Abstract

Background and Objective. Un instrument de predicție neinvaziv fiabil pentru depistarea, diagnosticarea și/sau stadializarea cancerului colorectal (CCR) înainte de intervenția chirurgicală este esențial pentru alegerea tratamentului și a prognosticului. Metode. Au fost recuperați și analizați pacienții internați pentru tratamentul inițial al CCR între 1 ianuarie 2015 și 31 decembrie 2018. Au fost analizate înregistrările de celule natural killer (NK) CD16+CD56+ în funcție de stadiile de CRC. Rezultate. Numărul de participanți calificați în rândul pacienților sănătoși, în stadiul I, stadiul II, stadiul III și stadiul IV de CRC a fost de 60, 66, 60, 60, 70 și, respectiv, 68. A existat o diferență semnificativă în ceea ce privește celulele NK CD16+CD56+ circulante între grupul sănătos și grupul CRC (), precum și între grupul sănătos și grupul CRC în stadiul III sau IV ( și, respectiv, 0,001). Procentul de celule CD16+CD56+ NK circulante în limfocite a fost corelat negativ cu apariția CRC. Atunci când s-a comparat grupul de cazuri de CCR în stadiile I și II cu grupul de cazuri de CCR în stadiile III și IV folosind celulele NK CD16+CD56+ circulante, aria de sub curba caracteristicii operaționale a receptorului a fost de 0,878. Utilizând o valoare de separare optimă de 15,6%, OR a fost de 0,06 (0,03, 0,11), , sensibilitatea a fost de 86,5%, specificitatea de 72,5%, valoarea predictivă pozitivă de 74,2% și valoarea predictivă negativă de 85,5%. Concluzii. Celulele NK CD16+CD56+ circulante pot fi utilizate ca instrument de screening și de diagnostic/stadificare pentru CCR.

1. Introducere

Cancerul colorectal (CCR) are o incidență de aproximativ un milion pe an și cauzează moartea a aproape 700.000 de persoane în fiecare an, situându-se pe locul patru în topul celor mai letale tipuri de cancer din lume . Strategia actuală de depistare a CCR se confruntă cu o sensibilitate și/sau o specificitate scăzută în cazul testelor bazate pe scaun , cu etape plictisitoare de pregătire a intestinului înainte de examenele radiografice și cu un risc ridicat de perforație în cazul examenelor endoscopice . De fapt, cel mai bun test de screening și de urmărire cu o complianță ridicată pentru CCR ar trebui să fie ușor de completat și repetat, mai ales având în vedere cele până la 25% de cazuri nerezecabile în momentul diagnosticului și o rată de recidivă de 50% în cazurile în stadiu incipient în urma intervenției chirurgicale .

Stadificarea și prognosticul CCR se bazează în principal pe patologia după procedurile chirurgicale . Un imunoscore de consens pe secțiuni de parafină pentru clasificarea și prognosticul CCR a fost un exemplu practic . Deși mai multe studii au utilizat biomarkeri complementari și neinvazivi în diagnosticul CCR , lipsește încă un instrument de predicție fiabil cu sensibilitate ridicată, precum și specificitate pentru diagnosticul și/sau stadializarea CCR înainte de intervenția chirurgicală.

Se știe că sistemul imunitar este implicat în dezvoltarea și progresia CCR . S-a demonstrat că infiltrarea imunitară a diferitelor celule imune în CCR este legată de metastaze și prognostic . Mai mult, celulele imune circulante pot reflecta răspunsul imunitar local în micro-mediul tumoral , oferind astfel informații potențial importante cu privire la progresia bolii în CCR . Celulele ucigașe naturale (NK), ca subset important al celulelor imune, a căror activitate este declanșată de un echilibru evolutiv și delicat între semnalele de activare și cele de inhibare primite de la receptorii de la suprafața celulară, sunt considerate ținte interesante pentru studii clinice și translaționale .

