Optimizarea testului IFN-γ ELISpot în urma stimulării PBMC cu antigene CMV IE-1 și pp65 activate cu T-activated®

Pentru testul ELISpot au fost utilizate PBMC proaspăt izolate. Pentru a preveni pierderea funcționalității celulelor T, de exemplu din cauza granulocitelor activate , probele de sânge heparinizate au fost procesate fără alți aditivi în decurs de 8 h. Un număr total de 2 × 105 PBMC pe puț a fost ales pentru dezvoltarea protocolului de testare ELISpot, deoarece acest număr de celule este sub nivelul de confluență și poate fi obținut, de obicei, din probe de mai puțin de 15 ml de sânge integral. Proteina imediată timpurie IE-1 a CMV și proteina târzie a tegumentului pp65 reprezintă antigene imunodominante bine caracterizate ale celulelor T . IE-1 în lungime completă și un fragment C-terminal de 181 aminoacizi al pp65 au fost produse și formulate în prezența ureei (T-activation®) pentru a crește capacitatea lor de stimulare pentru diferite tipuri de celule efectoare reactive la CMV ale imunității mediate de celule . Concentrația optimă de antigen T-activated® a fost mai întâi determinată prin efectuarea de experimente de tip doză-răspuns. PBMC proaspăt izolate de la un donator sănătos seropozitiv CMV au fost stimulate cu 31,6 fg/ml până la 31,6 μg/ml T-activated® pp65 sau cu 0,01 până la 31,6 μg/ml T-activated® IE-1, iar numărul de celule secretoare de IFN-γ a fost determinat prin IFN-γ ELISpot. T-activated® pp65 a arătat o capacitate mult mai mare de a stimula celulele efectoare secretoare de IFN-γ decât T-activated® IE-1, atingând un platou de răspuns între 0,316 și 3,16 ng/ml pp65 față de aproximativ 31,6 μg/ml pentru IE-1 (Fig. 1). În consecință, au fost selectate concentrații de antigen T-activated® de 3 μg/ml pp65 și 15 μg/ml IE-1 pentru stimulări ulterioare ale PBMC și teste ELISpot.

Sensibilitatea și specificitatea testului au fost determinate prin stimularea PBMC izolate de la 10 donatori sănătoși seropozitivi la CMV și seronegativi la CMV cu concentrațiile definite de antigen T-activated® pp65 și IE-1. Numărul de celule efectoare reactive a fost cuantificat prin IFN-γ ELISpot. Stimularea semnificativă a fost definită cu ajutorul unui test Mann-Whitney U-Test ca o diferență semnificativă din punct de vedere statistic între valorile SFC din condițiile nestimulate și cele stimulate cu antigen CMV (fiecare în patru exemplare). T-activated® pp65 și IE-1 au indus o activare semnificativă a celulelor efectoare receptive în 10 din 10 și, respectiv, 9 din 10 preparate PBMC de la donatori individuali seropozitivi la CMV (Fig. 2). În acest colectiv, T-activated® pp65 a prezentat o capacitate generală mai mare de activare a celulelor receptive, cu o valoare mediană de 399 SFC/200 000 PBMC (interval 12-864 SFC/200 000 PBMC), comparativ cu T-activated® IE-1 cu o valoare mediană de 26 SFC/200 000 PBMC (interval 1,3-96 SFC/200 000 PBMC). Cu toate acestea, s-a detectat un răspuns substanțial de până la 96 SFC/200.000 PBMC ca răspuns la T-activated® IE-1 în eșantioane individuale de donatori seropozitivi la CMV (Fig. 2). Toate cele 10 probe de PBMC (100%) de la diferiți donatori seronegativi la CMV au prezentat rezultate negative ale testelor după stimularea cu pp65 (mediana 0,3 SFC/200.000 PBMC; interval 0-2,8), în timp ce 9 din 10 (90%) probe de PBMC de la persoane seronegative la CMV au fost negative după stimularea cu IE-1 (mediana 2,9 SFC/200.000 PBMC; interval 0,3-6,8). Numărul de pete în PBMC stimulate cu IE-1 în cazul CMV-seronegative a fost mai mare decât în PBMC stimulate cu pp65 în cazul CMV-seronegative, dar nu a depășit 7 SFC/200.000 PBMC (fig. 2).

