DDRGK1 este necesar pentru homeostazia RE
Pentru a înțelege funcția celulară a DDRGK1, am examinat efectele eliminării DDRGK1 folosind un amestec de două siARN-uri, așa cum a fost descris anterior21. Am constatat că knockdown-ul DDRGK1 a indus moartea celulară apoptotică atât în celulele MCF7, cât și în celulele HepG2, caracterizată prin colorarea cu Annexin V/PI (Fig. 1a), activarea caspazei-3 și scindarea PARP (Fig. 1b). Trebuie remarcat faptul că putem detecta clivarea capspazei-3 în celulele HepG2 indusă de knockdown-ul DDRGK1, dar nu și în celulele MCF7, deoarece celulele MCF7 sunt deficitare în caspază-322. Analiza cantitativă PCR în timp real (Q-PCR) a arătat că reducerea DDRGK1 a crescut expresia genelor proapoptotice BAX, BAK, NOXA, DR5 și Bid, în timp ce expresia genei antiapoptotice Bcl-2 a fost redusă (Fig. 1c,d). În mod important, am constatat că reducerea DDRGK1 în celulele MCF7 și HepG2 a indus răspunsuri de stres ER, cu creșterea expresiei genelor specifice stresului ER ale BiP, HSPA8 și CHOP (Fig. 1e,f).
Pentru a confirma în continuare că DDRGK1 este implicată în răspunsul la stresul ER, am determinat efectul DDRGK1 asupra supraviețuirii celulelor după tratamentul cu inductorii de stres ER thapsigargin (Tg) și tunicamicină (Tm). Eliminarea DDRGK1 a îmbunătățit apoptoza indusă de stresul ER prin tratamentul cu Tg atât în celulele HepG2, cât și în celulele MCF7, evaluată prin colorarea cu Annexin V/PI și prin scindarea caspazei-3 și a PARP (Fig. 2a-c și Fig. suplimentară 1A-C). În schimb, supraexprimarea DDRGK1 a redus moartea celulară indusă de stresul ER în celulele HepG2 (Fig. 2d-f). În plus, viabilitatea celulelor MCF7 a fost evaluată prin testul MTT, iar rezultatele au arătat că knockdown-ul DDRGK1 a făcut celulele mai sensibile la tratamentul cu Tg sau Tm, cu o viabilitate celulară redusă (Fig. suplimentară 1D), în timp ce supraexpresia DDRGK1 a favorizat supraviețuirea celulelor după tratamentul cu Tg sau Tm (Fig. suplimentară 1E). Luate împreună, rezultatele noastre sugerează că DDRGK1 joacă un rol vital în reglarea homeostaziei ER.
DDRGK1 modulează UPR
Pentru a înțelege modul în care DDRGK1 reglează omoeostazia ER, am analizat mai întâi modificările nivelurilor proteice a trei senzori UPR și a țintelor lor din aval în celulele cu DDRGK1 epuizate. Rezultatele au arătat că knockdown-ul DDRGK1 în celulele MCF7 și HepG2 a redus semnificativ nivelurile de IRE1α total, dar a scăzut slab IRE1α fosforilat (p-IRE1α), ceea ce poate fi din cauza nivelurilor reduse de IRE1α total (Fig. 3a). Nivelurile de ATF6 și ATF6 scindat nu au fost afectate (Fig. 3a). În mod interesant, knockdown-ul DDRGK1 nu a afectat nivelurile de PERK total, dar nivelurile de PERK fosforilat (p-PERK) și BiP au fost semnificativ crescute (Fig. 3a). Am examinat apoi efectele reducerii DDRGK1 asupra substratului IRE1α XBP1. Rezultatele au arătat că XBP1s, o formă splicată a XBP1, a fost semnificativ diminuată în celulele MCF7 cu DDRGK1-knockdown într-o manieră dependentă de timp (Fig. 3b), care a fost corelată cu modificări ale nivelurilor de proteine IRE1α (Fig. suplimentară 2A). În plus, diminuarea DDRGK1 a crescut nivelurile de fosforilare a eIF2α (p-eIF2α) și expresia CHOP atât în celulele MCF7, cât și în celulele HepG2 (Fig. suplimentară 2B). Aceste