Plasmidkonstruktion

Varje chimär anti-HA scFv som testades i den här studien konstruerades genom att sex CDR-slingor från en anti-HA-antikropp 12CA5 transplanterades på varje utvald scFv scaffold. Plasmiden \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\) konstruerades i två steg: (1) ett CDR-loop-graftat scFv-gblock och en H4K20me1 mintbody 15F11-vektor38 linjäriserad med EcoRI-begränsningsställen ligerades via Gibson-assemblering (House prepared master mix); (2) länkaren som förbinder scFv och EGFP, liksom EGFP, ersattes av ett gblock som kodar för en flexibel (G4S) × 5-länkare och mEGFP genom Gibson-assemblering genom NotI-begränsningsställen. För de övriga fyra chimära scFv-plasmiderna ligerades varje CDR-loop-graftat scFv-gblock till \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}}11}^{{{\mathrm{{HA}}}}\) vektorn som linjäriserats med EcoRI-restriktionsplatser via Gibson-montering.

Målplasmid 1 × HA-mCh-H2B konstruerades genom att ersätta sfGFP i en Addgene-plasmid sfGFP-H2B (Plasmid # 56367) med ett 1 × HA-epitopmärkt mCherry-gblock där en NotI-restriktionsplats infogades mellan 1 × HA-epitopen och mCherry för följande kloning. 4 × HA-mCh-H2B konstruerades genom att ersätta 1 × HA-tagget i 1 × HA-mCh-H2B-konstruktionen med ett gblock med 4 × HA-epitop genom AgeI- och NotI-restriktionsplatser. 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) konstruerades genom att ersätta 1 × HA-tagget i 1 × HA-mCh-H2B-konstruktionen med smHA som amplifierats från en Addgene-plasmid smHA-KDM5B-MS2 (plasmid nr 81085) med hjälp av primrarna NZ-098 och 099 (alla primers sekvenser visas i den kompletterande tabellen 1). SmHA-H2B konstruerades genom att ersätta 1 × HA-mCh i 1 × HA-mCh-H2B-konstruktionen med smHA som amplifierats från plasmidet smHA-KDM5B-MS2 med hjälp av primers NZ-098 och 100.

En annan målplasmid 4 × HA-mCh-β-actin konstruerades genom att H2B i 4 × HA-mCh-H2B ersattes med en β-actin-amplikon via BglII- och BamHI-restriktionsställen. β-actin-amplikonen amplifierades från en Addgene-plasmid smFlag-ActinB-MS2 (Plasmid # 81083) med hjälp av primrarna NZ-073 och NZ-074.

Plasmid 4 × HA-mRuby-Kv2.1 genererades genom att först amplifiera 4 × HA-tagget från 4 × HA-mCh-H2B med hjälp av primrarna NZ-105 och 106. Därefter introducerades 4 × HA-amplikonen i en publicerad plasmid pCMV-mRuby2-Kv2.161 (en gåva från Dr. Michael Tamkun), som hade linjäriserats genom en restriktionsdigest med AgeI, med hjälp av Gibson assembly. Plasmiden smHA-Kv2.1 genererades genom PCR-amplifiering av den kodande sekvensen för Kv2.1 hos råttan från pBK-Kv2.140 och efterföljande ligering till AsiSI- och PmeI-restriktionsställena på plasmiden smHA-KDM5B-MS2 med hjälp av primers Kv2.1-1 och 2.

H2B-mCh-1 × HA konstruerades genom två steg: (H2B amplifierades från 1 × HA-mCh-H2B med hjälp av primrarna NZ-092 och 093. (2) H2B vid mCherrys C-terminus ersätts med en 1 × HA-tagg genom BglII- och BamHI-platser, där 1 × HA-tagget syntetiserades genom överlappande PCR med primrarna NZ-094 och 095. Mito-mCh-1 × HA konstruerades genom att H2B i H2B-mCh-1 × HA ersattes med Mito gblock23 genom AgeI- och NotI-platser. Mito-mCh-smHA konstruerades genom att ersätta 1 × HA-tagget i Mito-mCh-1 × HA med smHA som amplifierats från smHA-KDM5B-MS2 med hjälp av primrarna NZ-096 och 097. mCh-H2B skapades genom att ersätta sfGFP i plasmidet sfGFP-H2B med ett mCherry-gblock med hjälp av Gibson-montering.

