Izolație bacteriană și identificare RdFucI

O colonie care s-a dezvoltat în mediul care conținea l-fucoidan provenit din Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) ca unică sursă de carbon a fost izolată dintr-un intestin de abalone recoltat în Coreea de Sud (Fișier suplimentar 1: Fig. S1). Compararea identității secvenței bazate pe ARN ribozomal 16S cu baza de date NCBI a arătat că izolatul era apropiat din punct de vedere filogenetic de membrii genului Raoultella (Fișier suplimentar 1: Fig. S1). Astfel, tulpina izolată a fost identificată ca fiind Raoultella sp. KDH14. După efectuarea secvențierii complete a genomului, RdFucI a fost identificat din Raoultella sp. KDH14 pe baza identității secvenței genei.

RdFucI este compus din 595 de aminoacizi cu o masă moleculară de 65,5 kDa și un punct izoelectric de 5,5. Rezultatele instrumentului de căutare a alinierii locale de bază (BLAST) au indicat identitatea de secvență ridicată a RdFucI (> 90%) cu alte l-FucI din diferite bacterii aparținând familiilor Raoultella, Klebsiella și Citrobacter.

RdFucI identificat a fost supraprodus în E. coli BL21(DE3) cu marcajul hexa-histidină N-terminal și purificat prin cromatografie de afinitate his-tag. Atunci când a fost analizată prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE), o singură bandă a apărut în jurul valorii de 65 kDa, în concordanță cu masa moleculară calculată a subunității monomere.

Reacția catalizată de RdFucI favorizează formarea de l-fucoză

Pentru a examina activitatea de izomerază a RdFucI, reacția enzimatică a fost realizată cu l-fucoză sau l-fuculoză ca substrat (Fig. 2). Au fost determinate activitățile enzimatice pentru reacțiile directe (de la l-fucoză la l-fuculoză) și inverse (de la l-fucoză la l-fucoză). Producerea de l-fuculoză din l-fucoză a fost confirmată prin cromatografie în strat subțire (TLC) și analiză prin cromatografie în fază gazoasă/spectrometrie de masă (GC/MS) (Fișier suplimentar 2: Fig. S2). În interconversia dintre l-fucoză și l-fuculoză, nu s-a observat niciun produs secundar, ceea ce înseamnă că un substrat generează un singur produs (Fișier suplimentar 2: Fig. S2). Astfel, considerăm că este rezonabil să folosim cantitatea calculată de concentrație de l-fucoză prin măsurarea experimentală a cantității de l-fucoză.

Conversia enzimatică a l-fucozei în l-fucoză (reacție directă) și b a l-fucozei în l-fucoză (reacție inversă) de către RdFucI. Reacția enzimatică a fost realizată de 3 µg de RdFucI cu a l-fucoză sau b l-fucoză la 10 mM ca substrat de pornire la 30 °C timp de 10 minute în 20 mM de fosfat de sodiu (pH 7,0) în prezența a 1 mM de Mn2+. Concentrația de l-fucoză a fost măsurată experimental, iar concentrația de l-fucoză a fost calculată prin scăderea concentrației de l-fucoză determinată experimental din concentrația totală de zahăr (10 mM). Datele experimentale reprezintă mediile ± abaterile standard a trei repetiții

Reacția inversă a fost de 6,6 ori mai rapidă decât reacția directă, iar activitatea specifică pentru l-fuculoză (63,9 U/mg) a fost mai mare decât cea pentru l-fucoză (9,6 U/mg). În ambele reacții, raportul de echilibru între l-fucoză și l-fuculoză, care a fost determinat experimental, a fost de aproximativ 9:1, obținându-se astfel o constantă de echilibru (Keq) de 0,11. Valoarea Keq a fost, de asemenea, determinată teoretic ca fiind de 0,23, pe baza relației termodinamice a variației standard a energiei libere Gibbs a reacției și a Keq la echilibru, \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{\text{eq}}\), unde R și T reprezintă constanta gazelor (8,314 J/mol K) și, respectiv, temperatura (K). \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ }\) reprezintă modificarea standard a energiei libere Gibbs pentru reacția de transformare a l-fucozei în l-fuculoză (0,859993 kcal/mol), care este listată în baza de date BioCyc (https://biocyc.org). Au existat unele discrepanțe între valorile experimentale și teoretice ale Keq. Un Keq < 1 indică faptul că reacția inversă este favorizată. Izomerizarea catalizată de RdFucI a favorizat reacția inversă, producând l-fucoză din l-fuculoză cu un randament de aproximativ 90% la 30 °C și pH 7.

