FRAP kan också användas för att övervaka proteiner utanför membranet. Efter det att det aktuella proteinet har gjorts fluorescerande, i allmänhet genom uttryck som ett GFP-fusionsprotein, används ett konfokalmikroskop för att fotoblicka och övervaka en region av cytoplasman, mitotisk spindel, kärnan eller en annan cellstruktur. Den genomsnittliga fluorescensen i området kan sedan plottas mot tiden sedan fotoblekningen, och den resulterande kurvan kan ge kinetiska koefficienter, t.ex. för proteinets bindningsreaktioner och/eller proteinets diffusionskoefficient i det medium där det övervakas. Ofta är den enda dynamik som beaktas diffusion och bindnings-/avbindningsinteraktioner, men i princip kan proteiner också förflytta sig via flöde, dvs, Detta kunde bero på flöde av cytoplasma eller nukleoplasma, eller transport längs filament i cellen, t.ex. mikrotubuli, med hjälp av molekylära motorer.

Analysen är enklast när fluorescensåterhämtningen begränsas antingen av spridningshastigheten till det blekta området eller av hastigheten med vilken blekta proteiner lossas från sina bindningsställen inom det blekta området och ersätts av fluorescerande protein. Låt oss titta på dessa två begränsningar för det vanliga fallet med blekning av ett GFP-fusionsprotein i en levande cell.

Diffusionsbegränsad fluorescensåterhämtningRedigera

För en cirkulär blekningsfläck med radie w {\displaystyle w}

och diffusionsdominerad återhämtning, beskrivs fluorescensen av en ekvation som härletts av Soumpasis (som involverar modifierade Bessel-funktioner I 0 {\displaystyle I_{0}}

och I 1 {\displaystyle I_{1}}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) {\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}\left(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\right)}

med τ D {\displaystyle \tau _{D}}

den karakteristiska tidsskalan för diffusion, och t {\displaystyle t}

är tiden. f ( t ) {\displaystyle f(t)}

är den normaliserade fluorescensen (går till 1 när t {\displaystyle t}

går mot oändligheten). Diffusionstidskalan för en blekt fläck med radie w {\displaystyle w}

är τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, där D är diffusionskoefficienten.

Observera att detta gäller en omedelbar blekning med en stegfunktionsprofil, dvs. att fraktionen f b {\displaystyle f_{b}}

av protein som antas blekas omedelbart vid tiden t = 0 {\displaystyle t=0}

är f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, och f b ( r ) = 0 , r > w {\displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, för r {\displaystyle r}

är avståndet från centrum av det blekta området. Det antas också att återhämtningen kan modelleras genom diffusion i två dimensioner, som också är både enhetlig och isotropisk. Med andra ord, att diffusion sker i ett enhetligt medium så att den effektiva diffusionskonstanten D är densamma överallt, och att diffusionen är isotropisk, dvs. sker med samma hastighet längs alla axlar i planet.

I praktiken kommer inget av dessa antaganden att vara strikt sant i en cell.

1. Blekning kommer inte att ske omedelbart. Särskilt om det krävs en kraftig blekning av ett stort område kan blekningen ta en betydande del av diffusionens tidsskala τ D {\displaystyle \tau _{D}}.
   

   . Då kommer en betydande del av det blekta proteinet att diffundera ut ur det blekta området faktiskt under blekningen. Om man inte tar hänsyn till detta kommer ett betydande fel att införas i D.

2. Den blekta profilen kommer inte att vara en radiell stegfunktion. Om den blekta fläcken i praktiken är en enda pixel kommer blekningen som funktion av positionen vanligtvis att vara diffraktionsbegränsad och bestämmas av optiken hos det konfokala laserskanningsmikroskopet som används. Detta är inte en radiell stegfunktion och varierar också längs axeln vinkelrätt mot planet.
3. Celler är naturligtvis tredimensionella och inte tvådimensionella, liksom den blekta volymen. Att försumma diffusion utanför planet (vi antar att detta är xy-planet) kommer att vara en rimlig approximation endast om fluorescensen återhämtar sig huvudsakligen via diffusion i detta plan. Detta gäller t.ex. om en cylindrisk volym bleks med cylinderns axel längs z-axeln och med denna cylindriska volym som går genom hela cellens höjd. Diffusion längs z-axeln orsakar då inte fluorescensåterhämtning eftersom allt protein bleks enhetligt längs z-axeln, och det är därför ofarligt att försumma den, vilket Soumpasis ekvation gör. Men om diffusion längs z-axeln bidrar till fluorescensåterhämtning måste den beaktas.
4. Det finns ingen anledning att förvänta sig att cellens cytoplasma eller nukleoplasma ska vara helt rumsligt enhetliga eller isotropa.