S-a demonstrat că IFN-γ este secretat continuu în timpul stimulării cu antigen. Astfel, intensitatea semnalului în IFN-γ ELISpot este dependentă de durata stimulării . Durata de stimulare cu antigen în IFN-γ ELISpot raportată în literatura de specialitate variază de obicei între 16 și 24 h . Pentru a aborda influența duratei de incubare asupra rezultatelor testului, IFN-γ ELISpot au fost efectuate pe PBMC de la 3 donatori sănătoși independenți seropozitivi la CMV în urma stimulării cu antigene T-activate® pp65 și IE-1 timp de 17, 19 și 21 h. Nu au fost detectate diferențe semnificative din punct de vedere statistic în ceea ce privește numărul de SFC între cele 3 condiții (Fig. 3), demonstrând stabilitatea semnalului în acest interval de timp. Astfel, a fost ales un timp de incubare de 19 h pentru testul ELISpot optimizat.

Numeroase variabile de protocol pot afecta rezultatele testului ELISpot. De exemplu, mediul utilizat pentru cultura celulară primară include adesea ser care conține diverse molecule bioactive necaracterizate, dependente de lot, în diferite concentrații . Pentru a defini condițiile standardizate de cultură celulară, a fost investigat impactul asupra performanțelor de testare a diferitelor medii care conțin ser (RPMI 1640 suplimentat cu 5% fie de FCS, fie de AB uman, NTA sintetic sau NTS sintetic) și a mediilor fără ser (AIM-V®, UltraCulture). Mediile fără ser au produs cele mai bune răspunsuri ale celulelor efectoare, comparabile cu cele ale mediului RPMI 1640 suplimentat cu 5% FCS (Fig. 4a). În plus, AIM-V® a prezentat cele mai mici semnale de fond în condiții nestimulate (Fig. 4b), maximizând astfel raportul semnal/zgomot. În consecință, protocolul ELISpot a fost stabilit în continuare folosind mediul fără ser AIM-V®.

Încercările ELISpot pot fi efectuate cu diverse materiale de membrană, inclusiv nitroceluloză (NC), ester de celuloză mixt (MCE) și fluorură de poliviniliden (PVDF). Am comparat rezultatele IFN-γ ELISpot din probele de PBMC de la șase persoane sănătoase (patru replici fiecare, două preparate pentru fiecare donator) utilizând cele mai frecvent utilizate plăci MCE, plăci PVDF și benzi PVDF de la Millipore (Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Germania). Membranele PVDF necesită o etapă de activare cu etanol înainte de legarea anticorpului de captură. În plus, au fost necesare etape de spălare mai riguroase înainte de dezvoltarea spoturilor folosind plăci pe bază de PVDF în comparație cu plăcile MCE, pentru a evita colorarea de fond nedorită a membranelor. Cu toate acestea, rezoluția spoturilor detectate în ceea ce privește claritatea și omogenitatea a fost îmbunătățită pe membranele PVDF (nu este prezentat), ceea ce a dus la un număr mai mare de spoturi în comparație cu membranele MCE (de până la 10 ori mai mult în cazul stimulărilor IE-1, cu o SFC mediană de 155 vs. 13/200 000 PBMC, respectiv; Fig. 5). Deoarece benzile PVDF cu 8 godeuri au fost mai performante și deoarece utilizarea lor ar putea permite reducerea costurilor, în special atunci când se testează probe de pacienți unici în rutina clinică, formatul PVDF cu 8 godeuri a fost ales pentru dezvoltarea optimizată a testului.

Încropirea optimă a plăcilor de microtitrare cu anticorpul de captare este crucială pentru o performanță robustă a testului. Densitatea anticorpului de captură IFN-γ legat de membrana PVDF nu ar trebui să fie limitativă și, în special, ar trebui să permită detectarea fiabilă a unui număr mare de spoturi. Benzile PVDF au fost acoperite cu concentrații crescânde (de la 2,5 la 7,5 μg/ml) de anticorp anti-IFN-γ. PBMC de la cinci donatori seropozitivi la CMV au fost însămânțate în godeurile acoperite și fie au fost lăsate nestimulate, fie stimulate cu T-activated® IE-1 sau pp65. În intervalul de 2,5 până la 7,5 μg/ml, creșterea concentrațiilor de anticorpi nu a avut niciun efect asupra colorării de fond în PBMC nestimulate (SFC mediană de 0 până la 0,5/200.000 PBMC indiferent de concentrația anticorpului de captare IFN-γ; figurile 6a-b). În mod similar, nivelurile SFC specifice IE-1 de la scăzut la moderat (mediane de 19 până la 26 SFC/200.000 PBMC) au fost comparabile în toate condițiile de acoperire cu anticorpi (Fig. 6a). Același lucru a fost valabil și pentru răspunsurile specifice pp65 până la ~300 SFC/200.000 PBMC (donatori d032, d120 și d241; Fig. 6c). În schimb, la donatorii individuali cu un număr mai mare de spoturi (de exemplu, d172, d202; Fig. 6c), detectarea celulelor reactive la pp65 a crescut într-o manieră dependentă de doză cu concentrația de anticorp de captare IFN-γ utilizat pentru acoperire, în special între 2,5 și 5 μg/ml de anticorp. La concentrații de anticorpi de 5 μg/ml și mai mult, numărul de spoturi a rămas stabil (Fig. 6b-c). Pe baza acestor rezultate, a fost aleasă o concentrație de 5 μg/ml de anticorp de captare IFN-γ pentru acoperire în protocolul ELISpot optimizat.