Efectul temperaturii și al pH-ului asupra activității lui RdFucI și a echilibrului

Reacțiile enzimatice au fost efectuate la diferite temperaturi cuprinse între 10 și 80 °C și la pH-uri cuprinse între 4 și 11, folosind l-fuculoza ca substrat (Fig. 3). Izomerizarea l-fuculozei în l-fucoză de către RdFucI a fost foarte dependentă de temperatură, iar activitățile maxime sau aproape maxime (> 80% din maxim) au fost prezentate la temperaturi cuprinse între 30 și 50 °C (Fig. 3a). Pentru a investiga efectul temperaturii asupra echilibrului pentru izomerizarea de la l-fucoză la l-fuculoză, raportul de echilibru a fost investigat la 30, 40 și 50 °C la care au fost prezentate activități maxime sau aproape maxime (> 80% din maxim). Ca urmare, nu a existat nicio diferență semnificativă în raportul de echilibru între cele trei temperaturi (l-fucoză/l-fuculoză = 9:1; p > 0,05). Cu alte cuvinte, l-fucoza a fost sintetizată din l-fuculoză cu un randament de aproximativ 90% la toate temperaturile testate (Fișier suplimentar 3: Fig. S3a).

Efectul a temperaturii și b pH-ului asupra activității relative a RdFucI împotriva l-fuculozei. Reacțiile enzimatice au fost efectuate a la diferite temperaturi cuprinse între 10 și 80 °C și b la diferite pH-uri cuprinse între 4 și 11. Tampoanele utilizate au fost: 50 mM acetat de sodiu (pH 4, 5 și 6), 50 mM fosfat de sodiu (pH 6, 7 și 8), 50 mM Tris-HCl (pH 7, 8 și 9) și 50 mM glicină-NaOH (9, 10 și 11). Datele experimentale reprezintă mediile ± abaterile standard a trei repetiții

A fost investigat efectul pH-ului. Activități ridicate ale RdFucI (> 70% din valoarea maximă) au fost observate la pH-uri alcaline și aproape neutre (pH-uri 9, 10 și 11 și pH-uri 6, 7 și 8). Sub pH 6, activitatea enzimatică a scăzut brusc, observându-se o activitate redusă la pH 4. În ciuda activităților specifice ridicate în condiții alcaline, randamentul de l-fucoză la echilibru (60 de minute de incubare) a fost mult mai mic la pH 10 (54 %) decât la pH 7 (88 %) (Fișier suplimentar 3: Fig. S3b). Activitățile relative la pH 7, 8 și 9 au fost mult mai scăzute în tamponul Tris-HCl decât activitățile în acetat de sodiu sau în tamponul glicină-NaOH, ceea ce implică faptul că Tris a inhibat puternic activitatea enzimatică a RdFucI. Experimentele enzimatice precedente din acest studiu au fost efectuate în amestecuri de reacție care conțineau Tris la 1 mM, care provenea din etapa de schimbare a tamponului după purificarea enzimei. Pentru a examina dacă Tris din amestecul de reacție ar putea inhiba RdFucI, au fost comparate activitățile de izomerizare din reacțiile care au avut loc în absența și în prezența a 1 mM de Tris (Fișier suplimentar 4: Fig. S4). Nu a fost evidentă nicio diferență semnificativă în activitățile enzimatice din cele două reacții, ceea ce indică faptul că 1 mM Tris nu a inhibat activitatea RdFucI.

