Bakterieisolering och RdFucI-identifiering

En koloni som växte i ett medium som innehöll l-fucoidan från Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) som enda kolkälla isolerades från en abalone-tarm som skördats i Sydkorea (Additional file 1: Fig. S1). En jämförelse av sekvensidentiteten baserad på 16S ribosomalt RNA mot NCBI-databasen visade att isolatet stod fylogenetiskt nära medlemmarna i släktet Raoultella (Additional file 1: Fig. S1). Den isolerade stammen identifierades därför som Raoultella sp. KDH14. Efter att ha utfört sekvensering av hela genomet identifierades RdFucI från Raoultella sp. KDH14 på grundval av gensekvensidentitet.

RdFucI består av 595 aminosyror med en molekylmassa på 65,5 kDa och en isoelektrisk punkt på 5,5. Resultaten från Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) visade att RdFucI har hög sekvensidentitet (> 90 %) med andra l-FucI från olika bakterier som tillhör familjerna Raoultella, Klebsiella och Citrobacter.

Den identifierade RdFucI överproducerades i E. coli BL21(DE3) med den N-terminala hexa-histidin-taggen och renades med his-tag affinitetskromatografi. Vid analys med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) framträdde det enskilda bandet runt vid 65 kDa, vilket stämmer överens med den beräknade molekylmassan för den monomera underenheten.

RdFucI-katalyserad reaktion gynnar l-fukosbildning

För att undersöka isomerasaktiviteten hos RdFucI utfördes enzymreaktionen med l-fukos eller l-fuculos som substrat (fig. 2). Enzymaktiviteterna för framåtriktad (l-fukos till l-fuculos) och omvänd (l-fuculos till l-fukos) reaktion bestämdes. Produktionen av l-fuculos från l-fukos bekräftades genom tunnskiktskromatografi (TLC) och gaskromatografi/masspektrometrianalys (GC/MS) (Additional file 2: Fig. S2). Vid interkonversionen mellan l-fukos och l-fuculos observerades ingen sidoprodukt, vilket innebär att ett substrat ger en produkt (Additional file 2: Fig. S2). Vi anser därför att det är rimligt att använda den beräknade mängden l-fuculosekoncentration genom att experimentellt mäta mängden l-fukos.

Enzymatisk omvandling av a l-fukos till l-fuculos (framåtriktad reaktion) och b l-fuculos till l-fukos (bakåtriktad reaktion) med RdFucI. Enzymatisk reaktion utfördes av 3 µg RdFucI med antingen a l-fukos eller b l-fuculos vid 10 mM som utgångssubstrat vid 30 °C i 10 minuter i 20 mM natriumfosfat (pH 7,0) i närvaro av 1 mM Mn2+. Koncentrationen av l-fukos mättes experimentellt och koncentrationen av l-fuculos beräknades genom att subtrahera den experimentellt bestämda koncentrationen av l-fukos från den totala sockerkoncentrationen (10 mM). Experimentella data representerar medelvärden ± standardavvikelser för tre replikat

Den omvända reaktionen var 6,6 gånger snabbare än den framåtriktade reaktionen, och den specifika aktiviteten för l-fuculos (63,9 U/mg) var högre än den för l-fukos (9,6 U/mg). I båda reaktionerna var jämviktsförhållandet mellan l-fukos och l-fuculos, som bestämdes experimentellt, ungefär 9:1, vilket ger en jämviktskonstant (Keq) på 0,11. Värdet på Keq fastställdes också teoretiskt till 0,23, baserat på det termodynamiska sambandet mellan den fria Gibbs-energins standardförändring av reaktionen och Keq vid jämvikt, \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{\text{eq}}}\), där R och T representerar gaskonstanten (8,314 J/mol K) respektive temperaturen (K). \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ }\) representerar den standardiserade fria Gibbs-energiförändringen för reaktionen mellan l-fukos och l-fuculos (0,859993 kcal/mol), som finns förtecknad i databasen BioCyc (https://biocyc.org). Det fanns en viss diskrepans mellan de experimentella och teoretiska värdena för Keq. Ett Keq < 1 indikerar att den omvända reaktionen gynnas. RdFucI-katalyserad isomerisering gynnade den omvända reaktionen och producerade l-fukos från l-fuculos med ungefär 90 % utbyte vid 30 °C och pH 7.