Sesizările ELISpot se bazează pe detectarea citokinei capturate de către anticorpi specifici pentru citokine, care pot fi fie cuplați direct la o enzimă reporter (dezvoltarea testului într-o singură etapă), cum ar fi fosfataza alcalină (AP), fie o combinație de un anticorp secundar biotinilat și o enzimă reporter conjugată cu streptavidină (dezvoltarea testului în două etape). O dezvoltare a testului într-o singură etapă economisește timp de manipulare și previne erorile operatorului. mAb-ul conjugat cu AP (7-B6-1) (MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Germania) a fost utilizat ca conjugat de detecție pentru protocolul ELISpot standardizat. Au fost testați diferiți parametri de incubație (de exemplu, 0,5 – 3 h la 37 °C, 2 h la temperatura camerei ). Numărul de spoturi a fost comparabil în toate condițiile. Cu toate acestea, morfologia spoturilor și, prin urmare, detectarea adecvată a fost cea mai bună la incubarea cu conjugatul AP timp de 2 h la RT, în comparație cu alte condiții (nu se arată). Creșterea concentrației conjugatului de detecție de la 0,025 la 0,4 U/ml a dus la valori mediane SFC ușor ridicate pentru pp65, iar numărul maxim de spoturi le-a depășit pe cele generate de dezvoltarea testului în două etape (nu se arată). Prin urmare, a fost aleasă o dezvoltare a testului într-o singură etapă timp de 2 h la RT cu 0,4 U/ml de conjugat de detecție.

În cele din urmă, standardizarea reacției de colorare SFC a fost abordată pentru a finaliza optimizarea testului. Durata incubării cu substratul AP afectează dimensiunea spotului și/sau nivelul de fond, fiind astfel esențială pentru o enumerare fiabilă a spoturilor. Ca soluție de colorare a fost utilizat un substrat cromogen de fosfatază alcalină NBT/BCIP (Thermo Fischer Scientific, Waltham, SUA) într-o singură etapă și au fost evaluate durate de incubare cuprinse între 2 și 13 minute în întuneric. Numărul de SFC a fost comparabil în toate condițiile. Cu toate acestea, timpii de incubație mai scurți au dus la un diametru mai mic al spotului, în timp ce timpii de incubație mai lungi au dus la creșterea nivelurilor de fond (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, a fost definită o durată de colorare de șase minute în întuneric pentru protocolul ELISpot optimizat.

Liniaritatea și precizia testului ELISpot CMV optimizat

Protocolul ELISpot optimizat a fost utilizat pentru a determina intervalul de lucru al PBMC care asigură liniaritatea testului. PBMC de la un donator sănătos seropozitiv la CMV au fost însămânțate la o densitate cuprinsă între 2 × 104 și 2,5 × 105 PBMC pe puț. Pentru un număr de celule cuprins între 6 × 104 și 2 × 105 PBMC pe puț, numărul de celule ELISpot a fost direct proporțional cu numărul de PBMC însămânțate, în urma stimulării fie cu IE-1 (analiză de regresie liniară; R2 = 0,97), fie cu pp65 (R2 = 0,99) (Fig. 7a). Din cauza numărului de spoturi, de obicei mai mic, care rezultă în urma stimulării cu IE-1, s-a ales utilizarea a 2 × 105 PBMC pe gode pentru testul ELISpot standardizat, pentru a asigura valori SFC suficiente.

