FRAP poate fi, de asemenea, utilizată pentru a monitoriza proteinele din afara membranei. După ce proteina de interes devine fluorescentă, în general prin exprimarea ca proteină de fuziune GFP, se utilizează un microscop confocal pentru a fotobleașa și a monitoriza o regiune din citoplasmă, fusul mitotic, nucleul sau o altă structură celulară. Fluorescența medie din regiune poate fi apoi reprezentată grafic în funcție de timpul scurs de la fotoblematizare, iar curba rezultată poate produce coeficienți cinetici, cum ar fi cei pentru reacțiile de legare a proteinei și/sau coeficientul de difuzie al proteinei în mediul în care aceasta este monitorizată. Adesea, singurele dinamici luate în considerare sunt difuzia și interacțiunile de legare/dezlegare, însă, în principiu, proteinele se pot deplasa și prin curgere, adică, suferă o mișcare dirijată, iar acest lucru a fost recunoscut foarte devreme de Axelrod et al. Acest lucru s-ar putea datora curgerii citoplasmei sau nucleoplasmei, sau transportului de-a lungul filamentelor din celulă, cum ar fi microtubulii, de către motoarele moleculare.

Analiza este cea mai simplă atunci când recuperarea fluorescenței este limitată fie de rata de difuzie în zona decolorată, fie de rata la care proteinele decolorate se dezleagă de la situsurile lor de legare din zona decolorată și sunt înlocuite de proteina fluorescentă. Să analizăm aceste două limite, pentru cazul obișnuit de albire a unei proteine de fuziune GFP într-o celulă vie.

Recuperarea fluorescenței limitată de difuzieEdit

Pentru un punct de albire circular cu raza w {\displaystyle w}

și o recuperare dominată de difuzie, fluorescența este descrisă de o ecuație derivată de Soumpasis (care implică funcțiile Bessel modificate I 0 {\displaystyle I_{0}}

și I 1 {\displaystyle I_{1}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) {\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}\left(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\right)}

cu τ D {\displaystyle \tau _{D}}

scara de timp caracteristică pentru difuzie, iar t {\displaystyle t}

este timpul. f ( t ) {\displaystyle f(t)}

este fluorescența normalizată (ajunge la 1 pe măsură ce t {\displaystyle t}

ajunge la infinit). Scara de timp de difuzie pentru o pată albită de rază w {\displaystyle w}

este τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, cu D coeficientul de difuzie.

Rețineți că aceasta este pentru o albire instantanee cu un profil de funcție în trepte, adică fracțiunea f b {\displaystyle f_{b}}.

de proteină presupusă a fi albită instantaneu la momentul t = 0 {\displaystyle t=0}

este f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}}

, și f b ( r ) = 0 , r > w {\displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, pentru r {\displaystyle r}

este distanța de la centrul zonei albite. Se presupune, de asemenea, că recuperarea poate fi modelată prin difuzie în două dimensiuni, care este, de asemenea, uniformă și izotropă. Cu alte cuvinte, se presupune că difuzia are loc într-un mediu uniform, astfel încât constanta de difuzie efectivă D este aceeași peste tot, iar difuzia este izotropă, adică are loc cu aceeași viteză de-a lungul tuturor axelor din plan.

În practică, într-o celulă, niciuna dintre aceste ipoteze nu va fi strict adevărată.

1. Blanșirea nu va fi instantanee. În special dacă este necesară o decolorare puternică a unei suprafețe mari, decolorarea poate dura o fracțiune semnificativă din scara temporală de difuzie τ D {\displaystyle \tau _{D}}.
   

   . Atunci o fracțiune semnificativă din proteina albită va difuza în afara regiunii albite efectiv în timpul procesului de albire. Dacă nu se ține cont de acest lucru, se va introduce o eroare semnificativă în D.

2. Profilul decolorat nu va fi o funcție în trepte radială. Dacă pata albită este efectiv un singur pixel, atunci albirea în funcție de poziție va fi de obicei limitată de difracție și determinată de optica microscopului confocal de scanare cu laser utilizat. Aceasta nu este o funcție în trepte radială și variază, de asemenea, de-a lungul axei perpendiculare pe plan.
3. Celele sunt, desigur, tridimensionale, nu bidimensionale, la fel ca și volumul decolorat. Neglijarea difuziei în afara planului (considerăm că acesta este planul xy) va fi o aproximare rezonabilă numai dacă fluorescența se recuperează predominant prin difuzie în acest plan. Acest lucru va fi adevărat, de exemplu, în cazul în care un volum cilindric este decolorat cu axa cilindrului de-a lungul axei z și cu acest volum cilindric care traversează întreaga înălțime a celulei. În acest caz, difuzia de-a lungul axei z nu determină recuperarea fluorescenței, deoarece toate proteinele sunt înălbite uniform de-a lungul axei z și, prin urmare, neglijarea acesteia, așa cum face ecuația lui Soumpasis, este inofensivă. Cu toate acestea, dacă difuzia de-a lungul axei z contribuie la recuperarea fluorescenței, atunci trebuie să fie luată în considerare.
4. Nu există niciun motiv pentru a ne aștepta ca citoplasma sau nucleoplasma celulei să fie complet uniforme din punct de vedere spațial sau izotrope.

