattning av de uppgifter som rapporterats ovan har vi observerat att formamid 1) kondenserar till alla nukleinbaser som är nödvändiga för att bilda dagens nukleinsyror. Denna process kräver endast måttlig temperatur (110-160 °C) och lätt tillgängliga katalysatorer. 2) Flera föreningar bildas som omsluter en dold β-glykosidbindning, vilket potentiellt löser den kemiska rebus som uppstår genom nukleinbasernas icke-reaktivitet med sockerarter. 3) Formamidbaserad fosforylering av förbildade nukleosider observerades (data inlämnade på annat håll), vilket ger en plausibel lösning på problemet med den kemiskt robusta mekanism som behövs för en icke-fastidiös produktion med hög avkastning av aktiverade prekursorer. Polymerbildningen kan antas ske genom en formamiddriven mallstyrd transfosforyleringsprocess. Den lämpliga mallen kan utgöras av en mineralyta eller av nukleiska polymerer. Dessa processer ger en enkel kemisk ram inom vilken alla steg från föreningen H2NCOH med en kolatom till aktiverade nukleotider har beskrivits. Alla dessa reaktioner kräver formamid som byggmaterial och/eller som katalysator.

Däremot lever existerande organismer i vatten, inte i formamid. Och strukturen och egenskaperna hos nukleinsyror tyder starkt på att interaktion med vatten är en av deras mest intima egenskaper. I vilket skede kan övergången från en formamidmiljö till vatten ha skett?

I detta skede befinner vi oss på hypotetiska grunder. Låt oss utgå från en modell där syntesen av en ribo-oligonukleotid har skett genom att för-syntetiserade nukleosider ], fosforylerade genom formamid-katalyserad fosforylering och sammanfogade genom formamid-katalyserad transfosforylering, har kopplats samman (hypotetiskt). Fosfodiesterbryggor mellan nukleosider kan ha uppstått mellan monomerer som är bundna som enskilda enheter på fosfatmineralytor som ger både en källa för fosfatdelar och en korrekt rumslig ordning. P-P-avståndet i en utsträckt nukleinsyra är väletablerade 9,15 Å, vilket stämmer väl överens med kristallcelldimensionerna hos fosfatmineraler vars a- och b-värden i ett stort antal olika mineraler ligger mellan 6 och 10 Å (första generationens stadium). Alternativt, eller i ett senare skede, skulle fosfodiesterbryggor ha bildats mellan aktiverade monomerer som är bundna som enskilda enheter på nukleinsyramallen (andra generationens skede). Båda stadierna kräver formamid som drivande kemikalie för bildandet av fosfatbryggor.