Pentru a verifica în continuare liniaritatea dintre numărul de celule efectoare reactive la CMV și SFC numărate, au fost însămânțate numere din ce în ce mai mari de PBMC de la un donator sănătos seropozitiv la CMV și numărul total de PBMC a fost ajustat la 2 x 105 pe gode folosind PBMC de la un donator seronegativ la CMV. Pentru aceste experimente au fost alese două perechi de donatori (d034 + d219, d204 + d067) care nu au prezentat alo-reactivitate într-o co-cultura de 19 ore. Din cauza numărului scăzut de SFC (sub 20 SFC/200 000 PBMC), rezultatele stimulării IE-1 au prezentat o variabilitate crescută în comparație cu pp65 și nu au permis un calcul fiabil al liniarității (valori R2 sub 0,96; datele nu sunt prezentate). Rezultatele testului ELISpot în urma stimulării pp65 au arătat o bună corelație liniară pentru ambele perechi de donatori, cu valori R2 de 0,99 (d034 + d219) și 0,98 (d204 + d067) în analiza de regresie liniară (Fig. 7b).

Precizia și repetabilitatea testului optimizat au fost evaluate prin calcularea variabilității intra-teste, inter-teste, inter-operator și inter-site. În fiecare caz, PBMC de la trei donatori sănătoși seropozitivi la CMV au fost testate în patru exemplare, iar variabilitatea a fost evaluată prin calcularea coeficientului de variație (CV), definit ca raportul dintre deviația standard și medie. CV pentru valorile ELISpot < 10 SFC/200.000 PBMC nu au fost calculate (a se vedea calculul pragului de pozitivitate de mai jos). CV intra-eseu a atins 14 % pentru stimularea IE-1 și 6 % pentru stimularea pp65 (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). CV inter-teste nu a depășit 17% pentru IE-1 și 22% pentru pp65 (Fișier suplimentar 1: Tabelul S2). CV inter-operator a fost sub 13% și 18% pentru IE-1 și, respectiv, pp65 (Fișier suplimentar 1: Tabelul S3). În cele din urmă, a fost evaluată variația inter-site, care este esențială pentru validarea testelor în scopuri de diagnosticare. Probele de sânge integral au fost colectate simultan de la trei donatori sănătoși seropozitivi la CMV și expediate (în condiții constante la RT) la patru laboratoare diferite din Germania. PBMC au fost proaspăt izolate și testele ELISpot au fost efectuate în conformitate cu protocolul optimizat de către un total de 7 operatori. CV inter-site a atins un maxim de 39% pentru IE-1 și de 28% pentru pp65 (Fișier suplimentar 1: Tabelul S4).

Evaluarea a cel puțin patru măsurători independente a fost recomandată pentru a obține rezultate ELISpot semnificative din punct de vedere statistic . Pentru a aborda influența variațiilor intra-replicat asupra rezultatului testului, am comparat rezultatele ELISpot ale măsurătorilor în cinci și patru exemplare pentru fiecare control și stimulare antigenică. Nu s-a constatat nicio variație semnificativă a rezultatelor testelor (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, măsurătorile în patru exemplare ale condițiilor nestimulate și stimulate cu T-activat® IE-1 și pp65 permit fiabilitatea testului, precum și practicabilitatea în combinație cu utilizarea benzilor cu 8 godeuri.

Enterotoxina stafilococică B (SEB) este un superantigen puternic, iar fitohemaglutinina (PHA) un mitogen puternic, ambele inducând o secreție masivă de IFN-γ de către celulele T . Astfel, SEB și PHA sunt controale pozitive adecvate pentru viabilitatea celulară, stimularea cu succes a secreției de citokine și funcționalitatea generală a celulelor T. Acest lucru este deosebit de important pentru interpretarea rezultatelor în cazul în care se așteaptă o frecvență scăzută a celulelor T, de exemplu la beneficiarii de transplanturi alogene de celule stem. În testul ELISpot optimizat, stimulările probelor de testare fie cu SEB, fie cu PHA sunt efectuate în dublu exemplar.

În plus, a fost stabilit un control operator independent de celulele efectoare pentru a valida performanța adecvată a testului. Acest control al operatorului se bazează pe detectarea IFN-γ recombinant la incubarea directă cu anticorpul de captură imobilizat anti-Human-IFN-γ mAb (1-D1K). Acest control, efectuat, de asemenea, în dublu exemplar, ar trebui să producă o colorare întunecată omogenă a membranei PVDF.