Effekt av temperatur och pH på aktiviteten hos RdFucI och jämvikt

Enzymatiska reaktioner utfördes vid olika temperaturer från 10 till 80 °C och pH från 4 till 11 med l-fuculos som substrat (fig. 3). Isomeriseringen av l-fuculos till l-fukos med RdFucI var starkt temperaturberoende, och maximal eller nästan maximal aktivitet (> 80 % av maximum) uppvisades vid temperaturer mellan 30 och 50 °C (fig. 3a). För att undersöka temperaturens effekt på jämvikten för isomerisering av l-fukos till l-fuculos undersöktes jämviktsförhållandet vid 30, 40 och 50 °C vid vilka maximala eller nästan maximala aktiviteter (> 80 % av det maximala) uppvisades. Som ett resultat fanns det ingen signifikant skillnad i jämviktsförhållandet mellan de tre temperaturerna (l-fukos/l-fukulos = 9:1; p > 0,05). Med andra ord syntetiserades l-fukos från l-fuculos med ett utbyte på cirka 90 % vid alla testade temperaturer (Additional file 3: Fig. S3a).

Effekt av a temperatur och b pH på den relativa aktiviteten hos RdFucI mot l-fuculos. Enzymatiska reaktioner utfördes a vid olika temperaturer från 10 till 80 °C och b vid olika pH från 4 till 11. De buffertar som användes var 50 mM natriumacetat (pH 4, 5 och 6), 50 mM natriumfosfat (pH 6, 7 och 8), 50 mM Tris-HCl (pH 7, 8 och 9) och 50 mM glycin-NaOH (9, 10 och 11). Experimentella data representerar medelvärden ± standardavvikelser för tre replikat

Effekten av pH undersöktes. Hög aktivitet hos RdFucI (> 70 % av det maximala värdet) observerades vid alkaliskt och nära neutralt pH (pH 9, 10 och 11 samt pH 6, 7 och 8). Under pH 6 minskade enzymaktiviteten kraftigt och liten aktivitet observerades vid pH 4. Trots den höga specifika aktiviteten vid alkaliska förhållanden var l-fukosutbytet vid jämvikt (60 minuters inkubation) mycket lägre vid pH 10 (54 %) än vid pH 7 (88 %) (Additional file 3: Fig. S3b). De relativa aktiviteterna vid pH 7, 8 och 9 var mycket lägre i Tris-HCl-buffert än aktiviteterna i natriumacetat- eller glycin-NaOH-buffert, vilket innebär att Tris starkt hämmade den enzymatiska aktiviteten hos RdFucI. De föregående enzymatiska experimenten i den här studien har utförts i reaktionsblandningar som innehåller Tris på 1 mM, vilket kom från buffertbytessteget efter enzymreningen. För att undersöka om Tris i reaktionsblandningen kunde hämma RdFucI jämfördes isomeriseringsaktiviteterna från de reaktioner som skedde i frånvaro och närvaro av 1 mM Tris (Additional file 4: Fig. S4). Ingen signifikant skillnad var uppenbar i de enzymatiska aktiviteterna från de två reaktionerna, vilket tyder på att 1 mM Tris inte hämmade RdFucI-aktiviteten.