Plasmiderna FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP skapades genom att ersätta mEGFP i \(\chi _{15{{\mathrm{{F}}}}11}^{{{\mathrm{{HA}}}}\)) med mCherry, HaloTag respektive SNAP-tag gblock.

pET23b-FB-GFP, plasmidet för rekombinant frankroppsexpression och rening, var Gibson-assemblerat med en FB-GFP-amplikon och en publicerad plasmid pET23b-Sso7d62,63 som linjäriserats med NdeI- och NotI-restriktionsplatser. FB-GFP-amplikonen amplifierades från \(\chi _{15{\mathrm{{{F}}}}11}^{{\mathrm{{{HA}}}}\) genom PCR med primrarna NZ-075 och 077.

För översättningsanalysen erhölls reporterkonstruktionen smHA-KDM5B-MS2 och SunTag-kif18b från Addgene (Plasmid # 81085 och # 74928), och SunTag scFv-plasmidet (Plasmid # 60907) modifierades genom att ta bort HA-epitopen som kodas i länkern. HA-epitopen avlägsnades genom platsstyrd mutagenes med QuikChange Lightning (Agilent Technologies) enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av primrarna HAout-1 och 2.

G-blocken syntetiserades av Integrated DNA Technologies och de rekombinanta plasmiderna sekvenskontrollerades av Quintara Biosciences. Primers sekvenser visas i den kompletterande tabellen 1. Alla plasmider som användes för bildöversättning framställdes med hjälp av NucleoBond Xtra Midi EF-kit (Macherey-Nagel) med en slutkoncentration på cirka 1 mg mL-1.

U2OS-cellkultur

U2OS-celler (ATCC HTB-96) odlades i en inkubator vid 37 °C, fuktad, med 5 % CO2 i DMEM-medium (Thermo Scientific) kompletterat med 10 % (v/v) serum från fetalt nötkreatur (Altas Biologicals), 1 mM l-glutamin (Gibco) och 1 % (v/v) penicillin-streptomycin (Gibco eller Invitrogen).

Transfektion och pärlbelastning

För spårning av proteinlokalisering plattades cellerna in i en 35 mm MatTek-kammare (MatTek) 2 dagar före bildtagning och transfekterades transient med LipofectamineTM LTX-reagens med PLUS-reagens (Invitrogen) i enlighet med tillverkarens anvisningar 18-24 timmar före bildtagning.

För avbildning av translation med mRNA märkt med MCP-Halo-protein plattades cellerna in i en 35 mm MatTek-kammare (MatTek) dagen före avbildning. På dagen för avbildningen, före laddning av pärlor, byttes mediet i MatTek-kammaren till Opti-MEM (Thermo Scientific) med 10 % fetalt bovint serum. En blandning av plasmider (smHA-KDM5B-MS2/FB) och renat MCP-HaloTag-protein17 laddades med pärlor enligt tidigare beskrivning6,17,26. Kortfattat, efter att Opti-medium avlägsnats från MatTek-kammaren, pipetterades 4 µl av en blandning av plasmider (1 µg vardera) och MCP-HaloTag (130 ng) i PBS ovanpå cellerna och ~106 µm glaspärlor (Sigma Aldrich) fördelades jämnt ovanpå. Kammaren knackades sedan ordentligt sju gånger och Opti-medium lades tillbaka till cellerna. 3 timmar efter det att pärlorna laddats färgades cellerna i 1 ml 0,2 nM av JF646-HaloTag-ligand48 utspädd i fenolrödfri komplett DMEM. Efter 20 minuters inkubation tvättades cellerna tre gånger i fenolrödfri komplett DMEM för att avlägsna glaspärlor och oligandade färgämnen. Cellerna var sedan redo för avbildning.

För avbildningsöversättning utan mRNA-märkning transfekterades cellerna som pläterats på MatTek-kammaren transient med de plasmider som behövdes, smHA-KDM5B-MS2/FB med eller utan SunTag-kif18b/Sun (med HA-epitopen avlägsnad), med hjälp av LipofectamineTM LTX-reagenset med PLUS-reagenset (Invitrogen) enligt tillverkarens anvisningar på dagen för avbildningen. 3 timmar efter transfektionen byttes mediet till fenolrödfri komplett DMEM. Cellerna var sedan redo för avbildning.

