Under det senaste decenniet har kemogenetiska och optogenetiska tekniker revolutionerat den integrativa neurovetenskapen genom att tillhandahålla nya verktyg för att reversibelt manipulera aktiviteten hos specifika populationer eller neurotransmittorsystem med större selektivitet (Sternson och Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al., 2017). Jämfört med optogenetik, som möjliggör snabb och fasisk neuronal modulering med hög tidsmässig upplösning, möjliggör kemogenetik en mer utvidgad modulering av system, vilket är särskilt användbart för studier som fokuserar på toniska fenomen (t.ex. undersökning av dopamins inblandning i motivationsprocesser; Whissell et al., 2016). Bland kemogenetiska verktyg används designerreceptorer som uteslutande aktiveras av designerdroger (DREADDs) i stor utsträckning och de kallas för ett biologiskt ”lås-och-nyckel”-system för selektiv manipulation av cellaktivitet genom G-proteinsignalvägar. De utvecklades först på ett mycket elegant sätt av Roths grupp (Armbruster et al, 2007), är denna G-proteinkopplade receptor (GPCR) en muskarinreceptor: låset, som muterades för att endast reagera på clozapin-N-oxid (CNO), nyckeln, en härledd metabolit av det atypiska antipsykotikumet clozapin, som annars potentiellt inte har någon farmakologisk aktivitet.

Hur som helst har vissa publikationer sedan 2016 tagit upp oroväckande frågor om användningen av CNO. För det första kan relativt höga doser CNO (10 mg/kg) som administreras systemiskt ha farmakologisk off-target-aktivitet, vilket framgår av induktionen av beteendeeffekter hos råttor och möss som inte medieras av DREADDs (MacLaren et al., 2016; Gomez et al., 2017; Baerentzen et al., 2019). Dessutom visade Gomez et al. (2017) att CNO inte lätt passerar blod-hjärnbarriären, kan uppvisa låg DREADD-bindningsaffinitet och återmetaboliserades till klozapin, vilket blev den verkliga effektorn för DREADDs. På grundval av dessa slående observationer föreslog de en direkt användning av låga doser klozapin (0,1 mg/kg) för att aktivera DREADDs i stället för CNO. Att använda låga doser klozapin i stället för stora doser CNO som gradvis omvandlas till klozapin leder dock till två stora begränsningar. För det första är det inte uppenbart att klozapin, vid akut injektion eller långvarig diffusion, verkar på DREADDs på samma sätt (Mahler och Aston-Jones, 2018). För det andra, eftersom klozapin är ett atypiskt antipsykotiskt medel har det många endogena måltavlor som serotoninerga, muskarinerga eller dopaminerga receptorer, med relativt starka affiniteter (Meltzer, 1989; Schotte et al., 1993; Brunello et al., 1995; Ashby och Wang, 1996; Armbruster et al., 2007) och är troliga att framkalla off-target-effekter, även med låga doser. Faktum är att den dos av klozapin på 0,1 mg/kg som rekommenderas för DREADD-experiment har visat sig öka det ångestrelaterade beteendet signifikant hos möss (Manzaneque et al., 2002) samt hos råttor (en effekt som vi också observerade; R. Goutaudier och S. Carnicella, opublicerade observationer), där klozapin också påverkar lokomotionen genom potentiell sedering och försämrar den kognitiva flexibiliteten (Ilg et al, 2018).

Och även om förekomsten av dessa effekter kan bero på den art, stam eller det kön som används, och kan vara mycket diskreta (eftersom inte alla beteendedimensioner påverkas); de har potential att påtagligt störa djurens prestationer i en mängd olika beteendeuppgifter. Hög stress och ångest kan vara förväxlingsfaktorer i till exempel minnes- eller smärtstudier (Sousa et al., 2006; Sorge et al., 2014). Dessutom kan beteende relaterat till missbruk av droger eller psykiatriska störningar som schizofreni, ångest eller kognitiv flexibilitet modifiera hela fenotypen (Floresco et al., 2009; Koob och Schulkin, 2018). Baserat på dessa observationer behövs viktiga försiktighetsåtgärder med klozapin för att undvika snedvridna beteendestudier.

