Cercetare fundamentală

Răspunsul hormonului de creștere la peptida-2 de eliberare a hormonului de creștere la șoarecii Little cu deficit de hormon de creștere

Cibele N. PeroniI; Cesar Y. HayashidaII; Nancy NascimentoI; Viviane C. LonguiniII; Rodrigo A. ToledoII; Paolo BartoliniI; Cyril Y. BowersIII; Sergio P.A. ToledoII

Departamentul de Biotehnologie, Comisia Națională pentru Energie Nucleară (IPEN-CNEN), Cidade Universitária, São Paulo/SP, Brazilia
IIFacultatea de Medicină a Universității din São Paulo, Departamentul de Medicină, Endocrinologie, Endocrine Genetics Unit/LIM 25, São Paulo/SP, Brazilia
IIITulane University Health Sciences Center, Department of Medicine, Division of Endocrinology, Endocrine Section, New Orleans, LA/USA

ABSTRACT

OBIECTIV: Să investigăm o posibilă acțiune directă, eliberatoare de hormon de creștere, independentă de hormonul de creștere, a unui secretagog al hormonului de creștere, GHRP-2, în celulele somatotrofe hipofizare în prezența receptorilor inactivi ai hormonului eliberator de hormon de creștere.
MATERIALE ȘI METODE: Răspunsurile hormonului de creștere seric la hormonul de creștere P-2 eliberat de hormonul de creștere injectat acut la șoarecii lit/litm, care reprezintă un model de deficiență de GH care rezultă din mutații ale receptorilor hormonului de eliberare a hormonului de creștere, au fost comparate cu cele observate la șoarecii heterozigoți (lit/+) littermates și la șoarecii C57BL/6J de tip sălbatic (+/+).
REZULTATE: După administrarea a 10 mcg de P-2 care eliberează hormonul de creștere la șoarecii lit/lit, s-a observat o eliberare de hormon de creștere de 9,3±1,5 ng/ml, comparativ cu 1,04±1,15 ng/ml la martori (p<0,001). În comparație, la șoarecii lit/+ și, respectiv, la șoarecii de tip sălbatic a fost indusă o eliberare intermediară de hormon de creștere de 34,5±9,7 ng/ml și o eliberare mai mare de hormon de creștere de 163±46 ng/ml. Astfel, GHRP-2 a stimulat hormonul de creștere la șoarecii lit/lit, iar eliberarea hormonului de creștere in vivo poate fi doar parțial dependentă de hormonul de eliberare a hormonului de creștere. În plus, nivelurile plasmatice de leptină și grelină au fost evaluate la șoarecii lit/lit în condiții bazale și stimulate.
CONCLUZII: Aici am demonstrat că șoarecii lit/lit, care adăpostesc o mutație germinală în gena hormonului de eliberare a hormonului de creștere, mențin o creștere limitată, dar semnificativă din punct de vedere statistic, a hormonului de creștere după stimularea exogenă cu GHRP-2. Datele de față reflectă probabil un efect direct, independent de hormonul de creștere, asupra stimulării hormonului de creștere S (ghrelin) în somatotrofele hipofizare rămase la șoarecii mici, care este mediat de hormonul de creștere S-R 1a.

Cuvinte cheie: hormon de creștere S-R 1a: Ghrelin; GH; GHRH-R; GHRP-2; GHRP-2; Leptină; Șoricel mic.

INTRODUCERE

Sinteza și secreția hormonului de creștere (GH) sunt reglementate în principal de hormonii hipotalamici hormonul de eliberare a GH (GHRH) și somatostatina prin feedback-ul negativ al GH și IGF-I și de către ghrelinul, hormonul natural endogen de eliberare a GH (1-8). Maturizarea somatotrofă normală, proliferarea și creșterea și dezvoltarea somatică necesită GHRH (9). În fazele târzii de diferențiere a celulelor somatotrofe, GHRH activează Gs alfa, AMPc și calea proteinei kinazei A prin intermediul receptorului său de membrană celulară GHRH-R (1,10,11). În schimb, ghrelina, care a fost izolată inițial din stomacul șobolanului și din amusul hipotalamusului, acționează prin intermediul receptorului secretagogului hormonului de creștere (GHS) (GHS-R 1a), care este cuplat la membri ai familiei Gq/i și activează fosfolipază C (2,12,13).

GHS de sinteză sunt agoniști ai receptorilor de ghrelină care stimulează secreția de GH in vitro și in vivo. Aceștia includ peptide eliberatoare de GH (GHRP), cum ar fi GHRP-2, și compuși non-peptidici. GHS sintetice și ghrelina stimulează, de asemenea, eliberarea de ACTH/cortizol și prolactină prin efecte hipotalamice și s-a demonstrat că acestea cresc aportul alimentar, cheltuielile energetice, somnul și tonusul cardiac (15-17). Deși structurile lor chimice variază, toate GHS-urile par să acționeze prin intermediul GHS-R pentru a spori secreția de GH și aportul alimentar. ARNm al GHS-R a fost identificat în glanda pituitară, în nucleul arcuat al hipotalamusului și în alte țesuturi (6,15-17). Pentru o stimulare maximă a GH, GHRP necesită o secreție simultană de GHRH hipotalamică (18-21). Mai mult, ghrelina și GHS-urile sintetice potențează producția de AMPc indusă de GHRH și cresc nivelurile mai multor GHRH-R-uri, ceea ce poate duce, de asemenea, la interacțiuni modificate între GHS-R și GHRH (22-25). În acest context, se poate produce o acțiune dublă și complementară a ghrelinei și a GHRP asupra hipotalamusului și glandei pituitare. În plus, trebuie menționat un efect paracrin asupra nucleului arcuat al hipotalamusului, care este implicat în reglarea aportului alimentar și a cheltuielilor energetice (17).