Metalljoners effekt på RdFucI:s aktivitet

Sockerisomeraser, inklusive l-fukosisomeraser, kräver tvåvärda katjoner, såsom Mn2+ och Co2+, som kofaktorer för sina isomeriseringsaktiviteter . För att studera effekten av tvåvärda katjoner på den katalytiska aktiviteten hos RdFucI på l-fuculos, analyserades enzymaktiviteten i frånvaro och närvaro av antingen 1 mM av olika metalljoner eller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (tabell 1). Det ursprungliga RdFucI-enzymet som inte utsattes för metalljoner eller EDTA uppvisade låg aktivitet, och metallkelenation med EDTA minskade enzymaktiviteten. Bland de testade metalljonerna ledde Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ och Zn2+ till en markant ökning av enzymaktiviteten. Särskilt tillsatsen av Mn2+ ökade maximalt aktiviteten hos RdFucI med ungefär 7,4 gånger. Däremot hämmade Ca2+, Cu2+ och Fe3+ snarare aktiviteten hos RdFucI.

Substratspecificitet och kinetiska parametrar hos RdFucI

I allmänhet uppvisar socker- och sockerfosfatisomeraser en bred specificitet mot olika substrat . För att bedöma om den ketosfavoriserande aktivitet hos RdFucI som visats med l-fuculos också var tydlig med andra substrat undersöktes substratspecificiteten hos RdFucI mot olika aldossocker (l-fukos, d-arabinos, d-altros, d-galaktos, d-mannos och d-glukos) och deras motsvarande ketossocker (l-fuculos, d-ribulos, d-psikos, d-tagatos och d-fruktos) (fig. 4). Bland alla dessa substrat, inklusive aldos- och ketosocker, observerades de högsta aktiviteterna med l-fuculos (115,3 U/mg) och d-ribulos (127,3 U/mg), som båda är ketosocker. Aktiviteterna hos RdFucI för l-fuculos och d-ribulos var mycket högre än för de andra substraten. Bland aldossocker var aktiviteten för l-fukos den högsta (21,0 U/mg), medan de andra substraten gav specifika aktiviteter som varierade mellan 4,7 och 7,9 U/mg. Andra ketosocker än l-fuculos och d-ribulos uppvisade specifika aktiviteter från 0,0 till 10,8 U/mg. Således var l-fuculos och d-ribulos de föredragna substraten för RdFucI och ketosfavoriserande aktivitet hos RdFucI visades endast med l-fuculos och d-ribulos.

Substratspecificitet hos RdFucI. Enzymreaktioner utfördes mot 10 mM av olika aldos- och ketossubstrat vid 40 °C och pH 10. För aldossubstrat användes l-fukos, d-arabinos, d-altros, d-galaktos, d-mannos och d-glukos. För ketossubstrat användes l-fuculos, d-ribulos, d-psicos, d-tagatos och d-fruktos. Experimentella data representerar medelvärden ± standardavvikelser för tre replikat

Kinetiska parametrar bestämdes med l-fuculos och d-ribulos som substrat (Additional file 5: Table S1). Värdena för Km (Michaeliskonstant) och kcat (omsättningstal för substrat) för l-fuculos var 1,9- respektive 1,2-faldigt lägre än för d-ribulos. Den katalytiska effektiviteten hos RdFucI, representerad som kcat/Km, för l-fuculos var 1,5 gånger högre än för d-ribulos, vilket tyder på att l-fuculos är att föredra som substrat för RdFucI.

Drömkristallstruktur för RdFucI

För att bättre förstå den molekylära funktionen bestämde vi kristallstrukturen för RdFucI (Additional file 6: Tabell S2). Elektrondensitetskartan för RdFucI var väldefinierad från resterna Ser5-Arg591 för sex underenheter i den asymmetriska enheten. Monomeren RdFucI består av 19 α-helixer och 23 β-strängar som omfattar N1-, N2- och C-domänerna (fig. 5a). N1-domänen (Ser5-Met172) antar en α/β-foldning och är involverad i substratigenkänningen av den hexameriska bildningen av RdFucI. N2- (Lys173-Leu352) och C-domänerna (Thr353-Arg591) innehåller de metallbindningsrester som är involverade i den katalytiska aktiviteten (fig. 5a). I den asymmetriska enheten bildar RdFucI-underenheterna en hexamerisk formation arrangerad som en dimer av trimerer med D3h-pseudosymmetri (fig. 5b). Detta stämmer överens med resultatet från analytisk storleksexklusionskromatografi där RdFucI visade sig existera som en homohexamer i lösning (Additional file 7: Fig. S5).