Vad skulle en ny molekyl specifikt utformad för DREADDs vara mer selektiv? Föreningen 21 (C21) är en syntetisk DREADD-ligand som utvecklades 2015 (Chen et al., 2015) och delvis karakteriserades in vitro samt in vivo 2018 (Thompson et al., 2018). Återigen, vid låga doser (<3 mg/kg), beskrevs den vara fri från beteendemässiga off-target-effekter och kunna förändra beteendet hos DREADD-uttryckande djur. Denna studie stärktes av Jendryka et al. (2019), som genomförde farmakokinetiska och farmakodynamiska experiment med möss och C21 (3 mg/kg). De visade att 30 minuter efter administrering av C21 var koncentrationen av molekylen i CSF >10 gånger högre än den uppskattade EC50 för DREADD-aktivering (CSF = 40 nm och EC50DREADDs = 3 nm), och utan backmetabolisering till klozapin. Resultaten av en nyligen genomförd BioRxiv preprint-studie på råttor, möss och makaker (Bonaventura et al., 2018) tyder dock på att även om C21 uppvisar en låg penetrering i hjärnan kan en dos på 1 mg/kg redan modifiera hjärnfunktionen hos vildtypmöss. Dessutom observerades en svag affinitet och ockupation för DREADDs in vitro i hjärnskivor från råttor samt in vivo hos möss och makaker i en positronemissionstomografistudie. Baserat på samma experimentella undersökning som för C21 föreslog de, som ett alternativ, två andra ligander, JHU37152 och JHU37160, som har en högre in vivo-potens för DREADDs och potentiellt färre off-target-effekter (Bonaventura et al., 2018). Även om denna nya generation av DREADD-ligander verkar lovande är de på grund av sin nyhet fortfarande dåligt karakteriserade och förblir strukturellt homologa med klozapin och CNO. Utförlig karakterisering i cellulär till beteendevetenskaplig undersökning kommer därför att vara avgörande för att utesluta de potentiella fallgropar som hittades för CNO.

En alternativ lösning för att förbättra selektiviteten hos kemogenetiska tillvägagångssätt skulle vara att använda en annan lås- och nyckelkombination. Som sådan är κ-opioidreceptor-DREADD (KORD) en muterad hämmande GPCR som härstammar från människans κ-opioidreceptor (Vardy et al., 2015). Jämfört med klassiska DREADDs som binder clozapin, CNO, C21 eller JHU-föreningar engageras KORD av salvinorin B, en läkemedelsliknande metabolit av den KOR-selektiva agonisten salvinorin A. Även om detta kemogenetiska tillvägagångssätt på ett elegant sätt användes i kombination med en aktiverande DREADD för att skapa ett ”ON and OFF”-system inom samma neuronala population (Vardy et al, 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), används den fortfarande marginellt eftersom den endast minskar den neuronala aktiviteten under en kort tidsperiod (Aldrin-Kirk och Björklund, 2019). Dessutom uppvisar salvinorin B en viss affinitet för endogena KOR vid höga koncentrationer och har ännu inte gynnats av en djupgående karakterisering som för närvarande utförs för DREADD-relaterade föreningar (Roth, 2016). Att ersätta GPCR med en muterad jonkanal, en annan alternativ utformad receptor som kallas ligand-gated ion channels (LGICs) är ett alternativ som utvecklats av Stenson-laboratoriet (Magnus et al., 2011). Jämfört med DREADDs kombinerar LGICs den ligandbindande domänen hos en muterad nikotinreceptor med jonporedomen hos en annan vald receptor för att skapa en chimär jonkanal. I likhet med DREADDs aktiveras denna hybridkanal av en liten agonist som härrör från quinuclidinylbenzamid, en α7 nikotinisk acetylkolinreceptoragonist, och möjliggör jonbyte över neuronmembranet. Bland andra begränsningar som är specifika för detta tillvägagångssätt (Aldrin-Kirk och Björklund, 2019) delar det också med DREADDs användningen av en farmakologisk ligand som potentiellt kan interagera med endogena receptorer, beroende på de experimentella förhållandena. Slutligen härrör alla dessa lås från endogena receptorer och misslyckas som sådana med att göra sig av med de begränsningar som är inneboende kopplade till farmakologin.