Efectul ionilor metalici asupra activității RdFucI

Izomerazele zaharurilor, inclusiv izomerazele l-fucozei, necesită cationi divalenți, cum ar fi Mn2+ și Co2+, ca și cofactori pentru activitățile lor de izomerizare . Pentru a studia efectul cationilor divalenți asupra activității catalitice a RdFucI asupra l-fuculozei, activitatea enzimatică a fost testată în absența și în prezența fie a 1 mM de diferiți ioni metalici, fie a acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA) (tabelul 1). Enzima nativă RdFucI neexpusă la ioni metalici sau EDTA a prezentat o activitate scăzută, iar chelarea metalelor prin EDTA a redus activitatea enzimatică. Dintre ionii metalici testați, Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ și Zn2+ au dus la o creștere pronunțată a activității enzimei. În special, adăugarea de Mn2+ a sporit la maximum activitatea RdFucI cu aproximativ 7,4 ori. În schimb, Ca2+, Cu2+ și Fe3+ au inhibat mai degrabă activitatea RdFucI.

Specificitatea substratului și parametrii cinetici ai RdFucI

În general, izomerazele de zahăr și de fosfat de zahăr prezintă o largă specificitate față de diverși substraturi. Pentru a evalua dacă activitatea de favorizare a cetosei a RdFucI demonstrată cu l-fuculoza era evidentă și în cazul altor substraturi, s-a investigat specificitatea de substrat a RdFucI față de diferite zaharuri aldose (l-fucoză, d-arabinoză, d-altroză, d-galactoză, d-mannoză și d-glucoză) și față de zaharurile cetose corespunzătoare (l-fuculoză, d-ribuloză, d-psicoză, d-tagatoză și d-fructoză) (Fig. 4). Dintre toate aceste substraturi, inclusiv zaharuri aldose și cetosice, cele mai mari activități au fost observate cu l-fuculoza (115,3 U/mg) și d-ribuloza (127,3 U/mg), care sunt ambele zaharuri cetosice. Activitățile lui RdFucI pentru l-fuculoză și d-ribuloză au fost mult mai mari decât cele pentru celelalte substraturi. Dintre zaharurile aldose, activitatea pentru l-fucoză a fost cea mai mare (21,0 U/mg), celelalte substraturi producând activități specifice cuprinse între 4,7 și 7,9 U/mg. Zaharurile cetose, altele decât l-fuculoza și d-ribuloza, au prezentat activități specifice cuprinse între 0,0 și 10,8 U/mg. Astfel, l-fuculoza și d-ribuloza au fost substraturile preferate pentru RdFucI, iar activitatea de favorizare a cetosei a lui RdFucI a fost demonstrată numai cu l-fuculoza și d-ribuloza.

Specificitatea substratului lui RdFucI. Reacțiile enzimei au fost efectuate față de 10 mM de diferite substraturi de aldoză și cetosă la 40 °C și pH 10. Pentru substraturile de aldose, s-au folosit l-fucoză, d-arabinoză, d-altroză, d-galactoză, d-mannoză și d-glucoză. Pentru substraturile de cetoză, s-au folosit l-fuculoză, d-ribuloză, d-psicoză, d-tagatoză și d-fructoză. Datele experimentale reprezintă mediile ± abaterile standard a trei replici

Parametrii cinetici au fost determinați folosind l-fuculoza și d-ribuloza ca substraturi (Fișier suplimentar 5: Tabelul S1). Valorile Km (constanta Michaelis) și kcat (numărul de rotație al substratului) pentru l-fuculoză au fost de 1,9 și, respectiv, de 1,2 ori mai mici decât cele pentru d-ribuloză. Eficiența catalitică a RdFucI, reprezentată ca kcat/Km, pentru l-fuculoză, a fost de 1,5 ori mai mare decât cea a d-ribulozei, ceea ce indică faptul că l-fuculoza este preferată ca substrat de RdFucI.

Structura cristalină globală a RdFucI

Pentru a înțelege mai bine funcția moleculară, am determinat structura cristalină a RdFucI (Fișierul suplimentar 6: Tabelul S2). Harta densității electronice a RdFucI a fost bine definită de la reziduurile Ser5-Arg591 pentru șase subunități din unitatea asimetrică. Monomerul RdFucI este alcătuit din 19 α-helice și 23 de ramuri β care cuprind domeniile N1, N2 și C (Fig. 5a). Domeniul N1 (Ser5-Met172) adoptă o încovoiere α/β și este implicat în recunoașterea substratului în formarea hexamerica a RdFucI. Domeniile N2 (Lys173-Leu352) și C (Thr353-Arg591) conțin reziduurile de legare a metalelor implicate în activitatea catalitică (Fig. 5a). În unitatea asimetrică, subunitățile RdFucI formează formațiunea hexamerică dispusă ca un dimer de trimeri cu pseudosimetrie D3h (Fig. 5b). Acest lucru este în concordanță cu rezultatul cromatografiei analitice de excludere a mărimii în care s-a dovedit că RdFucI există ca un homohexameră în soluție (Fișier suplimentar 7: Fig. S5).