Purifiering av FB-GFP

E. coli BL21 (DE3) pLysS-celler som transformerats med pET23b-FB-GFP odlades vid 37 °C till en densitet på OD600 0,6 i 2xYT-medium som innehöll Ampicillin (100 mg L-1) och Chloramphenicol (25 mg L-1) med skakning. Isopropyl-β-d-thiogalaktosid (IPTG) tillsattes för att inducera proteinuttryck i en slutlig koncentration på 0,4 mM och temperaturen sänktes till 18 °C. Cellerna skördades efter 16 timmar genom centrifugering och resuspenderades i PBS-buffert kompletterad med 300 mM NaCl, proteashämmare (ThermoFisher), 0,2 mM AEBSF (20 mL L-1 kultur) och lyserades genom sonikation. Lysatet klargjordes genom centrifugering. Supernatanten laddades på två anslutna HisTrap HP-kolonner på 5 mL (GE Healthcare), tvättades och eluerades med en linjär gradient av 0-500 mM imidazol. Fraktionerna som innehöll POI sammanfördes, koncentrerades med hjälp av Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO centrifugalfilterenhet (EMD Millipore) och laddades på en storleksuteslutande HiLoad Superdex 200 PG-kolonn (GE healthcare) i HEPES-baserad buffert (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01 % NP40, 10 % glycerol och 1 mM DTT). Fraktionerna som innehöll FB-GFP-protein samlades upp, koncentrerades och förvarades vid -80 °C efter snabbfrysning med flytande kväve.

Immunifärgning

U2OS-celler transfekterades transient med 4 × HA-mCh-H2B eller 4 × HA-mCh-β-actin med LipofectamineTM LTX-reagens med PLUS-reagens (Invitrogen). 26 timmar efter transfektionen fixerades cellerna med 4 % paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences) i 10 minuter i rumstemperatur, permeabiliserades i 1 % Triton 100 i PBS, pH 7,4 i 20 minuter, blockerades i Blocking One-P (Nacalai Tesque) i 20 minuter och färgades vid 4 °C över natten med renat FB-GFP-protein (0,5 µg mL-1 i 10 % blockeringsbuffert). Nästa morgon tvättades cellerna med PBS och POI avbildades med ett Olympus IX81 konfokalt mikroskop med snurrande skiva (CSU22-huvud) med ett ×100 oljeimmersionsobjektiv (NA 1,40) under följande förhållanden: 488 nm (0,77 mW; mätt vid objektivets bakre fokalplan; alla lasereffektmätningar motsvarar här objektivets bakre fokalplan) och 561 nm (0,42 mW) sekventiell avbildning för 50 tidpunkter utan fördröjning, 2 × 2 spinnhastighet, 100 ms exponeringstid. Bilderna togs med en Photometrics Cascade II CCD-kamera med hjälp av programvaran SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Immunfärgningsbilderna genererades genom medelvärdesbildning av 50 tidpunktsbilder för varje kanal med Fiji64.

Western blots

U2OS-celler transfekterades transient med 4 × HA-mCh-H2B eller 4 × HA-mCh-β-actin med LipofectamineTM LTX-reagenset med PLUS-reagenset. 10 timmar efter transfektionen skördades cellerna och lyserades i 120 µl RIPA-buffert med cOmplete Protease Inhibitor (Roche). 6,5 µl av varje celllysat laddades på en NuPAGETM 4-12 % Bis-Tris-proteingel (Invitrogen) och kördes i 60 minuter vid 100 V och 25 minuter vid 200 V. Proteinerna överfördes till ett PVDF-membran (Invitrogen), blockerades i blockeringsbuffert (5 % mjölkpulver i 0,05 % TBS-Tween 20) i 1 timme och färgades över natten med antingen renat FB-GFP-protein (0,5 µg mL-1 i blockeringsbuffert) eller anti-HA-moderantikropp 12CA5 (Sigma-Aldrich kat. nr. 118583816001; 2 000-faldig utspädning med slutkoncentrationen 0,5 µg mL-1 i blockeringsbuffert). För den primära antikroppen 12CA5 gjordes en ytterligare inkubation i 1 timme med anti-musantikropp/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; 5000-faldig utspädning i blockeringsbuffert). POI detekterades från GFP-fluorescensen för FB-GFP eller Alexa 488 för anti-HA-antikroppen med hjälp av en Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) med följande villkor: excitationsvåglängd 473 nm, LPB-filter (≥510 nm), 300 V fotomultiplikatorrör och 10 µm pixelstorlek. De oklippta och obearbetade Western Blots tillhandahålls i kompletterande figur 3.