Validare tehnică a testului: definirea unui cut-off de pozitivitate

Pentru a facilita interpretarea rezultatelor testului IFN-γ ELISpot și pentru a maximiza specificitatea (adică pentru a evita falsurile pozitive în condiții nestimulate și în condiții stimulate la persoanele CMV-seronegative), a fost definit un cut-off tehnic. Testele IFN-γ ELISpot au fost efectuate în conformitate cu protocolul optimizat pe PBMC de la 45 de donatori sănătoși, dintre care 32 au fost seropozitivi la CMV IgG (tabelul 1).

Mediana și intervalul valorilor SFC din PBMC nestimulate ale persoanelor seronegative la CMV și seropozitive la CMV au fost comparabile . Numărul de spoturi din PBMC stimulate cu IE-1 și pp65 ale subiecților seronegativi la CMV a fost scăzut . La persoanele seropozitive la CMV, nivelurile SFC din PBMC stimulate cu IE-1 și pp65 au atins 1114 și 954 de spoturi/200.000 PBMC (mediana de 22 și, respectiv, 265; Fig. 8). Pentru determinarea unui cut-off tehnic, au fost luate în considerare numărul de spoturi în controlul nestimulat, precum și în condițiile de stimulare cu T-activat® pp65 și IE-1 ale persoanelor seronegative la CMV și seropozitive la CMV. Pragul de pozitivitate a fost determinat cu ajutorul statisticilor z (nivel α = 0,05) pe valorile medii geometrice transformate în log10. Valorile = 0 au fost înlocuite cu valori apropiate de limita de detecție, care a fost considerată a fi 0,5. Abaterea standard (SD) a măsurătorilor ELISpot pentru controlul nestimulat, stimularea IE-1 și stimularea pp65 a fost de 0,234, 0,192 și, respectiv, 0,136. Luând în considerare un SD de 0,2 și presupunând că se măsoară 4 replici pentru fiecare probă de control negativ și probă de test, s-a calculat un criteriu conform căruia raportul dintre mediile geometrice ale valorilor stimulate și nestimulate este de cel puțin 2,5. Pe de altă parte, profilele de precizie au fost generate atât din rezultatele testelor specifice IE-1, cât și din rezultatele testelor specifice pp65, prin care un coeficient de variație (CV) nu mai mare de 40 % a fost utilizat ca limită de acceptare a validității analizei pentru a determina limita de cuantificare (LoQ) respectivă. Profilurile de precizie pentru rezultatele ELISpot specifice IE-1 și pp65 de la cei 45 de donatori sănătoși au dat valori LoQ de 8,6 și, respectiv, 7,1 (Fișier suplimentar 2). De remarcat, o analiză similară efectuată pe o cohortă de 124 de pacienți cu hemodializă a furnizat valori SD comparabile în condiții nestimulate și stimulate cu antigen (interval 0,199-0,240) și a dat valori LoQ de 7,8 (IE-1) și 8,3 (pp65) . Pe baza acestor analize, a fost ales un cut-off de 10 SFC/200.000 PBMC pentru a defini rezultatele pozitive ale testului.

În total, utilizând antigene pp65 și IE-1 activate cu T-activated® și testul IFN-γ ELISpot optimizat, rezultatele testelor sunt considerate pozitive dacă media geometrică a spoturilor rezultate în urma stimulării pp65 sau IE1 este ≥ 10 SFC/200.000 PBMC și dacă raportul dintre mediile geometrice ale condițiilor stimulate și cele nestimulate este ≥ 2.5. Conform acestor definiții, colectivul de 45 de donatori sănătoși (32 CMV IgG-seropozitivi, 13 CMV IgG-seronegativi) a evidențiat o sensibilitate (definită ca acordul pozitiv cu serologia CMV IgG-serologie, utilizată ca procedură de măsurare de referință primară) de 97% și o specificitate (acordul negativ cu serologia CMV IgG-serologie) de 85% (Fig. 8).