Structura globală a RdFucI. a Reprezentarea în desen animat a monomerului RdFucI. Monomerul RdFucI este compus din domeniile N1- (galben), N2- (roz) și C-(verde). b Reprezentare de suprafață a hexamerului RdFucI. Subunitățile A, B, C, C, D, E și F sunt colorate cu galben, roz, cyan, violet, verde și, respectiv, portocaliu. Un situs de legare a metalului pe un situs de buzunar de legare a substratului este indicat printr-un punct roșu

În formația hexamerică, subunitatea A (suprafața totală: 23011.7 Å2) interacționează cu patru subunități diferite: B (reziduuri în interfață: 47/suprafață îngropată: 1909,6 Å2), C (58/1837,6 Å2), D (42/1482,9 Å2) și E (34/1086,2 Å2). Subunitatea A nu interacționează cu restul subunității F (Fig. 5b). Subunitatea A a RdFucI are o suprafață totală îngropată de 2569,1 Å2, reprezentând 27,45% din suprafața totală. Această interfață îngropată este stabilizată prin interacțiunea care implică 59 de legături de hidrogen și 26 de punți de sare de la alte subunități (Fișier suplimentar 8: Tabelul S3, Fișier suplimentar 9: Tabelul S4, Fișier suplimentar 10: Tabelul S5, Fișier suplimentar 11: Tabelul S6).

Site de legare a substratului și situsul activ al RdFucI

Pungă de legare a substratului este formată de domeniile N2 și C ale subunității A și de domeniul N1 al subunității B (Fig. 6a-c) și are un total de șase situsuri de legare a substratului în RdFucI homohexamerica. Intrarea buzunarului de legare a substratului, de unde se apropie substratul, este de aproximativ 11 × 12,5 Å (Fig. 6a). Buzunarul de legare a substratului, unde se formează situsul de legare a metalului, are o suprafață încărcată negativ de aproximativ 4 × 5 Å (Fig. 6b). Distanța dintre situsul de legare a metalului și suprafața buzunarului de legare a substratului este de aproximativ 16,7 Å (Fig. 6d), ceea ce implică faptul că centrul activ este situat adânc într-un buzunar. Acest lucru indică faptul că atât lanțul deschis cât și forma inelară a substratului sunt accesibile centrului situsului activ și că, dimpotrivă, o zaharidă în vrac nu ar fi accesibilă situsului activ existent în interiorul buzunarului de legare a substratului.

Pungă de legare a substratului și situsul activ al RdFucI. a Buzunarul de legare a substratului este format prin asamblarea de către subunitățile A și C. b Suprafața electrostatică a buzunarului de legare a substratului. c Prezentarea factorului B al suprafeței de legare a substratului. d Vedere în secțiune a suprafeței buzunarului de legare a substratului. e Harta densității electronice 2Fo-F (plasă gri, conturată la 1,0 σ) pe situsurile de legare a metalelor din RdFucI înmuiate în soluție care conține 10 mM Mn2+. f Analiza geometrică a situsurilor de legare a Mn2+ ale RdFucI