rezultate indică faptul că epuizarea DDRGK1 reprimă semnalizarea UPR-IRE1α și activează calea apoptotică UPR-PERK, care, în consecință, declanșează apoptoza, așa cum s-a observat în figurile 1 și 2. Cu toate acestea, nivelul de IRE1α a crescut în celulele care supraexprimă DDRGK1 într-o manieră dependentă de doză (Fig. 3c), în timp ce nivelurile de p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP și forma splicată a XBP1 nu au fost modificate în mod semnificativ (Fig. 3c; Fig. Suplimentară 2C și D). Pentru a explora relația funcțională dintre DDRGK1 și UPR, am evaluat modificările dinamice ale IRE1α și PERK în celulele MCF7 DDRGK1-knockdown și în celulele de control în urma tratamentului cu Tg la diferite momente de timp. Tratamentul cu Tg a crescut nivelurile de IRE1α și p-IRE1α, p-PERK și BiP în celulele de control, așa cum era de așteptat. Cu toate acestea, nivelurile totale de IRE1α au scăzut semnificativ (0-24 h), în timp ce nivelurile de p-IRE1α au scăzut modest (4-24 h) în celulele sărăcite de DDRGK1 în comparație cu celulele de control (Fig. 3d). Concomitent, nivelul de XBP1s a fost scăzut în celulele sărăcite de DDRGK1 în comparație cu celulele de control (4-12 h) (Fig. 3e) (Fig. 3e). Nivelurile de PERK total nu s-au modificat, dar p-PERK a crescut semnificativ în celulele lipsite de DDRGK1 (0-12 h) (Fig. 3d). Rezultate similare au fost obținute în celulele HepG2 (Fig. suplimentare 2E și F). Luate împreună, rezultatele noastre sugerează că epuizarea DDRGK1 determină degradarea IRE1α și activarea PERK.
DDRGK1 reglează UPR prin direcționarea IRE1α
UPR este declanșată de senzorii de stres ER în cazul stresului ER pentru a regla homoeostazia ER8. S-a raportat că deleția specifică hepatocitară a IRE1α la șoareci a dus la activarea căii UPR-PERK23. Pentru a aborda dacă inducerea p-PERK observată în celulele sărăcite de DDRGK1 a fost mediată de scăderea nivelurilor de IRE1α, am examinat nivelurile de p-PERK, PERK și țintele sale din aval în celulele sărăcite de IRE1α. Rezultatele au arătat că knockdown-ul IRE1α a crescut semnificativ nivelurile proteice ale p-PERK și p-eIF2α atât în celulele MCF7, cât și în celulele HepG2 (Fig. 4a), similar cu cele observate în celulele cu DDRGK1-depletate (Fig. 3a; Fig. suplimentară 2B). Aceste rezultate indică faptul că DDRGK1 reglează UPR prin direcționarea IRE1α. Am investigat apoi modul în care DDRGK1 reglează IRE1α. Rezultatele noastre au arătat că nivelurile de proteine IRE1α, dar nu și nivelurile de ARNm (Fig. Suplimentară 3A), au scăzut dramatic în celulele DDRGK1-knockdown (Fig. 3a). Tratamentul celulelor cu inhibitorul de proteazom MG132 a blocat reducerea mediată de DDRGK1 a proteinei IRE1α (Fig. 4b; Fig. Suplimentară 3B). Mai mult, am observat că epuizarea DDRGK1 a redus dramatic timpul de înjumătățire a IRE1α într-un test de urmărire cu cicloheximidă (Fig. 4c). În concordanță cu aceste observații, am constatat că expresia ectopică a IRE1α a îmbunătățit supraviețuirea celulară atât în celulele MCF7, cât și în celulele HepG2 sărăcite de DDRGK1, comparativ cu celulele de control, caracterizată prin colorarea cu Annexin V/PI și activarea caspazei-3 (Fig. 4d,e; Fig. suplimentare 3C și D). În ansamblu, aceste rezultate sugerează că DDRGK1 reglează stabilitatea lui IRE1α și, astfel, reglează UPR.