Så är Soumpassekvationen bara en användbar approximation, som kan användas när de antaganden som anges ovan är goda approximationer av den verkliga situationen, och när återhämtningen av fluorescens verkligen begränsas av tidsskalan för diffusion τ D {\displaystyle \tau _{D}}

. Observera att bara för att Soumpasis kan anpassas adekvat till data innebär det inte nödvändigtvis att antagandena är sanna och att diffusion dominerar återhämtningen.

Reaktionsbegränsad återhämtningRedigera

Ekvationen som beskriver fluorescensen som en funktion av tiden är särskilt enkel i en annan gräns. Om ett stort antal proteiner binder till platser i en liten volym så att fluorescenssignalen där domineras av signalen från bundna proteiner, och om denna bindning sker i ett enda tillstånd med en avstängningshastighet koff, så ges fluorescensen som funktion av tiden av

f ( t ) = 1 – e – k off t {\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{\text{off}}t}}.

Bemärk att återhämtningen endast beror på hastighetskonstanten för avbindning, koff. Den beror inte på on-hastigheten för bindning. Även om det beror på ett antal antaganden

1. Den på-hastigheten måste vara tillräckligt stor för att den lokala koncentrationen av bundet protein ska vara mycket större än den lokala koncentrationen av fritt protein, och på så sätt tillåta oss att försumma bidraget till f från det fria proteinet.
2. Reaktionen är en enkel bimolekylär reaktion, där proteinet binder till lokaliserade platser som inte rör sig nämnvärt under återhämtningen
3. Utbytet är mycket långsammare än diffusion (eller vilken transportmekanism som helst som ansvarar för rörligheten), eftersom det är först då som den diffuserande fraktionen återhämtar sig snabbt och då agerar som källa för fluorescerande protein som binder och ersätter det bundna blekta proteinet och på så sätt ökar fluorescensen. Med r radien för den blekta fläcken innebär detta att ekvationen endast är giltig om den bundna livslängden 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{\text{off}}>>r^{2}/D}
   

   .

Om alla dessa antaganden är uppfyllda får man genom att anpassa en exponential till återhämtningskurvan en konstant för avgångshastigheten, koff. Andra dynamiker kan dock ge återhämtningskurvor som liknar exponentialer, så att anpassa en exponential innebär inte nödvändigtvis att återhämtningen domineras av en enkel bimolekylär reaktion. Ett sätt att skilja mellan återhämtning med en hastighet som bestäms av avbindning och återhämtning som begränsas av diffusion är att notera att återhämtningshastigheten för avbindningsbegränsad återhämtning är oberoende av storleken på det blekta området r, medan den skalar som r – 2 {\displaystyle r^{-2}}

, för diffusionsbegränsad återhämtning. Om ett litet och ett stort område bleks, kommer återhämtningen att vara densamma för de två storlekarna av det blekta området om återhämtningen begränsas av avbindning, medan den kommer att vara mycket långsammare för det större blekta området om återhämtningen begränsas av diffusion.

Diffusion och reaktionRedigera

I allmänhet kommer återhämtningen av fluorescens inte att domineras av vare sig enkel isotropisk diffusion eller av en enda enkel avbindningshastighet. Det kommer att förekomma både diffusion och bindning, och det är faktiskt så att diffusionskonstanten kanske inte är enhetlig i rummet, och det kan finnas mer än en typ av bindningsställen, och dessa ställen kan också ha en ojämn fördelning i rummet. Flödesprocesser kan också vara viktiga. Detta mer komplexa beteende innebär att det krävs en modell med flera parametrar för att beskriva data; modeller med endast antingen en enda diffusionskonstant D eller en enda avgångshastighetskonstant, koff, är otillräckliga.

Det finns modeller med både diffusion och reaktion. Tyvärr kan en enda FRAP-kurva ge otillräckliga bevis för att på ett tillförlitligt och entydigt sätt passa in i (eventuellt brusiga) experimentella data. Sadegh Zadeh et al. har visat att FRAP-kurvor kan anpassas med olika par av värden på diffusionskonstanten och on-rate-konstanten, eller, med andra ord, att anpassningar till FRAP inte är unika. Detta gäller anpassningar med tre parametrar (on-rate-konstant, off-rate-konstant och diffusionskonstant). Anpassningar som inte är unika är i allmänhet inte användbara.

För modeller med ett antal parametrar kan ett enda FRAP-experiment vara otillräckligt för att uppskatta alla modellparametrar. Då krävs fler data, t.ex. genom att bleka områden av olika storlek, bestämma vissa modellparametrar oberoende av varandra osv.