Fluorescensåterhämtning efter fotoblekning

För att studera FB:s bindningsaffinitet till HA-epitoper i levande celler utfördes FRAP-experiment på celler som transkriberats transient med 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) och FB-GFP (1,25 µg) 24 timmar före FRAP. Bilderna togs med hjälp av ett Olympus IX81 konfokalt mikroskop med snurrande skiva (CSU22-huvud) kopplat till en Phasor-fotomanipulationsenhet (Intelligent Imaging Innovations) med ett oljeimmersionsobjektiv ×100 (NA 1,40). Före fotoblekning förvärvades 20 eller 10 bilder med 1 eller 5 s tidsintervall. Bilderna togs med hjälp av en 488 nm laser (0,77 mW) laser med 100 ms exponeringstid följt av 561 nm (0,42 mW) laser med 15 ms exponeringstid. Den snurrande skivan ställdes in med en snurrfrekvens på 1 × 1. Efter förvärvande av pre-FRAP-bilder användes p488 nm-lasern (från Phasor-enheten för fotoblekning) vid 17 mW med 100 ms exponeringstid, eller 4 mW med 500 ms exponering, för att fotoblekas ett cirkulärt område i kärnan. Efter fotoblekning togs 30 bilder utan fördröjning eller med 500 ms fördröjning, och sedan togs 100 bilder med 1 s fördröjning och 100 bilder med 5 s fördröjning med samma bildinställningar som bilderna före FRAP. Fluorescensintensiteten under tiden för den fotoblekade fläcken exporterades med hjälp av programvaran Slidebook. Fluorescensintensiteten för kärnan och bakgrunden erhölls med Fiji64 efter korrigering för cellrörelse med hjälp av StackReg Fiji plugin65. FRAP-kurvan och thalf erhölls med hjälp av easyFRAP-web66 , enligt instruktionerna på webbplatsen. Figur 4b, d genererades med Mathematica (Wolfram Research).

MCP-rening

MCP-HaloTag renades med hjälp av immobiliserad metallaffinitetskromatografi17. I korthet renades den His-märkta MCP-HaloTag genom en Ni-NTA-agaros (Qiagen) packad kolonn enligt tillverkarens anvisningar, med mindre ändringar. E. coli som uttrycker det intresserade proteinet lyserades i en PBS-buffert med en komplett uppsättning proteashämmare (Roche) och 10 mM imidazol. Hartset tvättas med PBS-baserad buffert som innehåller 20 och 50 mM imidazol. Proteinet eluerades sedan i en PBS-buffert med 300 mM imidazol. Det eluerade His-märkta MCP:et dialyserades i en HEPES-baserad buffert (10 % glycerol, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01 % NP-40 detergent och 1 mM DTT), frystes snabbt in i flytande kväve och förvarades sedan vid -80 °C.

Cellförberedelse för spårning av nascent chain

Reporterplasmidet smHA-KDM5B-MS2 (Addgene plasmid #81085) och FB-konstruktionen transfekterades antingen transient utan MCP-HaloTag-proteinet eller pärlbelastades med MCP-HaloTag-proteinet i U2OS-celler som plomberades på 35 mm MatTek-kamrar 4-6 timmar före avbildning. 3 timmar senare, om MCP-HaloTag-proteinet var laddat med pärlor, färgades cellerna med JF646-HaloTag-liganden och tvättades sedan med fenolrött-fritt komplett DMEM-medium. Om inget MCP-HaloTag-protein behövdes byttes cellernas medium till fenolröttfritt fullständigt DMEM-medium 3 h efter transfektionen. Cellerna var sedan redo för avbildning.

För multiplexad avbildning transfekterades två reporterplasmider, smHA-KDM5B-MS2 och SunTag-kif18b, samt två prober, FB-mCh och Sun-GFP (med HA-epitopen avlägsnad), transient i U2OS-celler som plomberades på en MatTek-kammare 4-6 h före avbildning. 3 h senare byttes cellernas medium till fenolrödfritt komplett DMEM-medium. Cellerna var sedan redo för avbildning.