Locul predominant de acțiune al GHS pentru secreția de GH nu a fost pe deplin stabilit. GHS-R-urile au fost identificate atât în glanda pituitară, cât și în hipotalamus, iar GHS-urile pot acționa la unul sau la ambele situsuri. Unele dovezi indică faptul că acțiunea de secreție a GH a GHS și a ghrelinei poate avea loc în principal în hipotalamus, cu un efect direct marginal asupra glandei pituitare (25-27). În consecință, o creștere limitată, dar semnificativă din punct de vedere statistic a GH (p<0,05) a fost documentată pentru prima dată în urma unui stimulent acut cu GHRP2 la pacienții cu deficit de GH cu statură mică, rezultată dintr-o mutație germinală în gena GHRH-R (28). La scurt timp după aceea, alte studii au susținut aceste constatări inițiale (29,30), ceea ce indică o acțiune directă a GHRP-2 în glanda pituitară. Clonarea genei receptorului hormonului de eliberare a hormonului de creștere la șoareci și la om (ghrhr) a fost realizată în urma constatării faptului că diferite mutații analoage cu mutația inactivatoare ghrhr Asp60Gly a șoarecilor mici cu deficit de GH au apărut și la oamenii cu deficit de GH (31-37). Mutația ghrhr la șoarecii lit/lit a dus la o lipsă totală de eliberare de GH mediată de GHRH, care a fost confirmată în continuare prin constatarea că proteina GHRH-R mutantă nu se leagă de GHRH (32,33). După cum era de așteptat, lipsa completă a unui răspuns GH la GHRH1-29NH2 a fost raportată la șoarecii mici (38-40). Lipsa completă a unui răspuns GH la GHRP-6 a fost, de asemenea, raportată la șoarecii mici (41). Cu toate acestea, deoarece GHS acționează în mod specific prin intermediul GHS-R, este rezonabil să se presupună că un răspuns GH poate apărea ca răspuns la o provocare GHS la șoarecii mici. În sprijinul acestei ipoteze, s-a demonstrat că GHRP-2 crește eliberarea de GH din hipofizarii de șobolan in vitro, chiar și după ce GHRH-R a fost blocat cu ajutorul abordării cu oligonucleotide antisens (42).

Șoarecele mic este un model animal stabilit pentru evaluarea efectelor directe, independente de GHRH, ale GHS-urilor și ale ghrelinei asupra celulelor somatotrofe hipofizare (33-35). Aici am evaluat răspunsul GH la GHRP-2 la șoarecii mici (lit/lit), la partenerii lor heterozigoți (lit/+) și la martorii de tip sălbatic (+/+). În plus, a fost evaluat un posibil rol al GHRH și GHRH-R asupra secreției și acțiunii ghrelinei prin măsurarea nivelului de ghrelină plasmatică la post și în timpul mesei și a nivelului de leptină serică la aceste animale.

MATERIALE ȘI METODE

Animale și condiții de adăpostire

Șoarecii mici (C57BL/6J lit/lit) și colegii lor heterozigoți (lit/ +) litterm au fost achiziționați de la The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, SUA), iar o colonie de reproducere a fost stabilită în adăpostul nostru de animale (43). Șoarecii mutanți au fost produși prin împerecherea femelelor C57BL/6J lit/lit cu masculi C57BL/6J lit/+. Șoarecii de ambele sexe la vârsta de 45-90 de zile au fost utilizați în teste. Ca martori, șoareci C57BL de tip sălbatic (+/+), obținuți de la Divizia de medicină tropicală, Școala de medicină a Universității din São Paulo (São Paulo, Brazilia), au fost utilizați la vârsta de 45-90 de zile (greutate corporală de 30 g). Greutățile corporale ale șoarecilor lit/lit și lit/+ au fost de aproximativ 10-12 g și, respectiv, 20-25 g, la aceeași vârstă și au fost obținute printr-o metodă sensibilă (43).

Șoarecii au fost menținuți într-o cameră cu aer condiționat la o temperatură de 24±1ºC. Apa și hrana au fost furnizate ad libitum, iar lumina a fost reglată după un program de 12 ore de lumină/12 ore de întuneric.

Un grup de șoareci a fost menținut în condiții de post prin eliminarea hranei după-amiaza, la aproximativ 17:00 h. Sângele a fost recoltat de la grupurile de șoareci aflați la post și de la grupurile de șoareci fără post în ziua următoare, la ora 09:00 h. Șoarecilor aflați la post li s-a furnizat apă ad libitum (43).

Această cercetare a fost aprobată de comitetul local de etică și a îndeplinit criteriile pentru experimente pe animale.

Analiza de secvențiere

Genotiparea a fost efectuată pentru a confirma și caracteriza genetic șoarecii lit/lit, lit/+ și wt/wt. Șoarecii au fost genotipizați prin amplificarea PCR a ADN-ului din coadă izolat cu ajutorul protocolului standard cu fenol al laboratorului nostru (44,45). Doi primeri, 5′-TGAGCTTGCATGCATGTCTTCA GG-3′ și 5′-GGGATTAGTAGACCAGCCAGTGA-3′ (temperatura de aneantizare, 60ºC), au fost utilizați pentru a amplifica regiunea genetică a mutației ghrhr Asp60Gly care determină fenotipul șoricelului mic (24). Analiza mutației a fost efectuată prin secvențiere automată cu ajutorul Big Dye Terminator v3.1 (310 Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA).

Circumstanțele înainte și înapoi au fost analizate în probe de ADN duplicat. Două programe software de editare a secvențierii (Gene StudioTM Professional Edition, Suwanee; și Mutation Surveyour, Softgenetics, PA, SUA) au fost utilizate pentru a identifica anomaliile ADN.

Preparate și injecții

GHRP-2 (200 µg/ml; lot KP102-HQ007; Pramorelin: D-alanil-3-(2-naftil)-D-alanil-3-(2-naftil)-D-alanil-L-alanil-L-triptofil-D-fenilalanil-L-lizinamidă dihidroclorură) a fost obținut de la Fujisawa USA, Inc. (Deerfield, IL). Șoarecilor li s-au administrat injecții intraperitoneale (i.p.) și au fost cântăriți. În funcție de proiectul experimental, au fost recoltate probe de sânge din sinusul orbital pentru măsurarea GH, IGF-I, leptină sau grelină.

Analizele imunologice

Nivelurile serice de GH de șoarece (mGH) au fost determinate prin intermediul unui RIA specific intern foarte sensibil, folosind reactivi obținuți de la Dr. A. F. Parlow de la National Hormone and Pituitary Program (NHPP, Torrance, CA) (46). Toate probele au fost analizate în dublu exemplar. În fiecare test, au fost utilizate ca martori interni loturi de seruri de șoareci C57BL wt/wt și de șoareci lit/lit. S-au folosit opt șoareci din fiecare tulpină, iar nivelul seric al GH a fost de 1,3±0,7 ng/ml la șoarecii lit/lit și de 6,5±1,8 ng/ml la șoarecii wt/wt C57BL. Nivelurile inițiale de GH la șoarecii lit/+ nu au fost semnificativ diferite de cele de la șoarecii C57BL wt/wt, probabil din cauza numărului de animale. Sensibilitatea testului GH, care a fost efectuat prin adăugarea întârziată a trasorului, a fost de 0,25±0,15 ng/ml, calculată în conformitate cu definiția lui Rodbard (47). Coeficientul de variație între teste a fost mai mic de 10 %.