În studiul de față, am analizat celulele NK dublu pozitive CD16 și CD56 la pacienți sănătoși și în diferite stadii ale pacienților cu CCR înainte de tratamentul inițial, încercând să ne dăm seama de valoarea celulelor NK CD16+CD56+ în predicția și stadiul de pretratament al CCR.

2. Metode

Acesta a fost un studiu de cohortă retrospectiv efectuat la Spitalul al 2-lea afiliat al Universității de Medicină din Harbin, un spital terțiar din nord-estul Chinei. Aprobarea Comitetului de etică instituțională a fost obținută înainte de colectarea datelor, iar consimțământul în cunoștință de cauză a fost obținut de la pacienți la admitere.

S-au recuperat și analizat înregistrările clinice ale pacienților care au fost admiși pentru tratamentul inițial al CCR între 1 ianuarie 2015 și 31 decembrie 2018 la Departamentul de Oncologie. Pacienții incluși ar trebui să aibă date disponibile privind celulele NK înainte de tratament (cele mai recente înainte de prima intervenție chirurgicală), precum și CRC primar confirmat histologic. Stadializarea s-a bazat pe terminologia TNM (Tumor Node Metastasis) . Au fost excluși pacienții cu diagnostic neclar, complicați cu alte tipuri de cancer, au fost internați după tratamente anterioare pentru CCR, cu alte boli cronice (cum ar fi boli cardiovasculare și boli endocrine) sau cu infecții virale sau bacteriene. În grupul de control au fost înrolați participanți sănătoși, egali ca vârstă și IMC (fără plângere clinică, care tocmai au finalizat examenul fizic anual în momentul înrolării).

Eșantioanele de sânge venos periferic de post au fost recoltate de la toți participanții înainte de tratament (pentru grupul CCR) sau în ziua examenului anual (pentru controalele sănătoase) într-un tub acoperit cu heparină și păstrate la 2-8°C. 100 μl de sânge proaspăt recoltat au fost transferați într-un tub specific pentru flux. S-au adăugat 20 μl de reactiv BD Multitest TBNK cu 6 culori (nr. de referință 644611, BD, SUA, care include CD3 FITC, CD16 PE+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC și CD8 APC-Cy7) pentru studiul prin citometrie în flux, în conformitate cu manualul de fabricație, în cadrul panoului din care CD16+CD56+ a cuantificat în mod specific celulele NK din cadrul populației de limfocite. Amestecul a fost incubat la temperatura camerei timp de 15 minute la întuneric și a fost tratat cu 2,5 ml de tampon de liză de globule roșii (Sigma-Aldrich) timp de 10 minute la temperatura camerei la întuneric. Amestecul a fost spălat de două ori cu tampon PBS, resuspendat și fixat în 0,5 ml de PBS conținând 0,9% formaldehidă (Sigma-Aldrich) și analizat cu ajutorul unui sistem de citometrie în flux FACSCanto II (BD Biosciences) prin intermediul software-ului FACSDiva™ versiunea 8.0 (BD Biosciences). Cel puțin 20.000 de celule au fost analizate în poarta P1 din fiecare eșantion.

2.1. Analiză statistică

Datele discrete au fost exprimate ca număr de cazuri (procente) și analizate cu ajutorul testului sau al testului exact Fisher, împreună cu raportul de probabilitate (OR) și intervalul de încredere de 95% (IC 95%), după caz. Datele continue au fost exprimate ca și au fost analizate cu ajutorul testului -. Aria de sub curba caracteristicii operaționale a receptorului (ROC) a fost utilizată pentru a arăta valoarea predicției. SPSS 24.0 (IBM Corp., Armonk, NY) a fost utilizat pentru analiza statistică. Un rezultat cu două cozi este considerat semnificativ diferit.