Övergripande struktur för RdFucI. a Tecknad representation av RdFucI-monomeren. RdFucI-monomern består av N1- (gul), N2- (rosa) och C- (grön) domäner. b Ytlig representation av RdFucI-hexametern. Underenhet A, B, C, D, E och F är färgade med gult, rosa, cyan, lila, grönt respektive orange. En metallbindningsplats på en substratbindningsfickplats anges med en röd prick

I den hexameriska formationen är underenhet A (total yta: 23011.7 Å2) interagerar med fyra olika underenheter B (rester i gränssnittet: 47/bruten yta: 1909,6 Å2), C (58/1837,6 Å2), D (42/1482,9 Å2) och E (34/1086,2 Å2). Underenhet A interagerar inte med den återstående underenheten F (fig. 5b). Underenhet A av RdFucI har en total begravd yta på 2569,1 Å2, vilket motsvarar 27,45 % av den totala ytan. Detta begravda gränssnitt stabiliseras av interaktion som involverar 59 vätebindningar och 26 saltbryggor från andra underenheter (Additional file 8: Table S3, Additional file 9: Table S4, Additional file 10: Table S5, Additional file 11: Table S6).

Substratbindningsstället och den aktiva platsen för RdFucI

Substratbindningsfickan bildas av N2- och C-domänerna i subenhet A och N1-domänen i subenhet B (fig. 6a-c) och har totalt sex substratbindningsställen i den homohexameriska RdFucI. Ingången till substratbindningsfickan, där substratet närmar sig, är ungefär 11 × 12,5 Å (fig. 6a). Substratbindningsfickan, där metallbindningsstället bildas, har en negativt laddad yta på cirka 4 × 5 Å (fig. 6b). Avståndet mellan metallbindningsstället och ytan på substratbindningsfickan är cirka 16,7 Å (fig. 6d), vilket innebär att det aktiva centret ligger djupt inne i en ficka. Detta tyder på att både den öppna kedjan och ringformen av substratet är tillgängliga för den aktiva platsens centrum och att, omvänt, en bulk-sackarid inte skulle vara tillgänglig för den aktiva platsen som finns i insidan av substratbindningsfickan.

Substratbindningsfickan och den aktiva platsen för RdFucI. a Substratbindningsfickan bildas genom sammansättning av subenheterna A och C. b Den elektrostatiska ytan i substratbindningsfickan. c Presentation av substratbindningsytan med B-faktor. d Ytskiktsbild av substratbindningsfickan. e 2Fo-F-elektrontäthetskarta (grå maskor, konturerad vid 1,0 σ) över metallbindningsställena hos RdFucI som blötläggs i en lösning som innehåller 10 mM Mn2+. f Geometrisk analys av Mn2+-bindningsställena för RdFucI