Nivelurile de IGF-I au fost determinate în dublu exemplar cu ajutorul unui kit RIA IGF-I pentru șobolani (DSL-2900, Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, Texas, SUA) cu un nivel minim de detecție de 21 ng/ml și concentrații măsurabile cuprinse între 150 și 4 500 ng/ml.

Nivelurile de leptină au fost determinate cu ajutorul unui kit RIA pentru leptină de șobolan (Linco Research Inc., St. Charles, MO, SUA) cu o valoare minimă de detecție de 0,2 ng/ml și un interval de concentrații măsurabile de 0,2-12,8 ng/ml.

Nivelurile totale de grelină (octanoilat + desoctanoilat)(48) au fost determinate cu ajutorul unui kit RIA de ghrelină de șobolan (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA, SUA) cu o sensibilitate de ~5,4 pg/tube și un interval de 1-128 pg/tube. Nivelurile de ghrelină activă (octanoilată) au fost determinate cu ajutorul kitului Linco Research (St. Charles, MO). Pentru aceste măsurători, probele de sânge au fost colectate în tuburi care conțineau 0,78 mg K2EDTA (250-500 ml de sânge/tub), păstrate la gheață și rotite într-o centrifugă refrigerată. PMSF (0,1 mg/ml de plasmă) și HCl 1 M (50 ml/ml de plasmă) au fost adăugate la probele de plasmă. Probele au fost păstrate congelate la -70ºC până la măsurarea nivelurilor de grelină. Pentru kitul de ghrelină activă, coeficienții de variație intra- și inter-teste au fost de 6,5-9,5% și, respectiv, 9,6-16,2%. Pentru kitul de ghrelină totală, coeficienții de variație intra- și inter-teste au fost <10% și, respectiv, <15%.

Designul studiului

Două grupuri de șoareci C57BL de tip sălbatic (+/+), de vârstă compatibilă, au fost injectate inițial i.p. fie cu 1 µg (32 animale/grup), fie cu 10 µg (18 animale/grup) de GHRP-2, iar probele de sânge pentru măsurătorile GH au fost recoltate la momente diferite până la 1 h după injectare. S-au folosit trei șoareci pentru fiecare punct de timp, iar sângele a fost prelevat o singură dată înainte ca animalele să fie sacrificate. Într-un studiu pilot, 10 µg de GHRP-2 au fost administrate i.p. la 2-3 șoareci lit/lit, lit/+ și (wt/wt) (n = 18 animale/grup), iar răspunsul GH a fost măsurat la diferite momente până la 1 oră după injectare pentru a evalua efectele dozei și ale momentului.

Un studiu independent de două săptămâni a fost realizat cu șoareci lit/ lit tratați zilnic cu 10 µg GHRP-2 i.p. per șoarece (n = 6 șoareci pentru grupul de control și n = 8 șoareci pentru grupul experimental). Greutatea corporală a fost măsurată, iar sângele a fost prelevat la fiecare 3-4 zile pentru a măsura nivelurile de GH, IGF-I și leptină. După cum s-a descris anterior, greutatea corporală a fost măsurată folosind o metodologie precisă și foarte sensibilă (40). Pe scurt, greutatea corporală a animalelor a fost măsurată zilnic pe parcursul întregului experiment și apoi a fost utilizată pentru a calcula curbele de creștere individuale; pantele curbelor de creștere au fost apoi utilizate ca parametri de răspuns. În cazul șoarecilor luminați/luminați, variația zilnică acceptabilă a greutății în ultimele zece zile înainte de fiecare test (perioada de pretestare) a fost de 0,0025±0,0045 g/zi (36,40). Astfel, aproximativ 10 % din populația de șoareci pitici homozigoți a fost respinsă. Criteriile noastre de selectare a șoarecilor lit/lit s-au bazat pe curbele de creștere ale șoarecilor homozigoți (lit/lit) și heterozigoți (lit/+) din tulpina C57BL/6J, care fuseseră deja stabilite într-un studiu anterior (36) și confirmate în continuare de genotiparea efectuată aici.

Pentru a evalua și compara ariile de sub curbă ale valorilor hormonale, a fost definită o unitate arbitrară de concentrație (ng/ml/timp (min)).

Statistică

Pentru a analiza nivelurile de leptină și răspunsurile hormonale măsurate prin datele privind aria de sub curbă (AUC), s-a efectuat o analiză de varianță (ANOVA) în două direcții, cu timpul și tratamentul ca variabile independente. Testul t al lui Student cu ajustarea lui Bonferroni a fost utilizat pentru toate valorile obținute după inițierea tratamentului. Pentru toate celelalte măsurători, s-a utilizat testul t împerecheat al lui Student pentru a evalua semnificația diferențelor. p,0,05 a fost considerat ca fiind semnificativ.

REZULTATE

Analiză a mutațiilor ghr

ADN-ul a fost extras dintr-o probă de sânge de la un șoarece lit/lit folosind metode de rutină descrise în altă parte (44,45). S-a efectuat PCR utilizând amorsele raportate anterior, urmată de analiza secvențială a genei ghrhr.

O mutație germinală homozigotă ghrhr Asp60Gly a fost confirmată la șoarecele lit/lit, în timp ce o mutație heterozigotă ghr Asp60Gly ghr a fost verificată la partenerii lit/+ littermates. În schimb, șoarecii C57BL/6J de tip sălbatic (+/+) nu au găzduit această mutație germinală (figura 1). Aceste date au confirmat genotipurile celor trei linii de șoareci utilizate în studiul de față, respectiv: +/+, Asp60Asp; lit/+, Asp60Gly și lit/lit, Gly60Gly (figura 1).

Nivelurile bazale de GH și IGF-I la șoarecii normali și homozigoți

Nivelurile medii bazale de mGH la cei 18 șoareci homozigoți lit/lit (1,16±0,97 ng/ml; interval, 0,28-4.0 ng/ml) au fost semnificativ mai mici decât cele observate la cei 46 de martori de tip sălbatic (+/+) (5,36±2,60 ng/ml; interval, 1,05-14,0 ng/ml; p<0,001) sau la cei 12 colegi lit/+ heterozigoți (lit/+) ai acestora (6,60±2,35 ng/ml; interval, 4,25-11,5 ng/ml; p<0,001). În plus, concentrațiile bazale de GH observate la șoarecii lit/+ și +/+ nu au fost semnificativ diferite.