3. Rezultate

În timpul perioadei de studiu prestabilite, 2.714 pacienți cu CCR au fost internați în spitalul nostru. Conform criteriilor de includere prestabilite, 66 de pacienți în stadiul I, 60 de pacienți în stadiul II, 70 de pacienți în stadiul III și 68 de pacienți în stadiul IV au fost incluși în studiul nostru. Alți 60 de participanți sănătoși, potriviți ca vârstă și IMC, au fost înscriși în grupul de control. Nu au existat diferențe semnificative în ceea ce privește vârsta, sexul, greutatea corporală, înălțimea sau IMC între controalele sănătoase și cazurile de CCR sau între diferitele grupuri (, Tabelul 1).

3.1. Valoarea predictivă a celulelor NK CD16+CD56+ circulante în CCR

A existat o diferență semnificativă în ceea ce privește celulele NK CD16+CD56+ circulante între grupul sănătos și cazurile de CCR (, Tabelul 1). Procentul de celule CD16+CD56+ NK circulante în limfocite a fost corelat negativ cu apariția CCR.

Curba Receiver Operating Characteristic (ROC) a fost utilizată pentru a arăta rolul celulelor CD16+CD56+ NK în predicția CCR. La compararea controalelor sănătoase cu ansamblul cazurilor de CCR (figura 1), aria sub curbă (AUC) a fost de 0,725 (tabelul 2). Utilizând o valoare de separare optimă de 19,7 %, OR a fost de 0,08 (0,04, 0,15), , sensibilitatea a fost de 80,0 %, specificitatea a fost de 76,9 %, valoarea predictivă pozitivă (PPV) a fost de 44,0 %, iar valoarea predictivă negativă (NPV) a fost de 94.4%.

Figura 1

Curba ROC (receiver operating characteristic) a celulelor NK în predicția cazurilor de CCR (sănătos vs. sănătos). cazuri).

3.2. Celulele CD16+CD56+ NK circulante în diferite stadii ale cazurilor de CCR

Nu au existat diferențe în ceea ce privește celulele CD16+CD56+ NK circulante între grupul sănătos și grupul de CCR în stadiul I sau II ( și , respectiv), dar există diferențe semnificative între grupul sănătos și grupul de CCR în stadiul III sau IV (, , și , respectiv, Tabelul 1). Deoarece nu au existat diferențe în ceea ce privește celulele NK CD16+CD56+ NK între grupul sănătos și grupul de CRC în stadiul I sau II, atunci când se compară grupul de controale sănătoase+cazuri de CRC în stadiul I+II cu grupul de cazuri de CRC în stadiul III+IV (figura 2), AUC a fost de 0,892 (tabelul 2). Utilizând o valoare de separare optimă de 15,6 %, OR a fost de 0,07 (0,04, 0,12), , sensibilitatea a fost de 84,4 %, specificitatea a fost de 72,5 %, PPV a fost de 80,5 %, iar NPV a fost de 77,5 %.

Figura 2

Curba ROC (receiver Operating Characteristic) a celulelor NK în diferite stadii ale cazurilor de CCR (sănătos+stadii 1&2 vs. stadii 3&4).

Când s-a comparat grupul de cazuri de CCR în stadiile I și II cu grupul de cazuri de CCR în stadiile III și IV (figura 3), AUC a fost de 0,878 (tabelul 2). Utilizând o valoare de separare optimă de 15,6 %, OR a fost de 0,06 (0,03, 0,11), , sensibilitatea a fost de 86,5 %, specificitatea a fost de 72,5 %, VPP a fost de 74,2 %, iar VNI a fost de 85,5 %.

Figura 3

Curba ROC (receiver Operating Characteristic) a celulelor NK în diferite stadii ale cazurilor de CCR (stadii 1&2 vs. stadii 1&2). stadiile 3&4).

4. Discuție

În linii mari, pe baza expresiei CD56, celulele NK pot fi subdivizate în CD56bright și CD56dim. Primele celule sunt asociate cu imunoreglarea și producerea de citokine proinflamatorii, în timp ce ultimele celule sunt citotoxice . CD16 (FcγRIII) de pe celulele NK mediază citotoxicitatea mediată celular dependentă de anticorpi , iar prezența CD16 exclude astfel implicarea anumitor celule NK corelate cu celulele T sau B .