Avbildningsförhållande för translations- och kolokaliseringsanalyser

För att avbilda enskilda mRNA:er och deras translationsstatus med FB användes ett specialbyggt widefield-fluorescensmikroskop baserat på ett schema för lutande belysning (HILO)17,67. Kortfattat kopplades exciteringsstrålarna, 488, 561, 637 nm fasta lasrar (Vortran), och fokuserades utanför axeln på objektivets bakre fokalplan (APON 60XOTIRF, Olympus). Alla rapporterade lasereffekter uppmättes i objektivets bakre fokalplan. Emissionssignalerna delades av en ultraplatt dikroisk spegel av bildkvalitet (T660lpxr, Chroma). De längre emissionssignalerna (långt rött) efter delningen passerade genom ett bandpassfilter (FF01-731/137-25, Semrock). De kortare emissionssignalerna (rött och grönt) efter delning passerade antingen genom ett bandpassfilter för rött (FF01-593/46-25, Semrock) eller ett bandpassfilter för grönt (FF01-510/42-25, Semrock) installerat i ett filterhjul (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). De längre (fjärrrr-röda) och de kortare (röda och gröna) emissionssignalerna detekterades av två separata EM-CCD-kameror (iXon Ultra 888, Andor) genom fokusering med ett 300 mm akromatiskt dubbelobjektiv (AC254-300-A-ML, Thorlabs). Kombinationen av ×60 objektiv från Olympus, 300 mm tublins och iXon Ultra 888 ger ×100 bilder med 130 nm pixel-1. En inkubator för temperatur (37 °C), luftfuktighet och 5 % CO2 (Okolab) är utrustad på ett piezoelektriskt stativ (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) för avbildning av levande celler. Lasrarna, kamerorna, det piezoelektriska scenen och filterhjulet synkroniserades av en mikrokontroller med öppen källkod, Arduino Mega board (Arduino). Bildförvärv utfördes med hjälp av öppen programvara Micro-Manager (1.4.22)68.

Bildstorleken ställdes in till centrum 512 × 512 pixlar2 (66,6 × 66,6 µm2), och kamerans integrationstid ställdes in till 53,64 ms. Kamerornas utläsningstid från kombinationen av vår bildstorlek, utläsningsläge (30 MHz) och vertikalförskjutningshastighet (1,13 µs) var 23,36 ms, vilket resulterade i vår bildhastighet på 13 Hz (70 ms per bild). Röda och gröna signaler avbildades växelvis. Emissionsfiltrets position ändrades under kamerans avläsningstid. För att minimera genomslaget avbildades den fjärrröda signalen samtidigt med den gröna signalen. För att fånga cellernas hela tjocklek avbildades 13 z-stackar med en stegstorlek på 500 nm (totalt 6 µm) med hjälp av det piezoelektriska stativet. Detta resulterade i vår totala cellbildningshastighet på 1 Hz för avbildning av antingen röda eller gröna signaler, och 0,5 Hz för avbildning av både röda och gröna signaler oavsett avbildning med fjärr-rött.

För figurerna 1c, d, 2a, e avbildades ett enskilt plan av cellerna kontinuerligt med 6,5 Hz under 100 tidpunkter och medelvärde för hela tiden (lasrar: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (fig. 1c), 90 µW (fig. 1d), 19 µW (fig. 2a), 155 µW (fig. 2e); 637 nm, 220 µW). I fig. 2b (vänster) avbildades cellen kontinuerligt med 0,5 Hz, 488 nm (100 µW) och 561 nm (10 µW) lasrar med 13 z-stacks vid varje tidpunkt och medelvärde under hela tiden. De förvärvade genomsnittliga 13 z-stacken avvecklades med hjälp av Fiji. I figurerna 6b, c, e och f avbildades cellerna var 10:e sekund med 13 z-stackar per tidpunkt (lasrar: 488 nm, 13 µW (fig. 6b), 18 µW (fig. 6c); 561 nm, 172 µW (fig. 6f); 637 nm, 150 µW (fig. 6b, c), 35 µW (fig. 6e)). För fig. 7b avbildades cellen kontinuerligt vid 0,5 Hz med 13 z-stackar för varje tidpunkt (lasrar: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). I figur 8b avbildades cellerna var 14:e sekund med 13 z-stacks vid varje tidpunkt (laser: 488 nm, 70 µW). I fig. 8c avbildades cellerna var 40:e sekund med 13 z-stacks vid varje tidpunkt (laser: 488 nm, 130 µW). För bestämning av hastigheten i motoriserade translationsspots (fig. 8e) avbildades neuronerna kontinuerligt vid 1 Hz med 13 z-stacks per tidpunkt.