Valoarea serică bazală a IGF-I la cei 8 șoareci lit/lit (231±103 ng/ml; interval, 120-420) a fost clar mai mică decât cea de la cei 8 martori +/+ (473±104 ng/ml; interval, 330560 ng/ml; p<0,001).

Răspunsul GH la administrarea acută de GHRP-2

A fost demonstrat inițial că creșterea GH la șoarecii martor de tip sălbatic C57BL ca răspuns la 1 µg de GHRP-2 a fost semnificativ mai mică (creștere de ~două ori față de nivelurile bazale) decât creșterea ca răspuns la 10 mg de GHRp-2 i.p. (creștere de 24 de ori față de valorile bazale; p<0,05). Astfel, doza de 10 μg de GHRP-2 a fost selectată pentru evaluarea răspunsurilor GH în cele trei grupuri de șoareci (+/+, lit/+ și lit/lit).

Răspunsul maxim mediu al GH în grupul de control (+/+) a fost de 163 ng/ml și a avut loc la 10 min după administrarea de GHRP-2, cu o creștere de 24 de ori față de nivelurile inițiale (figura 2). La șoarecii lit/+ și lit/lit, a existat un răspuns semnificativ al GH la GHRP-2 la 5-10 min. La douăzeci de minute după injectarea GHRP-2, nivelurile de GH au revenit la valorile inițiale.

Aceste date indică faptul că răspunsul GH la 10 µg GHRP-2 (9,3±1,5 ng/ml; intervalul 8-11 ng/ml) observat la șoarecii homozigoți lit/lit a fost semnificativ mai mare decât cel la șoarecii lit/lit injectați cu soluție salină (1,04±1,15 ng/ml; p<0,001). Mai mult, răspunsul GH la GHRP-2 la șoarecii lit/lit a fost semnificativ mai mic decât cel observat la partenerii heterozigoți (lit/+) litterm (9,3±1,5 ng/ml vs. 34,5±9,7 ng/ml; p<0,01) sau la șoarecii de tip sălbatic ( +/+) (163±46 ng/ml; p<0,005). Astfel, răspunsul GH la GHRP-2 la șoarecii lit/+ a fost intermediar față de cel observat la șoarecii lit/lit și +/+ (Figura 2).

Creșterea absolută a GH față de valoarea inițială la șoarecii lit/lit, lit/+ și +/+ a fost de 8,3, 28,8 și, respectiv, 156 ng/ml, ceea ce confirmă diferențele marcante în secreția de GH între cele trei tulpini de șoareci studiate. Creșterea nivelului de GH față de valoarea inițială în urma administrării acute a 10 µg de GHRP-2 nu a fost semnificativ diferită între șoarecii lit/lit și lit/+ (8,9-vs. 6,1 ori; p>0,05). Cu toate acestea, creșterea GH ca răspuns la GHRP-2 a fost semnificativ diminuată la șoarecii lit/lit (p<0,005) și lit/+ (p<0,01) în comparație cu martorii. Suprafețele individuale sub curbă (AUC) ale GH seric ca răspuns la administrarea acută de GHRP-2 au confirmat și mai mult diferențele semnificative dintre șoarecii lit/lit tratați cu GHRP-2 și cei tratați cu soluție salină (figura 3).

Răspunsurile la administrarea de GHRP-2 timp de două săptămâni

Cum era de așteptat, s-a observat o creștere marcantă a greutății corporale la șoarecii lit/lit atunci când 10 µg de GHRP-2 au fost injectați i.p. (49) o dată pe zi timp de două săptămâni, în comparație cu injectarea vehiculului de control (p<0,02; Figura 4). Cu toate acestea, nivelurile de GH și IGF-I nu au crescut în mod semnificativ în timpul administrării de GHRP-2 timp de două săptămâni (datele nu sunt prezentate). Mai mult, nivelurile de leptină marcat ridicate (p<0,005) la șoarecii lit/lit au fost observate în ziua 15 a tratamentului cu GHRP-2.

Nivelurile serice de ghrelină și leptină

Concentrațiile de acil ghrelină plasmatică și de ghrelină totală (acil + deacil), care pot avea acțiuni biologice independente și interrelaționate, și concentrațiile de leptină serică la șoarecii +/+, lit/+ și lit/lit în stare de repaus alimentar și alimentați sunt prezentate în tabelul 1. În stare de repaus alimentar, nivelurile plasmatice medii de acil ghrelină și ghrelină totală la șoarecii lit/lit au fost semnificativ mai mici (cu 78,9% și, respectiv, 37,6%) decât la șoarecii +/+. Șoarecii heterozigoți lit/+ au avut, de asemenea, niveluri semnificativ mai scăzute de acil-grelină și ghrelină totală la post (cu 80,5% și, respectiv, 44,9%) în comparație cu șoarecii martori. La șoarecii lit/lit, acil ghrelina plasmatică în stare de alimentație a fost cu 93,8% mai mare decât în stare de post. În schimb, la șoarecii de tip sălbatic, acil ghrelina plasmatică a fost cu 82,5% mai mică (p<0,001), iar ghrelina totală a fost cu 61% mai mică (p<0,001) în stare de alimentație decât în stare de post. Diferența nivelurilor plasmatice de acil ghrelin în stare de alimentație între cele două grupuri (157±70 pg/ml pentru șoarecii +/+ față de 67±18 pg/ml pentru lit/lit) a fost semnificativă (p<0,05). Mai mult, nivelurile totale de ghrelină au fost cu 23,4% mai mari în starea de post decât în starea de alimentație pentru șoarecii lit/lit.

Nivelurile de leptină serică ale șoarecilor lit/lit la post au fost cu 348% mai mari decât cele ale șoarecilor +/+ la post (p<0,005). Șoarecii lit/+ la post au fost, de asemenea, diferiți de șoarecii lit/lit (cu 50% mai mici, p<0,02) și de șoarecii +/+ (123% mai mari, p<0,005). Mai mult, la șoarecii lit/lit, nivelurile de leptină serică în stare de alimentație au scăzut cu 35% în comparație cu starea de post (p>0,05). În plus, nivelurile de leptină la șoarecii hrăniți lit/+ și +/+ hrăniți au fost cu 37% și, respectiv, 16% mai mari decât la animalele aflate la post (p>0,05).

DISCUȚII

Au fost documentate mai multe mutații spontane homozigote germinale homozigote la șoareci care au ca rezultat deficitul de hormoni hipofizari și nanismul (34). Astfel, fenotipurile șoarecilor pitici Ames rezultă din mutații în gena Prop1 și prezintă o deficiență congenitală a mai multor hormoni hipofizari, inclusiv a GH (50). În plus, șoarecii pitici Snell cu mutații în gena pit prezintă nanism care rezultă din deficitul de GH, hipotiroidism și infertilitate (51). Mai mult, fenotipul șoarecilor mici rezultă din mutații homozigote în gena ghrh-r (33). Mutații homozigote germinale echivalente în genele PROP1, PIT și GHRH-R au fost raportate la oameni care prezintă statură mică severă (37,52,53).