Recent, două studii au folosit CD3-CD56+ ca markeri pentru celulele NK. Un studiu a raportat prezența unor subseturi de celule NK la pacienții cu CCR, concluzia fiind că „procentul de celule CD16+ NKT-like a fost asociat în mod independent cu o supraviețuire fără boală mai scurtă la pacienții cu CCR” . Cu toate acestea, autorii au înrolat doar un număr limitat de pacienți, iar stratificarea în funcție de diferite stadii, precum și o divizare a populației de celule NK CD56bright și CD56dim au diluat și mai mult puterea datelor lor. Mai mult decât atât, unii dintre acești pacienți au primit tratament radiologic deja înainte de recoltarea celulelor NK, ceea ce ar putea introduce eterogenitate (un amestec de pacienți tratați inițial și post-tratament) în populația de pacienți reuniți. Un alt studiu a raportat o corelație negativă între celulele NK periferice și stadializarea TNM a CCR, cu o diferență semnificativă a celulelor NK între persoanele sănătoase și stadiile I și II, precum și între persoanele sănătoase și stadiul IV, dar nu și între persoanele sănătoase și stadiul III . Această tendință inconsecventă s-ar putea datora numărului mic de pacienți înrolați în fiecare grup. În studiul nostru, am colectat mai mulți pacienți și numai pacienții fără tratament anterior au fost înrolați pentru analiză, ceea ce ar putea arăta starea naturală a corpului sub povara CRC. Astfel, datele noastre, omogene ca atare, sunt aplicabile ca un test de screening înainte de tratamentul inițial.

O altă putere a studiului nostru rezidă în excluderea cazurilor de infecție virală sau bacteriană. Există receptori activatori și receptori inhibitori pe suprafața celulelor NK . Receptorii de activare a celulelor NK, așa cum au fost exemplificați de Ly49H, KIR2DL3 sau KIR3DS1, sunt necesari pentru a elimina infecțiile cu citomegalovirus , virusul hepatitei C sau, respectiv, virusul Epstein-Barr. Pe de altă parte, receptorii inhibitori ai celulelor NK, așa cum au fost exemplificați de CD94-NKG2A , sau KIR , sunt, de asemenea, implicați în cazul infecțiilor virale. Echilibrul dintre receptorii activatori și inhibitori este menținut prin intermediul legăturii receptor-ligand . Receptorii Toll-like (TLR) direcți pot fi activați de lipopolizaharidă, o componentă a bacteriilor gram-negative. S-a raportat, de asemenea, că stimularea TLR-urilor pe celulele NK este implicată în activarea celulelor NK . Prin urmare, excluderea cazurilor de infecție virală sau bacteriană va reduce eterogenitatea acestor cazuri în analiza cazurilor de CCR.

Au existat rapoarte privind prognosticul CCR bazat pe colorarea imunohistochimică pentru a detecta mutația sau polimorfismul genelor , sau activarea , care este fezabilă numai după proceduri chirurgicale. O categorie de biomarkeri circulanți pentru CCR se încadrează în domeniul reglementării genelor (microARN sau metilare) . O altă categorie rezidă în analiza metabolomică a serului . În acest sens, celulele NK CD16+CD56+ circulante au un rol predictiv atât în screening, cât și în stadializarea înainte de procedurile chirurgicale.

5. Concluzie

În concluzie, am constatat că procentul de celule NK CD16+CD56+ circulante a fost corelat negativ cu apariția CCR și stadializarea CCR. Utilizând o valoare limită de 19,7% și 15,6%, procentul de celule NK CD16+CD56+ circulante a fost capabil să diferențieze între cazurile sănătoase și cazurile de CCR sau cazurile în stadiul I+II și, respectiv, III+IV.

Disponibilitatea datelor

.