För fig. 2b (höger) och 2c avbildades samlokaliseringen med Olympus IX81 konfokala mikroskop med snurrande skiva (CSU22-huvud), som beskrivits tidigare, med ett ×100 oljeimmersionsobjektiv (NA 1,40) under följande förhållanden: 488 nm (0,77 mW) och 561 nm (0,42 mW) sekventiell avbildning för fem tidpunkter utan fördröjning med flera z-skivor för att täcka hela cellkroppen för varje tidpunkt, 1 × 1 spinnhastighet, exponeringstid anpassad efter cellens ljusstyrka. Bilderna togs med en Photometrics Cascade II CCD-kamera med hjälp av programvaran SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). De visade bilderna i figurerna genererades genom att medelvärdeberäkna fem tidpunkter och sedan utfördes en maxprojektion av alla z-skivor med Fiji64.

Partikelspårning av translationsställen

Detektering och spårning av enskilda translationsställen utfördes på bilder med maximal intensitetsprojektion med en anpassad Mathematica (Wolfram Research)-kod17. I korthet bearbetades bilderna med ett bandpassfilter för att framhäva partiklar, och sedan binäriserades de för att upptäcka deras intensitetscentroider som positioner med hjälp av den inbyggda Mathematica-rutinen ComponentMeasurements. Upptäckta partiklar spårades och kopplades samman i tiden med hjälp av en sökning efter närmaste granne. De exakta koordinaterna (superupplösta platserna) för mRNA och translationsplatser bestämdes genom att anpassa (med hjälp av den inbyggda Mathematica-rutinen NonlinearModelFit) de ursprungliga bilderna till 2D-gaussianer av följande form:

där IBG är bakgrundsfluorescensen, I partikelintensiteten, (x0, y0) partikelns placering och (σx, σy) partikelns spridning. Förskjutningen mellan de två kamerorna registrerades med hjälp av den inbyggda Mathematica-rutinen FindGeometricTransform för att hitta den transformationsfunktion som bäst anpassade de inpassade positionerna för Tetraspeck-pärlor med en diameter på 100 nm som var jämnt utspridda över bildfältet.

För figurerna 6c, e, f, 7c, 8b, d spårades partiklarna med hjälp av en anpassad Mathematica-kod och plottades vidare med Mathematica. För fig. 7c beräknades genomsnittliga medelkvadratförskjutningar från de Gaussiskt anpassade koordinaterna (från 2D-projektionsbilder med maximal intensitet). Diffusionskonstanten erhölls genom att anpassa de fem första tidpunkterna till en linje med lutningen m = 4D, där D är diffusionskoefficienten. De enskilda motoriserade translationsplatserna (fig. 8e) spårades med Fiji-pluginet TrackMate69 efter maxprojektion och plottades vidare med Mathematica. All Mathematica-kod finns tillgänglig på begäran.

Spårning av enstaka molekyler av 1×HA-märkta proteiner i celler

Dagen före avbildningen pläterades cellerna på MatTek-kammaren och transfekterades transient med 1 × HA-mCh-H2B och FB-Halo med hjälp av LipofectamineTM LTX-reagenset med PLUS-reagenset (Invitrogen) enligt tillverkarens instruktioner. 3 timmar efter transfektionen byttes mediet till komplett DMEM. Före avbildningen färgades cellerna med natriumborohydrid (NaBH4) behandlad Halo-ligand TMR (Promega)45. Kortfattat reducerades 1 µl av 1 mM Halo ligand TMR-färgämnet i 10 minuter i 200 µl av 50 mM NaBH4-lösning (förlöses i PBS i 10 minuter, pH 7,4). Därefter späddes 200 µl av den reducerade TMR-färgen med 800 µl fenolrödfri DMEM för att producera 1 mL reducerat TMR-medium. Media från transfekterade celler ersattes med media med reducerat TMR och cellerna placerades sedan i en inkubator (5 % CO2, 37 °C) i 30 minuter för färgning. Cellerna tvättades sedan tre gånger med fenolrödfri DMEM. Mellan tvättarna inkuberades cellerna i 5 minuter i en inkubator (5 % CO2, 37 °C).