Bortom denna senaste utveckling och de frågor som återstår bör en avgörande fråga ställas: Kommer man någonsin att hitta en helt selektiv och inert nyckel? Förmodligen inte. Det är viktigt att komma ihåg att DREADDs är kemogenetiska verktyg som kombinerar genetik och farmakologi. Även om genetiska metoder erbjuder en kraftfull kontroll av uttrycket av låsen (dvs. DREADDs) i specifika cellpopulationer, eller subpopulationer med villkorliga metoder, härrör de från endogena GPCRs och är som sådana föremål för samma begränsningar som den klassiska farmakologin för nyckeln. Det är därför osannolikt att man kommer att hitta molekyler som uppvisar hög bindningsaffinitet för DREADDs utan affinitet för några av de många receptorer som redan finns i hjärnan och som är nära besläktade med DREADDs. Till exempel har klozapin en mycket hög affinitet för DREADDs, men också för den serotoninerga receptorn 5-HT2 (Ki = 10-8 för båda; Armbruster et al., 2007; Gomez et al., 2017), och en hög affinitet för ett brett spektrum av andra GPCR:er (Ki = 10-7 till 10-6; Armbruster et al., 2007). Även syntetiska ligander som är särskilt utformade för denna kemogenetiska teknik uppvisar betydande affiniteter för endogena receptorer. Även om till exempel JHU37152 och JHU37160 har en lägre affinitet för 5-HT-receptorer än clozapin, har de en övergripande liknande målprofil som detta läkemedel, med en ännu högre affinitet för muskarinreceptorer (Bonaventura et al., 2018), vilket tyder på potentiellt starkare off-target-effekter. C21 uppvisar också en högre affinitet för den histaminerga H1-receptorn än för DREADDs (Ki > 10-8 respektive Ki = 10-7,2; Thompson et al., 2018) och en större bindningspotential till opioidreceptorer än klozapin (Bonaventura et al., 2018). För att minimera fallgroparna med detta kraftfulla tillvägagångssätt, oavsett nyckelval, måste kritiska försiktighetsåtgärder vidtas (figur 1).

Först, före varje beteendeexperiment, måste de experimentella förhållandena testas för att hitta den bästa liganden och den optimala dosen eller de optimala doserna, beroende på den experimentella metoden. DREADDs får inte betraktas som ett nyckelfärdigt verktyg; cellulära, neurokemiska eller elektrofysiologiska experiment bör utföras före beteendestudien (Mahler et al., 2014; Beloate et al., 2016; Boekhoudt et al., 2016) för att bekräfta ligandens effektivitet vid den valda dosen i det aktuella systemet. Dessutom måste kontrolldjur utan DREADD inkluderas för att verifiera frånvaron av aspektiva neurobiologiska effekter av liganden eller receptorn i sig som kan aktiveras av en neurotransmittor eller ha en konstitutiv aktivitet (Saloman et al., 2016).

För det andra bör, när det är möjligt, två olika DREADD-ligander testas för att bekräfta att de observerade beteendeeffekterna är specifikt DREADD-medierade. De specifika farmakologiska verkningarna på DREADDs skulle vara likartade, men off-target-effekter kan skilja sig åt.

För det tredje, och den mest kritiska punkten, måste konventionella farmakologiska kontroller användas. Samma filosofi som inom farmakologin bör tillämpas, och liksom för neurobiologiska experiment måste grupper av transgena djur som inte uttrycker DREADDs (t.ex. DREADDs tomma virala vektorer) integreras för att verifiera de selektiva effekterna av liganden och den valda dosen (Smith et al., 2016, Campbell och Marchant, 2018; Mahler och Aston-Jones, 2018; för ett exempel på experimentella studier som följer denna utformning, se även Xia et al., 2017; Cope et al., 2019). Detta uttalande kan tyckas trivialt, men jakten på en absolut selektiv ligand och den här ansatsens attraktionskraft har redan lett till vissa överdrivna beteendestudier, som ibland utförts i fullständig avsaknad av denna kontroll.

Slutsatsen är att DREADDs ger ett exakt sätt att manipulera neurala kretsar och beteende, och ger ett bra alternativ till optogenetik för att tonvis manipulera en specifik cellulär subpopulation, och öppnar därmed nya spännande forskningsvägar. Men precis som termiska egenskaper hos ljus i optogenetik kan leda till aspecifika effekter (se även Owen et al., 2019) krävs större försiktighet med kemogenetik, och standardkontroller måste vara obligatoriska. DREADD:s begränsningar måste erkännas och tid måste tas i anspråk för att undvika eller kontrollera eventuella off-target-effekter och för att verifiera att detta tillvägagångssätt inte inducerar bias i sig självt. Genom att använda genetikens styrkor samtidigt som man uppmärksammar farmakologins svagheter kommer man att maximera potentialen hos detta tillvägagångssätt.