RdFucI kräver divalenta metalljoner för sin katalytiska aktivitet för isomeriseringsreaktion med hjälp av ene-diolmekanismen . Metallbindningsstället för RdFucI bör koordineras med Mn2+ av bevarade Glu337-, Asp359- och His528-rester (Additional file 12: Fig. S6). Det finns dock ingen Fo-Fc-elektrontäthetskarta (räknad vid > 5σ) som misstänks vara bunden till Mn2+ som en viktig metall för substratbindning (Additional file 13: Fig. S7a). B-faktorsanalysen visade att temperaturfaktorn för Mn2+ (70,53 Å2) är högre än den genomsnittliga temperaturfaktorn för proteinet (36.22 Å2), vilket tyder på att Mn2+ finns på RdFucI med låg beläggning. Resultatet överensstämde med resultatet från den biokemiska analysen där det nativa enzymet uppvisade en låg aktivitetsnivå. Å andra sidan ökade tillsatsen av Mn2+ avsevärt den katalytiska aktiviteten hos RdFucI (tabell 1). Vi spekulerade därför i att tillsatsen av Mn2+ till RdFucI-kristallen skulle öka den bindande ockupationen av Mn2+. Efter att ha blötlagt RdFucI-kristaller i en lösning med 10 mM Mn2+ observerades en tillförlitlig Fo-Fc-elektrontäthet (> 6σ) på metallbindningsstället där positionen för Mn2+ klargjordes i alla underenheter (Fig. 6e och Additional file 13: Fig. S7b). Temperatur B-faktorn för Mn2+ (76,56 Å2) var dock högre än för hela proteinet (60,69 Å2), vilket innebär att Mn2+-jonen fortfarande inte är helt ockuperad på metallbindningsstället. Mn2+ koordinerades av OE1 (genomsnittligt avstånd: 2,62 Å) och OE2 (2,65 Å) atomer av Glu337, OD1 (2,72 Å) och OD2 (2,72 Å) atomer av Asp361, NE2 (2,52 Å) atom av His528 och vattenmolekylen (2,79 Å) (fig. 6e). De genomsnittliga bindningsvinklarna för Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2) och Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) var 127,32°, 86,25° respektive 73,96°. Bindningsvinkeln mellan liganderna och Mn2+ visade på en förvrängd oktaedrisk koordinering.

Strukturell jämförelse med andra l-FucIs

DALI-servern användes för att söka efter strukturella homologer. Denna sökning visade att RdFucI liknar l-FucIs från E. coli (EcFucI, PDB-kod 1FUI, Z score: 60,6, rmsd: 0,3 för 587 Cαs atomer), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, Z score: 56.6, rmsd: 0,7 för 580 Cαs-atomer) och Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, Z-poäng: 55,9, rmsd: 0,7 för 585 Cαs-atomer). Överlagring av substratbindningsfickan visade att metallbindningsresterna Glu337, Asp361 och His528 (numrerade i RdFucI) är positionsmässigt identiska med de andra proteinerna, medan substratigenkänningsresterna (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496 och Asn524) har en liten konformationsskillnad i sina sidokedjor (fig. 7a). Särskilt α7-α8-slingan i varje l-FucI, som ligger på ytan av substratbindningsfickan, har en annan konformation. Sekvensanpassningen av l-FucIs visade en hög likhet, men sekvensen för α7-α8-slingan i varje l-FucI var mycket varierande (fig. 7b). Eftersom α7-α8-slingan är involverad i bildandet av substratbindningsfickans arkitektur bildar varje l-FucI en unik substratbindningsficka (fig. 7c). l-FucI har vanligen en negativt laddad yta runt metallbindningsstället, men substratbindningsfickans yta uppvisar olika laddningstillstånd (fig. 7c). Som ett resultat av detta kommer α7-α8-slingans strukturella skillnader att orsaka skillnader i substratspecificiteten hos l-FucIs.

Strukturell jämförelse av RdFucI med andra l-FucIs. Överlagring av a aktiv plats och b substratbindningsyta för RdFucI med EcFucI (PDB-kod: 1FUI), ApFucI (3A9R) och SpFucI (4C20). Närbild av den stora konformationsskillnaden mellan α8-α9-slingorna och l-FucIs (vänster). c Partiell sekvensanpassning för α8-α9-slingoregionen för RdFucI och EcFucI, ApFucI och SpFucI. d Elektrostatisk ytrepresentation av RdFucI, EcFucI, ApFucI och SpFucI. Den djupa substratbindningsfickan och α8-α9-slingoregionerna anges med orange- respektive svartprickiga linjer. En metallbindningsplats anges med en gul asterisk

.