Cellerna avbildades med hjälp av ett specialbyggt widefield-fluorescensmikroskop baserat på ett schema med lutande belysning (HILO)17,67. Bildfältet var inställt på 256 × 256 pixlar2 (33,3 × 33,3 µm2) och kamerans integrationstid var inställd på 30 ms. Cellerna avbildades med en 7,7 mW 561 nm laser med en avbildningshastighet på 43,8 ms per bild under totalt 10 000 tidpunkter (7,3 min). Under avbildningen pulserades en 6,2 mW 405 nm laser på i 50 ms var 10:e sekund för att fotoaktivera den reducerade Halo-TMR-liganden. Enskilda molekyler spårades med hjälp av Fiji-pluginprogrammet TrackMate69. För att säkerställa att spåren representerar FB-Halo bundet till 1 × HA-mCh-H2B filtrerades spåren ytterligare i Mathematica. Filtret eliminerade spår med en längd på mindre än 16 bilder. Dessutom måste alla hopp mellan bilderna vara mindre än 220 nm. Detta kriterium har använts av andra för att skilja transkriptionsfaktorer som är kromatinbundna från dem som är obundna46. Slutligen färgkodades spåren i Mathematica antingen enligt den tid då de förvärvades (som i Supplementary Fig. 5) eller den genomsnittliga hoppstorleken mellan ramarna (som i Fig. 5).

Puromycinbehandling

U2OS-celler som transient transfekterats med smHA-KDM5B-MS2 och FB eller pärlor som laddats med smHA-KDM5B-MS2, FB och MCP-HaloTag avbildades som ovan med 10 s mellanrum mellan ramarna. Efter att ha förvärvat 5 eller 10 tidpunkter som förbehandlingsbilder behandlades cellerna med en slutkoncentration av 0,1 mg mL-1 puromycin precis innan den 6:e eller 11:e tidpunkten förvärvades. Efter att puromycin tillsatts bildades cellerna under samma förhållanden som för förbehandlingsbilderna tills translationsplatserna försvann.

Neuronodling och transfektion

Råttans kortikala neuroner erhölls från de kasserade kortikalerna från foster med embryonal dag (E)18 som tidigare dissekerats för att erhålla hippocampus, och frystes ner i Neurobasal-medium (ThermoFisher Scientific) som innehöll 10 % fetalt bovint serum (FBS, Atlas Biologicals) och 10 % dimetylsulfoxid (Sigma-Aldrich, D8418) i flytande kväve. Kryokonserverade kortikala neuroner från råttor pläterades med en densitet på ∼15 000-30 000 celler per cm2 på MatTek- tallrikar (MatTek) och odlades i Neurobasal-medium som innehöll 2 % B27-tillägg (ThermoFisher Scientific), 2 mM l-alanin/l-glutamin och 1 % FBS (Atlas Biologicals). Transfektioner utfördes efter 5-7 dagar i kultur med hjälp av Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) enligt tillverkarens anvisningar. Neuroner som samuttrycker 4 × HA-mRuby-Kv2.1 och FB-GFP avbildades 1-2 dagar efter transfektionen (fig. 2b). Neuroner som samuttrycker smHA-Kv2.1 och FB-GFP avbildades 1-7 dagar efter transfektionen (kompletterande figur 2 till vänster). För translationsanalyser fotograferades neuronerna 4-12 timmar efter transfektionen. Alla experiment för avbildning av neuroner utfördes i en temperaturkontrollerad (37 °C), fuktig miljö med 5 % CO2 i Neurobasal-medium utan fenolrött (ThermoFisher Scientific). Neuronernas identitet bekräftades genom att följa processer som utgick från cellkroppen för att avbildas i hundratals mikrometer för att säkerställa att de var riktiga neuriter.