RdFucI are nevoie de ioni metalici divalenți pentru activitatea sa catalitică pentru reacția de izomerizare folosind mecanismul ene-diol . Situl de legare a metalelor din RdFucI ar trebui să fie coordonat cu Mn2+ prin reziduurile conservate Glu337, Asp359 și His528 (Fișier suplimentar 12: Fig. S6). Cu toate acestea, nu există o hartă a densității electronice Fo-Fc (numărată la > 5σ) care este suspectată de a fi legată de Mn2+ ca metal esențial pentru legarea substratului (Fișier suplimentar 13: Fig. S7a). Analiza factorului B a arătat că factorul de temperatură al Mn2+ (70,53 Å2) este mai mare decât factorul de temperatură mediu al proteinei (36.22 Å2), ceea ce indică faptul că Mn2+ este prezent pe RdFucI cu o ocupație scăzută. Constatarea a fost în concordanță cu rezultatul analizei biochimice, în care enzima nativă a prezentat un nivel scăzut de activitate. Pe de altă parte, adăugarea de Mn2+ a crescut substanțial activitatea catalitică a RdFucI (tabelul 1). Astfel, am speculat că adăugarea de Mn2+ la cristalul RdFucI ar crește gradul de ocupare a legăturii de Mn2+. După înmuierea cristalelor RdFucI într-o soluție de 10 mM Mn2+, a fost observată o densitate fiabilă de electroni Fo-Fc (> 6σ) pe situsul de legare a metalului, unde poziția Mn2+ a fost clarificată în toate subunitățile (Fig. 6e și Fișierul suplimentar 13: Fig. S7b). Cu toate acestea, factorul B de temperatură al Mn2+ (76,56 Å2) a fost mai mare decât cel al întregii proteine (60,69 Å2), ceea ce implică faptul că ionul Mn2+ nu este încă complet ocupat în situsul de legare a metalului. Mn2+ a fost coordonat de atomii OE1 (distanța medie: 2,62 Å) și OE2 (2,65 Å) ai lui Glu337, de atomii OD1 (2,72 Å) și OD2 (2,72 Å) ai lui Asp361, de atomul NE2 (2,52 Å) al lui His528 și de molecula de apă (2,79 Å) (Fig. 6e). Unghiurile medii de legătură dintre Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2) și Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) au fost de 127,32°, 86,25° și, respectiv, 73,96°. Unghiul de legătură dintre liganzi și Mn2+ a arătat o coordonare octaedrică distorsionată.

Comparare structurală cu alte l-FucIs

Serverele DALI au fost folosite pentru a căuta omologii structurali. Această căutare a arătat că RdFucI este similar cu l-FucIs din E. coli (EcFucI, cod PDB 1FUI, scor Z: 60,6, rmsd: 0,3 pentru 587 atomi de Cαs), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, scor Z: 56.6, rmsd: 0,7 pentru 580 atomi de Cαs) și Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, scor Z: 55,9, rmsd: 0,7 pentru 585 atomi de Cαs). Suprapunerea buzunarului de legare a substratului a arătat că reziduurile de legare a metalului Glu337, Asp361 și His528 (numerotate în RdFucI) sunt identice din punct de vedere pozițional cu celelalte proteine, în timp ce reziduurile de recunoaștere a substratului (Arg16, W88, Gln300, Gln300, Tyr437, Trp496 și Asn524) au o ușoară diferență conformațională în lanțurile lor laterale (Fig. 7a). În special, bucla α7-α8 a fiecărui l-FucI, care se află pe suprafața buzunarului de legare a substratului, are o conformație diferită. Alinierea secvenței de l-FucI a arătat o mare similaritate, dar secvența pentru bucla α7-α8 a fiecărui l-FucI a fost foarte variabilă (Fig. 7b). Deoarece bucla α7-α8 este implicată în formarea arhitecturii buzunarului de legare a substratului, fiecare l-FucI formează un buzunar de legare a substratului unic (Fig. 7c). l-FucIs au în mod obișnuit o suprafață încărcată negativ în jurul situsului de legare a metalului, dar suprafața buzunarului de legare a substratului prezintă diferite stări de încărcare (Fig. 7c). Ca urmare, diferențele structurale ale buclelor α7-α8 vor cauza diferențe în specificitatea de substrat a l-FucIs.

Comparare structurală a RdFucI cu alți l-FucIs. Suprapunerea a situsului activ și b a suprafeței de legare a substratului de RdFucI cu EcFucI (cod PDB: 1FUI), ApFucI (3A9R) și SpFucI (4C20). Vedere de aproape a diferenței mari de conformație a buclelor α8-α9 față de l-FucI (stânga). c Alinierea parțială a secvenței pentru regiunea buclelor α8-α9 pentru RdFucI și EcFucI, ApFucI și SpFucI. d Reprezentarea suprafeței electrostatice a RdFucI, EcFucI, ApFucI și SpFucI. Buzunarul profund de legare a substratului și regiunile de buclă α8-α9 sunt indicate prin linii cu puncte portocalii și, respectiv, negre. Un situs de legare a metalelor este indicat printr-un asterisc galben

.