DDRGK1 interacționează cu IRE1α
Pentru a înțelege modul în care DDRGK1 reglează stabilitatea IRE1α, am testat dacă DDRGK1 interacționează cu IRE1α prin intermediul unui test de imunoprecipitare reciprocă (IP) în celule HEK293T. Rezultatele au arătat că Flag-IRE1α exprimat exogen interacționează în mod specific cu DDRGK1 endogenă și BiP (Fig. 5a). În mod consecvent, Flag-DDRGK1 exprimat în mod exogen a interacționat în mod specific cu IRE1α endogenă și cu proteina C53 asociată DDRGK1 cunoscută (ref. 14). Cu toate acestea, nu am reușit să detectăm BiP în imunoprecipitatele Flag-DDRGK1 (Fig. 5b), ceea ce sugerează că este posibil ca DDRGK1 să nu interacționeze direct cu BiP. IRE1α, ca substrat endogen de degradare asociată cu ER (ERAD), este degradat prin asocierea dintre IRE1α și complexul ERAD Sel1L-Hrd1 într-o manieră dependentă de BiP24. Prin urmare, am examinat dacă BiP este implicat în interacțiunea dintre DDRGK1 și IRE1α. Rezultatele au arătat că interacțiunea dintre DDRGK1 și IRE1α nu a fost afectată de knockdown-ul lui BiP (Fig. suplimentară 4). Pentru a confirma în continuare interacțiunea DDRGK1 cu IRE1α, am efectuat experimente de colorare prin imunofluorescență. Rezultatele au arătat că aceste două proteine s-au co-localizat în ER (Fig. 5c). Pentru a cartografia regiunea implicată în interacțiunea IRE1α cu DDRGK1, am co-transfectat Flag-IRE1α de tip sălbatic și mutanți de trunchiere împreună cu DDRGK1 în celule HEK293T, iar rezultatele IP au arătat că domeniul kinazic citoplasmatic al IRE1α a fost necesar pentru interacțiunea sa cu DDRGK1 (Fig. 5d). Pentru a înțelege modificările dinamice în interacțiunea dintre DDRGK1 și IRE1α în condiții de stres ER, celulele HEK293T au fost transfectate cu Flag-DDRGK1 și tratate cu Tg pentru diferite momente de timp. După cum era de așteptat, am observat că IRE1α total, p-IRE1α și BiP au crescut semnificativ în condiții de stres ER. Interesant, am constatat că DDRGK1 a interacționat în mod specific cu IRE1α nefosforilat, dar nu cu p-IRE1α, în imunoprecipitate (Fig. 5e). Aceste rezultate sugerează că DDRGK1 interacționează cu și menține stabilitatea IRE1α nefosforilat.
Ufm1 este necesar pentru interacțiunea dintre DDRGK1 și IRE1α
Un studiu recent a demonstrat că DDRGK1 este un substrat de ufmiilare și este necesar pentru ufmiilarea ASC115,20. Pentru a investiga dacă ufmiilarea este implicată în reglarea stabilității IRE1α de către DDRGK1, am examinat dacă depleția Ufm1 afectează expresia proteinei IRE1α. Similar cu depleția DDRGK1, am observat că reducerea expresiei Ufm1 a redus dramatic nivelurile de proteină IRE1α (Fig. 6a), ceea ce indică faptul că DDRGK1 reglează IRE1α prin ufmiilare. În mod consecvent, am constatat că supraexpresia DDRGK1 nu a reușit să stabilizeze proteina IRE1α în celulele MCF7 Ufm1-knockdown comparativ cu celulele de control (Fig. 6b). În plus, nivelurile proteinei IRE1α au scăzut dramatic în celulele MCF7 Ufm1-knockdown atât în absența cât și în prezența Tg (Fig. 6c), ceea ce sugerează că ufmitilarea este necesară pentru reglarea stabilității proteinei IRE1α de către DDRGK1. Ne-am întrebat apoi dacă IRE1α este supusă modificării prin ufmiilare. Pentru a răspunde la această întrebare, am detectat ufmiilarea IRE1α în celulele care exprimă DDRGK1 și Ufm1, precum și UBA5 (E1), UFC1 (E2) și UFL1 (E3), așa cum am descris anterior20. Cu toate acestea, nu am reușit să detectăm nicio ufmiilare a proteinei IRE1α, deși ufmiilarea proteinei DDRGK1 a fost ușor detectabilă, așa cum s-a descris anterior (datele nu sunt prezentate)15,20,25, ceea ce sugerează că IRE1α ar putea să nu fie o țintă a ufmiilării. În mod interesant, am constatat că asocierea dintre DDRGK1 și IRE1α a fost semnificativ diminuată în celulele HEK293T cu Ufm1-knockdown