Övervakning av zebrafiskens utveckling

Alla zebrafiskförsök har godkänts av Tokyo Techs säkerhetskommitté för genetiska experiment (I2018001) och djurhanteringen sker i enlighet med riktlinjerna. För att visualisera FB-GFP i zebrafiskembryon framställdes mRNA för FB-GFP och N × HA-mCh-H2B. DNA-fragment som kodar FB-GFP och N × HA-mCh-H2B infogades i en plasmid som innehåller T7-promotor och poly A70. De efterföljande plasmiderna (T7-FB-GFP och T7-N × HA-mCh-H2B) linjäriserades med XbaI-restriktionsplatsen för in vitro-transkription med hjälp av mMESSAGE mMACHINE-kit (ThermoFisher Scientific). RNA renades med RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN) och resuspenderades i vatten. Före mikroinjektion avchorionerades zebrafiskägg (AB) genom att blötläggas i 2 mg mL-1 pronas (Sigma Aldrich; P5147) i 0,03 % havssalt i 10 minuter. En blandning (~0,5 nL) innehållande mRNA (200 pg vardera för FB-GFP och N × HA-mCh-H2B) injicerades i äggulan (nära celldelen) hos embryon i 1-cellsstadiet. För en negativ kontroll utelämnades HA-mCh-H2B mRNA. 5-10 minuter efter mRNA-injektionen injicerades Cy5-märkt Fab specifikt för endogen histon H3 Lys9-acetylering (CMA310)25 (100 pg i ~0,5 nL). Injicerade embryon inkuberades vid 28 °C till fyrcellsstadiet och bäddades in i 0,5 % agaros (Sigma Aldrich, A0701) i 0,03 % havssalt med djurpolen nedåt på en 35 mm glasbottenskål (MatTek). Fluorescensbilderna samlades in med hjälp av ett konfokalmikroskop (Olympus; FV1000) utrustat med ett uppvärmt stativ (Tokai Hit) inställt på 28 °C och ett UPLSAPO ×30 silikonoljeimmersionsobjektiv (NA 1,05), som styrdes av den inbyggda FV1000-programvaran FLUOVIEW ver.4.2. Tre färgbilder togs sekventiellt var 5:e minut med 488, 543 och 633 nm lasrar (640 × 640 pixlar; 0,662 µm pixel-1, pinhole 800 μm; 2,0 μs pixel-1) utan medelvärdesbildning. Projektioner med maximal intensitet skapades från 20 z-stackar med 5 μm.

Kärnor i zebrafiskembryon spårades i 4D med hjälp av Fiji-pluginet TrackMate69. Resultaten efterbehandlades och plottades med Mathematica. För att kvantifiera antalet och arean av kärnor och den genomsnittliga kärn-, cytoplasma- och kärn:cytoplasma-intensiteten genom tiden mättes intensiteten för alla kärnor i projektioner med maximal intensitet med hjälp av den inbyggda Mathematica-funktionen ComponentMeasurements. ComponentMeasurements kräver binära masker av de objekt som ska mätas. Binära masker av kärnorna gjordes med hjälp av den inbyggda Mathematica-funktionen Binarize med en lämplig intensitetströskel för att framhäva just kärnor i bilder från Cy5-märkt Fab (specifik för endogen histon H3 Lys9-acetylering). Masker av cytoplasman runt varje kärna gjordes genom att utvidga kärnmaskerna med 4 pixlar (med hjälp av det inbyggda kommandot Dilation) och sedan subtrahera från den utvidgade masken de ursprungliga kärnmaskerna som utvidgats med 1 pixel. Detta skapar ringliknande masker runt varje kärna, från vilka den genomsnittliga cytoplasmaintensiteten mättes.

Öppningsplasmonresonans

Bindningskinetik för renad FB till HA-epitoptaggen mättes med hjälp av ytplasmonresonans (OpenSPR, Nicoyalife). Efter att biotinmärkt HA-peptid fångats upp av ett streptavidinsensorchip (Nicoyalife) flödade utspädd renad FB-GFP i PBS-körbuffert, pH 7,4, långsamt över sensorchipet i 5 minuter för att möjliggöra interaktion. Den löpande bufferten fick sedan flöda i 10 minuter för att samla in dissociationsdata. Kurvan för ospecifik bindning erhölls genom att samma koncentration av FB-GFP i samma löpande buffert flödade över ett annat streptavidinsensorchip (Nicoyalife). Data från kontrollen samlades in precis som i experimentet. För 100 och 30 nM FB-GFP var bindningssvaret betydligt högre än kontrollen, med försumbar icke-specifik bindningsinteraktion. Därför valde vi dessa två koncentrationer för anpassning av bindningskinetiken. Efter att ha subtraherat kontrollen erhölls kurvan för signalrespons vs. tid, vilket visas i kompletterande figur 4. Bindningskinetiska parametrar erhölls genom att anpassa kurvan till en en-till-en-bindningsmodell med hjälp av programvaran TraceDrawer (Nicoyalife) (Supplementary Fig. 4).

Rapporteringssammanfattning

Fördjupad information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till denna artikel.