Deci, ecuația lui Soumpasis este doar o aproximație utilă, care poate fi folosită atunci când ipotezele enumerate mai sus sunt bune aproximări ale situației reale și când recuperarea fluorescenței este într-adevăr limitată de scara temporală a difuziunii τ D {\displaystyle \tau _{D}}.

. Rețineți că simplul fapt că Soumpasis poate fi ajustat în mod adecvat la date nu înseamnă neapărat că ipotezele sunt adevărate și că difuzia domină recuperarea.

Recuperare limitată de reacțieEdit

Ecuația care descrie fluorescența în funcție de timp este deosebit de simplă într-o altă limită. Dacă un număr mare de proteine se leagă de situsuri într-un volum mic, astfel încât acolo semnalul de fluorescență este dominat de semnalul provenit de la proteinele legate, și dacă această legare este toată într-o singură stare cu o rată de dezactivare koff, atunci fluorescența în funcție de timp este dată de

f ( t ) = 1 – e – k off t {\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{_{text{off}}t}}.

Rețineți că recuperarea depinde numai de constanta de viteză pentru dezlegare, koff. Ea nu depinde de rata de on pentru legare. Deși depinde de o serie de ipoteze

1. Rata de pornire trebuie să fie suficient de mare pentru ca concentrația locală de proteină legată să depășească cu mult concentrația locală de proteină liberă, permițându-ne astfel să neglijăm contribuția la f a proteinei libere.
2. Reacția este o reacție bimoleculară simplă, în care proteina se leagă la situsuri localizate care nu se deplasează semnificativ în timpul recuperării
3. Schimbul este mult mai lent decât difuzia (sau orice alt mecanism de transport responsabil pentru mobilitate), deoarece numai atunci fracțiunea care difuzează se recuperează rapid și apoi acționează ca sursă de proteină fluorescentă care se leagă și înlocuiește proteina albită legată și astfel crește fluorescența. Cu r raza spotului decolorat, acest lucru înseamnă că ecuația este valabilă numai dacă durata de viață legată 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{\text{off}}>>r^{2}/D}
   

   .

Dacă toate aceste ipoteze sunt îndeplinite, atunci adaptarea unei exponențiale la curba de recuperare va da constanta vitezei de oprire, koff. Cu toate acestea, alte dinamici pot da curbe de recuperare similare cu cele exponențiale, astfel încât potrivirea unei exponențiale nu implică neapărat faptul că recuperarea este dominată de o reacție bimoleculară simplă. O modalitate de a face distincția între recuperarea cu o rată determinată de dezlegare și recuperarea limitată de difuzie este de a observa că rata de recuperare pentru recuperarea limitată de dezlegare este independentă de mărimea zonei decolorate r, în timp ce aceasta se scalează ca r – 2 {\displaystyle r^{-2}}.

, pentru recuperarea limitată de difuzie. Astfel, dacă o zonă mică și una mare sunt albite, dacă recuperarea este limitată de dezlipire, atunci ratele de recuperare vor fi aceleași pentru cele două dimensiuni ale zonei albite, în timp ce dacă recuperarea este limitată de difuzie, atunci va fi mult mai lentă pentru zona albită mai mare.

Difuzie și reacțieEdit

În general, recuperarea fluorescenței nu va fi dominată nici de difuzia izotropă simplă, nici de o singură rată simplă de dezlegare. Va exista atât difuzie, cât și legare și, într-adevăr, constanta de difuzie poate să nu fie uniformă în spațiu și pot exista mai multe tipuri de situsuri de legare, iar aceste situsuri pot avea, de asemenea, o distribuție neuniformă în spațiu. Procesele de curgere pot fi, de asemenea, importante. Acest comportament mai complex implică faptul că este necesar un model cu mai mulți parametri pentru a descrie datele; modelele cu doar o singură constantă de difuzie D sau o singură constantă de viteză de oprire, koff, sunt inadecvate.

Există modele cu difuzie și reacție. Din nefericire, o singură curbă FRAP poate furniza dovezi insuficiente pentru a se potrivi în mod fiabil și univoc datelor experimentale (posibil zgomotoase). Sadegh Zadeh et al. au arătat că curbele FRAP pot fi ajustate prin diferite perechi de valori ale constantei de difuzie și ale constantei de viteză de reacție sau, cu alte cuvinte, că ajustările FRAP nu sunt unice. Aceasta se regăsește în ajustări cu trei parametri (constanta on-rate, constanta off-rate și constanta de difuzie). Ajustările care nu sunt unice, nu sunt, în general, utile.

Astfel, pentru modelele cu un număr de parametri, un singur experiment FRAP poate fi insuficient pentru a estima toți parametrii modelului. Atunci sunt necesare mai multe date, de exemplu, prin albirea unor zone de dimensiuni diferite, determinarea unor parametri ai modelului în mod independent, etc.

.