în comparație cu celulele de control (Fig. 6d). În concordanță cu această observație, am constatat că interacțiunea DDRGK1 K267R (un mutant DDRGK1 deficitar în ufmiilare, în care reziduul de lizină 267 a fost înlocuit cu un reziduu de arginină)15 cu IRE1α a fost dramatic diminuată în comparație cu DDRGK1 de tip sălbatic (Fig. 6e), ceea ce indică faptul că ufmiilarea DDRGK1 este necesară pentru asocierea dintre DDRGK1 și IRE1α. Mai mult, DDRGK1 K267R nu a reușit să stabilizeze proteina IRE1α în comparație cu DDRGK1 de tip sălbatic (Fig. 6f). Luate împreună, aceste rezultate sugerează că ufmitilarea DDRGK1 la K267 este necesară pentru interacțiunea sa cu IRE1α și pentru reglarea stabilității proteinei IRE1α.
DDRGK1 este necesar pentru capacitatea de reconstituire a HSC la șoareci
Un studiu recent a sugerat că celulele stem hematopoietice (HSC) sunt extrem de sensibile la stresul ER26. Acest lucru ne-a determinat să speculăm că DDRGK1 ar putea fi esențială în funcția HSC. Am determinat mai întâi nivelul de expresie al DDRGK1 în mai multe linii hematopoietice de la șoareci de tip sălbatic în vârstă de 2 luni. Q-PCR a evidențiat un nivel semnificativ mai ridicat al expresiei DDRGK1 în HSC, inclusiv HSC pe termen lung (LT-HSC), HSC pe termen scurt (ST-HSC) și progenitori multipotenți (MPP) (Fig. 7a). În plus, nivelul proteic al DDRGK1 a fost puternic exprimat în celulele de măduvă osoasă (BM) îmbogățite cu celule HSC Lineage-c-Kit+ în comparație cu celulele BM Lineage+c-Kit- (Fig. 7b). Aceste observații sugerează un rol important al DDRGK1 în celulele stem. Pentru a examina rolul DDRGK1 în funcția HSC, au fost efectuate experimente de transplant competitiv cu HSC în urma eliminării lentivirale a DDRGK1 (Fig. 7c). Celulele Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) de la șoareci donatori CD45.1 au fost transplantate cu lentivirusul de control sau cu lentivirusul DDRGK1-knockdown și transplantate în șoareci receptori CD45.2 iradiați letal. Analiza citometrică în flux a arătat că procentul de celule din sângele periferic (PB) provenite de la donator a fost semnificativ redus în grupul DDRGK1-knockdown în comparație cu grupul de control, ceea ce indică faptul că knockdown DDRGK1 a afectat în mod semnificativ capacitatea de reconstituire competitivă a CSH (Fig. 7d). Deși într-un experiment de transplant necompetitiv, șoarecii receptori transplantați cu CSH DDRGK1-knockdown erau încă în viață la 3 luni după transplant, acest lucru sugerează că knockdown DDRGK1 a compromis doar capacitatea de reconstituire competitivă a CSH. Pentru a exclude efectele în afara țintei, am proiectat un alt ARNhc care vizează DDRGK1 și am observat rezultate similare (Fig. suplimentară 5A). La trei luni după transplant, șoarecii primitori au fost eutanasiați pentru analiza BM și pentru testele de formare de colonii in vitro. Analiza citometrică în flux a arătat că knockdown-ul DDRGK1 a afectat în mod dramatic menținerea celulelor HSC transcedate, fără a afecta potențialul lor de linie (adică liniile mieloide, de celule B și de celule T), după cum indică o frecvență scăzută a celulelor stem și progenitoare hematopoietice derivate de la donator, precum și a celulelor hematopoietice diferențiate în BM și PB (Fig. 7e). Un rezultat similar a fost observat într-un experiment independent folosind un alt ARNhc care vizează DDRGK1 (Fig. 5B suplimentară). În plus, am izolat celulele CD34-Flt3-LSK derivate de la donator (LT-HSCs) de la șoarecii primitori și am efectuat un test de formare de colonii unicelulare. Rezultatele au arătat că knockdown-ul DDRGK1 a afectat capacitatea HSC-urilor de a forma colonii intermediare și mari (Fig. 7f). În ansamblu, aceste date sugerează că DDRGK1 este necesară pentru menținerea funcției HSC.