Mutațiile GHRRH-R au fost sugerate în mod specific ca fiind cauza absenței unui răspuns al GH la GHRP-2 la om (54). Cu toate acestea, alte câteva studii au documentat o creștere limitată, dar semnificativă din punct de vedere statistic, a GH după administrarea de GHRP-2 la acești pacienți (28-30). În mod similar, s-a sugerat că șoarecele mic este rezistent la acțiunea GHRP-2 și nu prezintă o creștere a GH după administrarea acestei peptide (41). Astfel, scopul principal al studiului de față a fost de a investiga dacă șoriceii mici au o rezistență absolută la acțiunea GHRP, așa cum a fost descris anterior, sau dacă prezintă un răspuns GH semnificativ din punct de vedere statistic la unul dintre GHRP, și anume GHRP-2, așa cum se observă la om. Pentru a detecta variațiile minore de GH în ser, am utilizat o metodă mGH îmbunătățită pentru a discrimina mai bine posibilele creșteri de GH după administrarea de GHRP-2.

Din câte știm noi, nicio altă lucrare de până acum nu a reinvestigat în mod specific această problemă la șoarecii mici. De remarcat, a fost documentată rezistența completă la GH la GHRP-2 la șoarecii ghrh-knockout. Cu toate acestea, șoarecii ghrh-knockout și șoarecii mici au mutații în gene diferite, deși fenotipurile lor sunt similare. În plus, este posibil ca diferitele metode GH și condiții experimentale să fi influențat aceste rezultate aparent contradictorii.

Răspunsurile GH la GHRP-2

Dezvoltarea și funcția celulelor somatotrofe sunt dependente de GHRH (1), după cum indică constatările noastre privind un răspuns limitat al GH la administrarea acută de GHRP-2 la șoarecii lit/lit purtători ai unei mutații homozigote în ghrhr. Presupunând că ghrhr este complet inactiv la șoarecii lit/lit (39), constatările noastre actuale indică faptul că cel puțin o parte din eliberarea de GHS-GH independentă de GHRH are loc prin activarea GHS-R.

În plus față de somatotrofele mature dependente de GHRH, celulele stem producătoare de GH au fost găsite în glandele hipofizare ale șoarecilor lit/lit și la șoarecii adulți în vârstă de 60 de zile (26).

Cu toate acestea, nu se știe dacă GHRP-2 și/sau ghrelina acționează ca un factor trofic pentru celulele stem producătoare de GH independent de acțiunea hipofizară a GHRH.

Nu a fost raportată anterior lipsa unui răspuns GH la șoarecii lit/lit la un alt tip de GHS, GHRP-6 (41), poate fi legată de utilizarea unui test GH mai puțin sensibil (10 ng/ml față de 0,25 ng/ml pentru testul nostru). În plus, GHRP-2 are o potență biologică mai mare (de aproximativ șase ori mai mare) decât GHRP-6 pentru declanșarea eliberării de GH (14-16). Absența răspunsurilor GH la GHRP-6 a fost, de asemenea, sugerată inițial la oamenii cu o mutație Glu72Stop GHRH-R (42). Cu toate acestea, alte câteva studii au documentat prezența unui răspuns semnificativ din punct de vedere statistic, deși diminuat, la GH la GHRP-2 la pacienții cu statură scurtă genetică care adăpostesc o genă GHRHRHR sever trunchiată (28-30).

În plus, nu s-au observat nici creșteri acute, nici cronice ale GH la șoarecii ghrh-knockout și s-a concluzionat că GHRP-2 are un efect de stimulare a creșterii care mărește răspunsul indus de JI-38 (55,56). Cu toate acestea, este important de remarcat faptul că: a) șoarecii knockout și animalele care prezintă mutații spontane ale liniei germinale similare sau chiar echivalente se pot comporta diferit; b) metodele mGH utilizate pentru a studia șoarecii mici și șoarecii knockout ar putea fi diferite; și c) în aceste studii au fost utilizate modele experimentale diferite (28-30,55,56).

Răspunsurile intermediare ale GH la GHRP-2 la șoarecii lit/+ pot fi rezultatul unor diferențe calitative și/sau cantitative la nivelul celulelor somatotrofe, deși ar trebui efectuate cercetări suplimentare pe această temă pentru a confirma aceste constatări. Aceste date pot sugera un efect de dozare genetică asupra funcției celulelor somatotrofe, care ar deveni mai afectată în funcție de vârstă. În mod similar, un efect de dozare genetică a fost propus anterior pentru cazurile care poartă o mutație în gena GHRHR (52).

Important este faptul că metoda noastră GH RIA a fost capabilă să detecteze prezența unor niveluri foarte scăzute de GH (~0,25 ng/ml) la șoarecii mici cu o precizie acceptabilă; date similare sunt rareori disponibile în literatura de specialitate. Kituri GH cu sensibilități mai mici au fost folosite de alții. Cu toate acestea, nu au fost găsite alte rapoarte care să abordeze nivelurile serice de GH ale șoarecilor lit/lit obținute prin intermediul unui RIA omolog specific omolog. Cheng et al. au raportat niveluri serice de GH de 0,61±0,09 ng/ml la șoarecii lit/lit masculi și femele și de 8,50±0,75 ng/ml și, respectiv, 2,85±0,33 ng/ml la șoarecii lit/+ masculi și femele. Marmary et al. au raportat niveluri serice de GH de 1,08±0,06 ng/ml și de 20,35±22,9 ng/ml la șoarecii pitici Snell și, respectiv, la partenerii lor de control (58). S-au raportat, de asemenea, estimări ridicate ale nivelului absolut de GH seric determinat cu ajutorul unui RIA de GH de șobolan heterolog (59,60).

Creștere în urma administrării de GHRP-2

În acest studiu, s-a observat o creștere certă a greutății corporale a șoarecilor mici după administrarea de GHRP-2.