Validarea testului funcțional: Antigenele T-activate stimulează un spectru larg de celule efectoare reactive la CMV relevante din punct de vedere clinic

Proteinele recombinante (T-activate®) formulate în uree sunt procesate atât de căile de procesare și prezentare a antigenului exogen (MHC clasa II), cât și de cele endogene (MHC clasa I) . Stimularea PBMC cu proteine T-activated® reproduce astfel mai îndeaproape o infecție naturală, ceea ce poate duce la activarea unui spectru larg de celule reactive la CMV relevante din punct de vedere clinic (de exemplu, celule Th, CTL, NK, NKT; ), ceea ce ar putea contribui la sensibilitatea ridicată a testului IFN-γ ELISpot. Pentru a caracteriza în continuare celulele vizate de antigenele T-activate® IE-1 și pp65 și pentru a investiga posibila variabilitate interindividuală a răspunsului celulelor efectoare, s-au efectuat analize de colorare cu IFN-γ intracelular și analize prin citometrie de flux în paralel cu testele IFN-γ ELISpot. PBMC proaspăt izolate de la șase donatori sănătoși seropozitivi la CMV au fost stimulate cu proteine T-activate® IE-1 și pp65 timp de 19 h, iar celulele producătoare de IFN-γ au fost numărate în conformitate cu testul ELISpot optimizat. Aceleași preparate de PBMC (4 replici fiecare) au fost stimulate timp de 6 h cu același lot de proteine T-activated® IE-1 și pp65 în prezența anticorpilor antistimulatori anti-CD28 și anti-CD49d. Markerii de suprafață (CD3, CD4, CD8, CD56) și colorarea intracelulară a IFN-γ au fost analizați prin citometrie în flux, așa cum este descris în secțiunea Metode. Subpopulațiile IFN-γ+ de limfocite CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3+CD56+ (de tip NKT) și CD3-CD56+ (NK) au fost numărate în conformitate cu strategia de gating ilustrată în fișierul suplimentar 3. Toți cei șase donatori au fost diferiți în ceea ce privește capacitatea lor de a declanșa un răspuns dependent de IE-1 și/sau pp65 în testul IFN-γ ELISpot. Intensitatea răspunsului a fost, de asemenea, eterogenă între cei șase donatori, cu valori cuprinse între 7 și 1 054 SFC (stimulare IE-1) și între 28 și 780 SFC (stimulare pp65) la 200 000 PBMC (Fig. 9a). În mod similar, donatorii individuali au fost diferiți în ceea ce privește frecvența și raportul diferitelor subpopulații de celule investigate prin citometrie în flux (Fig. 9b). Este interesant faptul că indivizii sănătoși seropozitivi la CMV cu un număr mai mic de spoturi (d120, d300, d343; Fig. 9a) au prezentat, de asemenea, frecvențe mai mici de limfocite IFN-γ+ prin citometrie de flux (Fig. 9b), subliniind capacitatea testului ELISpot de a distinge respondenții cu răspuns scăzut de cei cu răspuns ridicat. Activarea fiecărei subpopulații de limfocite investigate a fost detectată la unii, dar nu la toți donatorii. De exemplu, activarea slabă până la puternică a celulelor T CD4+ a fost detectată la 4 din 6 donatori (d120, d172, d300, d343) ca răspuns fie la IE-1, fie la pp65, fie la ambele. În mod similar, 5 din 6 donatori (d172, d290, d300, d343, d361) au prezentat o activare a celulelor T CD8+ în una sau ambele condiții de stimulare. CD3-CD56+ (celule NK) au fost evidente la un donator (d120) ca răspuns la ambele antigene. Celulele CD3+CD56+ (de tip NKT) au fost slab activate la 4 din 6 indivizi (d120, d172 d300, d361) ca răspuns atât la IE-1, cât și la pp65 (Fig. 9b). În mod remarcabil, o puternică activare CD4+ specifică pp65 la d172 s-a corelat cu un răspuns puternic specific pp65 în ELISpot, iar o puternică activare CD8+ specifică pp65 (d290) și IE-1 (d361) a fost asociată cu un număr mare de spoturi în ELISpotul corespunzător (Fig. 9a-b), sugerând că aceste celule efectoare reactive la CMV contribuie în mod semnificativ la semnalele ELISpot detectate. În ansamblu, aceste date demonstrează capacitatea proteinelor T-activated® IE-1 și pp65 de a stimula o gamă largă de celule efectoare specifice CMV. Aceste experimente au evidențiat, de asemenea, eterogenitatea ridicată a răspunsurilor în rândul persoanelor sănătoase seropozitive la CMV. În special, observația că unele persoane răspund fie la IE-1, fie la pp65 subliniază importanța evaluării răspunsului la ambele antigene. Monitorizarea atât a răspunsurilor specifice IE-1, cât și a răspunsurilor specifice pp65 în testul ELISpot IFN-γ optimizat ar putea îmbunătăți sensibilitatea generală a testului.

.