Imunofluorescența (IF) este o abordare morfologică comună utilizată pentru a determina distribuția componentelor subcelulare. Anticorpii care se conjugă cu coloranți fluorescenți sunt necesari în testul IF. Anticorpul recunoaște în mod specific antigenul prin legarea la epitopul țintei, iar fluoroforul va fi detectat sub un microscop fluorescent. Prin urmare, componentele subcelulare pot fi vizualizate pe un fond întunecat. IF poate fi, de asemenea, utilizată ca o metodă alternativă de analiză semicantitativă pentru monitorizarea expresiei de interes.

Există trei tipuri de IF: IF directă, IF indirectă și IF combinată.

IF directă utilizează un singur anticorp primar care este conjugat cu un colorant fluorescent.

Indirect IF utilizează doi anticorpi pentru colorare: un anticorp primar care se leagă în mod specific de epitop și un anticorp secundar corespunzător, conjugat cu un colorant fluorescent.

Inf combinată este o combinație de colorare IF directă și indirectă.

Tabelul 1. Comparație între IF directă, indirectă și combinată.

Tipul de IF	Directă	Indirectă	Combinată
Schemă schematică		.		Ghid de imunofluorescență
Avantaje	Colorare rapidă Disponibil pentru anticorpi de la aceeași gazdă Mai puțin nonsemnal de fond nespecific	Amplificarea semnalizării secundare Un singur anticorp secundar poate detecta mai mulți anticorpi primari de la aceeași gazdă Un anticorp primar poate fi asociat cu diverși anticorpi secundari cu diferiți coloranți de fluorescență .	Amplificare secundară pentru semnalizare slabă Disponibil pentru anticorpi de la aceeași gazdă
Dezavantaje	Mai puțin sensibilă din cauza lipsei de amplificare secundară a semnalizării	Timp de…consumatoare de timp Este nevoie de anticorpi de la diferite gazde Posibilitatea reactivității încrucișate a anticorpilor	Multiplă colorare în mai multe etape

Printre cele trei tipuri de IF, metoda IF indirectă este cea mai populară.

Abordarea IF poate fi utilizată pe secțiuni de țesut, linii celulare cultivate și celule individuale. Procesul de IF este similar cu cel al imunohistochimiei (IHC).

• Colectarea și fixarea probelor

Eșantioanele trebuie fixate rapid după îndepărtarea țesutului și este mai bine să se efectueze prefixarea prin infuzie cardiacă cu formaldehidă 4% sau paraformaldehidă la animale mici, cum ar fi rozătoarele. Se recomandă ca țesuturile să nu fie mai groase de 10 mm, iar volumul fixatorului să fie de cel puțin 15-20 de ori mai mare decât volumul țesutului. Fixarea este foarte importantă pentru păstrarea morfologiei și structurii celulelor, precum și a integrității antigenului. Astfel, soluțiile de fixare trebuie să fie alese cu atenție în funcție de diferite antigene și probe de țesut.

Tabelul 2. Strategia de fixare pentru antigene parțiale.

• Deshidratare și încorporare

Deshidratarea este necesară la prepararea secțiunilor de țesut din următoarele motive:
1. Secțiunea de parafină: Parafina este imiscibilă cu apa.
2. Secțiunea congelată: Cristalele de gheață înghețate-dezghețate ar distruge morfologia celulelor.

Deshidratarea se realizează întotdeauna prin scufundarea țesutului într-o soluție serioasă de etanol cu gradient crescător de gradient sau într-o soluție de zaharoză.

Subiectiv, probele de țesut pot fi încorporate prin adăugarea de parafină topită pentru secțiuni de parafină, în timp ce pentru secțiunile congelate se adaugă compus OCT. Această etapă asigură o duritate adecvată pentru probele de țesut moale și permite ca țesutul să fie tăiat cu ușurință.

• Secțiune și colorare

Tesuturile înglobate pot fi secționate în felii subțiri cu microtomul sau microtomul de congelare. Grosimea feliilor trebuie decisă în funcție de diametrul celular și de scopul testului IF. Se sugerează ca feliile mai subțiri (≤10 μm) să se monteze direct pe lamele adezive înainte de colorare, deoarece acestea sunt ușor de împânzit în etapele multiple de spălare. Felii mai groase (10~30 μm) vor obține imagini mai bune prin utilizarea metodei de plutire liberă, deoarece anticorpul primar poate pătrunde prin ambele părți ale feliei. Iar secțiunile care plutesc liber sunt montate pe lame după colorare. Secțiunile plutitoare libere ale țesuturilor mici, cum ar fi rădăcina ganglionilor dorsali de șoarece (DRG), sunt dificil de realizat și este ușor de pierdut proba. Astfel, se recomandă metoda secțiunii de tip „stick” pentru unele probe de țesut de dimensiuni mici. Etapele de colorare trebuie efectuate la întuneric atunci când este implicat un anticorp conjugat cu un colorant fluorescent.

Întoarceți-vă la protocoale IF:

• Secțiune stick
• Secțiune flotantă liberă
• Celule cultivate

• Imagistică și analiză

Semnalizarea pozitivă este virtualizată la un microscop fluorescent pe fond întunecat. Locația de interes este determinată de obicei prin colorația în comun a unei proteine a cărei localizare a fost cunoscută. Alternativ, se poate măsura cantitatea de celule pozitive sau intensitatea fluorescenței semnalizării pozitive pentru o analiză cantitativă. De exemplu, intensitatea mai mare a fluorescenței se referă la o expresie relativ ridicată a proteinei țintă.

Figura 1. Fluxul de lucru al IF pe secțiuni tisulare.

Atât IF cât și IHC sunt abordări puternice pentru analiza morfologică cu aplicații importante de diagnostic și prognostic. Câteva diferențe trebuie să fie preocupate în cercetarea dumneavoastră:

Tabel 3. Comparație între IHC și IF

.

.

	IHC	IF
Metoda de marcare	Cromogenă	Fluorescentă
Etapa de procesare	Mai mult ca substrat necesar	Mai puțin
Imagine	Semnalizare ultrasensibilă Reacția „neclară” rezultă din precipitatul format de complexul enzimatic cromogenic	Rezoluție înaltă Multiplă colorare
Microscop	Microscop luminos	Microscop fluorescent
Stabilitate	Stabil pentru ani		Mai puțin stabilă din cauza fotobleachingului
Exemplu (hipocampus de șoarece)

.