Aceste constatări sunt în concordanță cu alte studii care au documentat o creștere semnificativă a greutății corporale la șoarecii ghrh-knockout tratați cu GHRP-2 și la șoareci după administrarea de grelină, ceea ce arată că ambele peptide induc adipozitate la aceste animale (61). De remarcat, Alba și colab. nu au observat o creștere a creșterii longitudinale a șoarecilor ghrh-knockout în timpul unui tratament de șase săptămâni cu GH RP-2 la o doză de 10 µg injectată subcutanat (s.c.) de două ori pe zi, ceea ce a confirmat rolul esențial al GHRH în secreția de GH și creșterea corporală ulterioară (48). În plus, un tratament cronic de șase săptămâni cu 10 µg s.c. de GHRP-2 nu a crescut răspunsul acut al GH (30-min). Această discrepanță ap părintească față de constatările noastre poate fi rezultatul unor diferențe în ceea ce privește timpul de recoltare a sângelui sau sensibilitatea dozării GH, diferite metode de administrare a medicamentului (s.c. vs. i.p.) sau o combinație a acestor factori.

Nivelurile de leptină și ghrelină la șoarecii lit/lit

Am evaluat, de asemenea, dacă GHRP-2 ar influența nivelurile de leptină și ghrelină.

Nivelurile de ghrelină acilă și ghrelină totală la post au fost mai mari la șoarecii de tip sălbatic +/+ decât la șoarecii hrăniți (61-63). Reglarea fiziologică a ghrelinului plasmatic (adică creșterea și scăderea acestuia în starea de post și, respectiv, de alimentație) a fost diferită la șoarecii lit/lit. Această constatare poate fi rezultatul unei lipse de efect a acțiunii GHRH și a inactivității sale GHRH-R, deși această ipoteză ar trebui să fie testată în continuare.

Nivelurile serice ridicate de leptină bazală și o creștere suplimentară după administrarea prelungită de GHRP-2 la șoarecii lit/lit au fost observate, de asemenea, la șoarecii tratați cu ipamorelină (34). Se consideră că aceste constatări reflectă masa crescută a țesutului adipos la șoarecii cu deficit de GH și efectul adipogenic al GHRP-2 și al ghrelinei (61-63).

Pentru a investiga efectele lipogenice ale acestor peptide la șoareci, dozele de GHRP-2 utilizate în prezentul studiu au fost similare cu cele utilizate de Tschop et al. și cu dozele de GHRP-6 utilizate de Jansson et al. și Lall et al. (38,49,61). Cu toate acestea, pe baza greutății corporale, aceste doze au fost proporțional mult mai mari decât cele testate la oamenii cu o mutație GHRH-R, ceea ce ar putea reflecta diferențele interspecii în ceea ce privește sensibilitatea la GHS (61).

Datele noastre limitate privind nivelurile de octanoil ghrelină (ghrelin) și leptină serică la șoarecii hrăniți față de șoarecii de tip sălbatic (+/+) și lit/lit (-/-) la post (17 h) pot sugera relații disfuncționale între acești doi hormoni metabolici. Așa cum era de așteptat, nivelurile plasmatice de grelină au fost normale la șoarecii de tip sălbatic hrăniți și crescute la șoarecii de tip sălbatic la post, deși s-a observat și efectul opus, deoarece ghrelina și leptina au fost crescute în starea hrănită și nu au mai crescut în starea de post. În plus, rezultatele obținute la șoarecii lit (+/-) au fost parțial paralele cu cele obținute la șoarecii lit (-/-), în sensul că nivelurile plasmatice de grelină nu au crescut odată cu postul, iar în timpul postului, nivelurile serice de leptină au rămas ridicate la șoarecii lit (+/și -/-) hrăniți și la cei aflați la post. Cu toate acestea, numărul limitat de animale studiate a împiedicat formularea unor concluzii suplimentare. În cele din urmă, măsurarea ghrelinei totale ca indicator al nivelurilor de octanoil ghrelină poate fi problematică. Deși nivelurile de ghrelină totală și octanoilată pot fi parțial paralele între ele, această concordanță devine mai puțin evidentă în condiții fiziopatologice, cum ar fi în cazul prezentului studiu pe șoareci. Tot mai multe dovezi susțin activitatea biologică a moleculei de ghrelină desoctanoilată și, prin urmare, sprijină măsurarea nivelurilor plasmatice de ghrelină desoctanoilată printr-un test specific, cum ar fi cel publicat de Akamizu et al. (64).

În concluzie, constatările noastre sunt primele care documentează prezența unor creșteri semnificative din punct de vedere statistic ale GH în urma administrării de GHRP-2 la șoareci mici. Datele oferă un sprijin suplimentar pentru o acțiune directă a GHRP-2 în glanda pituitară a șoarecilor mici. Mai mult, șoarecii heterozigoți lit/+ pot prezenta tulburări subtile în axa GHRH/GHRH-R/GH, ceea ce sugerează un efect genetic de dozare, deși sunt necesare date suplimentare pentru a confirma această concluzie.

RECUNOȘTINȚE

Recunoaștem Cristina T. Kanamura, B.S., și Venâncio A. F. Alves, M.D., de la Divizia de Patologie, Institutul Adolfo Lutz, São Paulo, pentru sprijinul tehnic. Am dori să mulțumim Dr. Heitor F. Andrade Jr. care a furnizat animalele C57BL wt/wt. Această cercetare a fost sprijinită parțial de FAPESP (01/11091-0). S.P.A.T. și P.B. sunt cercetători ai Consiliului Național de Cercetare (CNPq). RAT este beneficiarul unei burse postdoctorale FAPESP (2009/15386-6). SPAT este beneficiarul unei burse și al unui grant CNPq (401990/2010-9).

CONTRIBUȚIILE AUTORULUI

Peroni CN, Nascimento N, și Bartolini P au efectuat experimentele și au colaborat la pregătirea manuscrisului. Hayashida CY a colaborat la redactarea manuscrisului. Toledo RA și Longuini VC au efectuat analizele genetice. Bowers CY a colaborat la testarea produsului (ghrp-2), la măsurătorile de grelină și leptină și la întocmirea manuscrisului. Toledo SP a scris și a coordonat proiectul de cercetare și a fost cercetătorul principal responsabil cu pregătirea manuscrisului.

1. Mayo KE, Miller TL, De Almeida V, Zheng J, Godfrey PA. Receptorul hormonului de eliberare a hormonului de creștere: transducția semnalului, expresia genelor și funcția fiziologică în reglarea creșterii. Ann N Y Acad Sci. 1996;805:184-203, http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.1996.tb17483.x.

2. Kojima M, Hosada H, Date Y, Nakazato M, Matsui H, Kangawa K. Ghrelin este o peptidă acizilată eliberatoare de hormon de creștere din stomac. Nature. 1999;402:656-60, http://dx.doi.org/10.1038/45230.