Pentru a examina dacă afectarea funcției HSC se datorează unei eficiențe reduse de homing, am marcat cu colorant fluorescent (violet) celulele LSK de control sau sh-DDRGK1 transducute lentiviral, purificate de la șoareci în vârstă de 2 luni, și le-am injectat în receptori iradiați letal. Procentul de celule LSK marcate prezente în BM al primitorului la 18 ore după transplant a fost analizat prin citometrie în flux. Rezultatele au arătat că abilitatea de deplasare a celulelor LSK cu DDRGK-knockdown a fost comparabilă cu cea a celulelor de control (Fig. suplimentară 6A și B). Pentru a determina dacă knockdown DDRGK1 a avut un efect asupra stării ciclului celular al celulelor LSK, am colorat celulele LSK de control derivate de la donator și celulele LSK DDRGK1-knockdown cu markerul de proliferare Ki67 și DAPI și nu am constatat nicio diferență semnificativă în profilurile ciclului celular între HSC DDRGK1-knockdown și HSC de control (Fig. suplimentară 7A). Am examinat apoi efectul DDRGK1-knockdown asupra apoptozei HSC-urilor utilizând colorarea cu Annexin V și am constatat o frecvență semnificativ mai mare de apoptoză în celulele LSK DDRGK1-knockdown provenite de la donator în comparație cu celulele LSK de control; acest fenomen a fost observat cu ambele ARNhc care vizează DDRGK1 (Fig. 8a; Fig. Suplimentară 7B). În continuare, am examinat nivelurile de specii reactive de oxigen (ROS) în HSC-urile transduși. Rezultatele au arătat că nivelul ROS a fost comparabil între grupurile de control și cele cu DDRGK1-knockdown (Fig. suplimentară 7C). Pe baza observațiilor de mai sus, am concluzionat că knockdown-ul DDRGK1 în HSC-uri a indus moartea celulară apoptotică, afectând astfel funcția HSC.
Pentru a investiga dacă afectarea funcției HSC s-a datorat activării răspunsului la stresul ER în HSC DDRGK1-knockdown, am analizat nivelurile de expresie ale BiP și CHOP prin Q-PCR în HSC grefate de control și DDRGK-knockdown, rezultatele au arătat că nivelurile de ARNm ale BiP și CHOP au fost semnificativ crescute în HSC DDRGK1-knockdown (Fig. 8b). În plus, am examinat nivelurile de proteine ale senzorilor de stres ER în celulele BM Lineage-c-Kit+ de control și DDRGK-knockdown. În conformitate cu observația din liniile celulare canceroase, knockdown-ul DDRGK1 a arătat o scădere a nivelurilor proteice ale IRE1α și p-IRE1α și o creștere a nivelului de p-PERK, în timp ce nivelurile ATF6 nu au fost diferite în grupurile de control și DDRGK1-knockdown (Fig. 8c). În mod consecvent, nivelul de XBP1s a fost scăzut în celulele LSK DDRGK1-knockdown provenite de la donator (Fig. 8d). Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că knockdown-ul DDRGK1 a afectat semnalizarea IRE1α, dar a activat calea PERK și sprijină în continuare faptul că DDRGK1 este esențială pentru menținerea corectă a homeostaziei ER și, prin urmare, este esențială pentru supraviețuirea și menținerea celulelor HSC.
.