3. Nass R, Gaylinn BD, Thorner MO. Rolul ghrelinei în secreția de GH și în tulburările de GH. Mol Cell Endocrinol. 2011;340:10-4, http://dx.doi.org/10.1016/j.mce.2011.03.021.

4. Gahete MD, Durán-Prado M, Luque RM, Martínez-Fuentes AJ, Quintero A, Gutiérrez-Pascual E, et al. Înțelegerea controlului multifactorial al eliberării hormonului de creștere de către somatotropi: lecții din endocrinologia comparativă. Ann N Y Acad Sci. 2009;1163:137-53, http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.2008.03660.x.

5. Kamenicky P, Lombès M, Chanson P. New insights in growth hormone physiology and pathophysiology. Ann Endocrinol (Paris). 2010;71(Suppl 1):S25-32, http://dx.doi.org/10.1016/S0003-4266(10)70004-4.

6. Cannata D, Vijayakumar A, Fierz Y, LeRoith D. The GH/IGF-1 axis in growth and development: new insights derived from animal models. Adv Pediatr. 2010;57:331-51, http://dx.doi.org/10.1016/j.yapd.2010.

7. Veldhuis JD, Bowers CY. Determinanți ai sinergiei hormonului de eliberare a GH și a peptidei de eliberare a GH la bărbați. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009;296:E1085-92, http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.91001.2008.

9. Frohman LA, Kineman RD, Kamegai J, Park S, Teixeira LT, Coschigano KT, et al. Secretagogi și somatotropul: semnalizare și proliferare. Rec. Prog Horm Res. 2000;55:269-91.

10. De Almeida VI, Mayo KE. Receptorul hormonului de eliberare a hormonului de creștere. Vitam Horm. 2001;63:233-76, http://dx.doi.org/10.1016/S0083-6729(01)63008-5.

11. Olsen LE, Rosenfeld MG. Perspectivă: abordări genetice și genomice în elucidarea mecanismelor de dezvoltare a hipofizei. Endocrinologie. 2002;143:2007-11, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.6.2007.

12. Howard AD, Feighner SD, Cully DF, Arena JP, Liberator PA, Rosenblum CI, et al. Un receptor în hipofiză și hipotalamus care funcționează în eliberarea hormonului de creștere. Știință. 1996;273:974-77, http://dx.doi.org/10.1126/science.273.5277.974.

13. Horvath TL, Diano S, Sotonyi P, Heiman M, Tschop M. Minireview: Ghrelin și reglarea echilibrului energetic – o perspectivă hipotalamică. Endocrinologie. 2001;142:4163-9, http://dx.doi.org/10.1210/en.142.10.4163.

14. Bowers CY. Peptida de eliberare a hormonului de creștere (GHRP). Cell Mol Life Sci. 1998;54:1316-29, http://dx.doi.org/10.1007/s000180050257.

15. Bowers CY. Peptide eliberatoare de GH (GHRP). În: GPH: Kostyo J, Goodman H eds. Handbook of Physiology (Manual de fiziologie). New York: Oxford University Press. 1999;267-97.

16. Bowers CY. Peptida de eliberare a hormonului de creștere nenaturală generează ghrelina naturală. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:1464-69, http://dx.doi.org/ 10.1210/jc.86.4.1464.

17. Laferrere B, Hart AB, Bowers CY. Subiecții obezi răspund la efectul stimulativ al agonistului ghrelin peptida-2 de eliberare a hormonului de creștere asupra aportului alimentar. Obezitate. 2006;14:1056-63, http://dx.doi.org/10.1038/oby.2006.121.

18. Dickson SL, Doutrelant-Viltart O, Leng G. Șobolanii dw/dww cu deficit de GH și șoarecii lit/lit prezintă o expresie Fos crescută în nucleul arcuat hipotalamic în urma injecției sistemice de peptidă eliberatoare de GH-6. J Endocrinol. 1995;146:519-26, http://dx.doi.org/10.1677/joe.0.1460519.

19. Yokote R, Sato M, Matsubara S, Ohye H, Niimi M, Murao K, et al. Clonarea moleculară și expresia genetică a receptorului peptidei de eliberare a hormonului de creștere în țesuturile de șobolan. Peptide. 1998;19:15-20, http://dx.doi.org/10.1016/S0196-9781(97)00263-5.

20. Ribeiro AC, LeSauter J, Dupré C, Pfaff DW. Relația dintre excitare și comportamentul anticipativ circadian: hipotalamusul ventromedial: un nod într-o rețea de foame-reașteptare. Eur J Neurosci. 2009;30(9):1730-8, http://dx.doi.org/10.1111/j.1460-9568.2009.06969.x.

21. Tamura H, Kamegai J, Shimizu T, Ishii S, Sugihara H, Oikawa S. Ghrelin stimulează GH, dar nu și aportul alimentar la șobolanii cu nucleul arcuat ablați. Endocrinologie. 2002;143:3268-75, http://dx.doi.org/10.1210/en.2002-220268.

22. Bowers CY, Reynolds GA, Durham D, Barrera CM, Pezzoli SS, Thorner MO. Peptida de eliberare a hormonului de creștere (GH) stimulează eliberarea de GH la bărbații normali și în mod sinergic cu hormonul de eliberare a GH. J Clin Endocrinol Metab. 1990;70:975-82, http://dx.doi.org/10.1210/jcem-70-4-975.

23. Pandya N, DeMott-Friberg R, Bowers CY, Barkan AL, Jaffe CA. Peptida-6 de eliberare a hormonului de creștere (GH) necesită hormonul hipotalamic endogen de eliberare a GH pentru stimularea maximă a GH. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83:1186-89, http://dx.doi.org/10.1210/jc.83.4.1186.

24. Horikawa R, Tachibana T, Katsumata M, Ishikawa H, Tanaka T. Reglarea expresiei ARN a receptorului hipofizar al hormonului de creștere-secretor și al receptorului ARN al hormonului de eliberare a hormonului de creștere la șobolanii pitici tineri. Endocr J. 2000;47:S53-S56, http://dx.doi.org/10.1507/endocrj.47.SupplMarch_S53.

25. Cunha SR, Mayo KE. Ghrelinul și secretagogii hormonului de creștere (GH) potențează producția de adenoză 39,59monofosfat ciclic indusă de hormonul de eliberare a GH (GHRH) în celulele care exprimă receptorii secretagogi GHRH și GH transfectați. Endocrinologie. 2002;143:4570-82, http://dx.doi.org/10.1210/en.2002-220670.

26. Dickson SL, leng G, Dyball RE, Smith RG. Acțiuni centrale ale secretagogilor peptidici și non-peptidici ai hormonului de creștere la șobolan. Neuroend ocrinologie. 1995;61:36-43, http://dx.doi.org/10.1159/000126825.

27. Popovic V, Damjanovic S, Micic D, Djurovic M, Diegez C, Casanueva FF. Blocarea secreției GH induse de peptida de eliberare a hormonului de creștere (GHRP-6) și absența acțiunii sinergice a GHRP-6 plus hormonul de eliberare a GH la pacienții cu deconectare hipotalamo-hipofizară: dovezi că acțiunea principală a GHRP-6 se exercită la nivel hipotalamic. J Clin Endocrinol Metab. 1995;80:942-47, http://dx.doi.org/10.1210/jc.80.3.942.

28. Gondo RG, Aguiar-Oliveira MH, Hayashida CY, Toledo SP, Abelin N, Levine MA, et al. Growth hormone-releasing peptide-2 stimulează secreția de GH la pacienții cu deficit de GH cu mutații ale receptorului hormonului de eliberare a GH. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:3279-83, http://dx.doi.org/10.1210/jc.86.7.3279.

29. Maheshwari HG, Pezzoli SS, Rahim A, Shalet SM, Thorner MO, Baumann G. Secreția pulsatilă a hormonului de creștere persistă în rezistența genetică la hormonul de eliberare a hormonului de creștere. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002;282:E943-E951.

30. Roelfsema F, Biermasz NR, Veldman RG, Veldhuis JD, Frölich M, Stokvis-Brantsma WH, et al. Secreția hormonului de creștere (GH) la pacienții cu un defect de inactivare a receptorului hormonului de eliberare a GH (GHRH) este pulsatilă: dovezi pentru un rol al intrărilor non-GHRH în generarea impulsurilor GH. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:2459-64, http://dx.doi.org/10.1210/jc.86.6.2459.

31. Mayo KE. Clonarea moleculară și exprimarea unui receptor specific hipofizar pentru hormonul de eliberare a hormonului de creștere. Mol Endocrinol. 1992;6:1734-44, http://dx.doi.org/10.1210/me.6.10.1734.

32. Godfrey P, Rahal JO, Beamer WG, Copeland NG, Jenkins NA, Mayo KE. Receptorul GHRH al șoarecilor mici conține o mutație missense în domeniul extracelular care întrerupe funcția receptorului. Nat Genet. 1993;4:227-32, http://dx.doi.org/10.1038/ng0793-227.

33. Lin SC, Lin CR, Lin CR, Gukovsky I, Lusis AJ, Sawchenko PE, Rosenfeld MG. Baza moleculară a fenotipului micului șoarece și implicațiile pentru creșterea specifică tipului de celule. Nature. 1993;364:208-13, http://dx.doi.org/10.1038/364208a0.

34. Beck JA, Lloyd S, Hafezparast M, Lennon-Pierce M, Eppig JT, Festing MFW, et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 2000;24:235, http://dx.doi.org/10.1038/71641.

35. Wajnrajch MP, Gertner JM, Harbison MD, Chua SC Jr, Leibel RL. Mutația Nonsense în receptorul hormonului de eliberare a hormonului de creștere uman cauzează un eșec de creștere analog cu cel al șoricelului mic (lit). Nat Genet. 1996;12:88-90, http://dx.doi.org/10.1038/ng0196-88.

36. Netchine I, Talon P, Dastot F, Vitaux F, Goossens M, Amselem S. Analiza fenotipică extensivă a unei familii cu deficit de hormon de creștere (GH) cauzat de o mutație în gena receptorului hormonului de eliberare a GH. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83:432-36, http://dx.doi.org/10.1210/jc.83.2.432.

37. Salvatori R, Hayashida CY, Aguiar-Oliveira MH, Phillips JA 3rd, Souza AH, Gondo RG, et al. Nanism familial datorat unei noi mutații a genei receptorului hormonului de eliberare a hormonului de creștere. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84:917-23, http://dx.doi.org/10.1210/jc.84.3.917.

38. Jansson JO, Downs TR, Beamer WG, Frohman LA. Rezistența asociată receptorilor la factorul de eliberare a hormonului de creștere la șoarecii pitici ”mici”. Știință. 1986;232:511-2.

39. Gaylinn BD, De Almeida VI, Lyons CE Jr, Wu KC, Mayo KE, Thorner MO. Receptorul mutant al hormonului de eliberare a hormonului de creștere (GHRH) al șoricelului mic nu se leagă de GHRH. Endocrinologie. 1999;140:5066-74, http://dx.doi.org/10.1210/en.140.11.5066.

40. Clark RG, Robinson ICAF. Efectele unui fragment al factorului de eliberare a hormonului de creștere uman la șoareci normali și mici. J Endocrinol. 1985;106:1-5, http://dx.doi.org/10.1677/joe.0.1060001.

41. Jansson JO, Downs TR, Beamer WG & Frohman LA. Șoarecele pitic mic (lit/ lit) este rezistent la peptida de eliberare a hormonului de creștere (GH) (GHRP-6), precum și la hormonul de eliberare a GH (GRH). Programul celei de-a 68-a reuniuni anuale a Societății Endocrine, Anaheim, CA, 1986; p.130 (rezumat).

42. Roh SG, Chen C, Chen C, Choi KC, Shrestha Y, Sasaki S. Este receptorul GHRH esențial pentru secreția de GH indusă de GHRP-2 în culturile primare de celule hipofizare de șobolan? Endocrinologie. 2002;143:1964-47, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.5.1964.

43. Bellini MH, Bartolini P. Biotest in vivo pentru determinarea potenței hormonului de creștere uman la ”șoarecii mici” pitici. Endocrinologie. 1993;132:2051-55, http://dx.doi.org/10.1210/en.132.5.2051.

44. Lourenço DM Jr, Toledo RA, Coutinho FL, Margarido LC, Siqueira SA, dos Santos MA, et al. Impactul screening-ului clinic și genetic asupra managementului neoplaziei endocrine multiple de tip 1. Clinici. 2007;62:465-76, http://dx.doi.org/10.1590/S1807-59322007000400014.

45. Toledo RA, Mendonça BB, Fragoso MCBV, Soares IC, Almeida MQ, Moraes MB, et al. Somatotropinom familial izolat: analiza expresiei 11q13-loh și a expresiei genice/proteice sugerează o posibilă implicare a aip și în tumorigeneza non-hipofizară. Clinică. 2010;65:40715, http://dx.doi.org/10.1590/S1807-59322010000400010.

46. Rodbard D. Estimarea statistică a concentrației minime detectabile (sensibilitate) pentru testele cu radioligand. Anal Biochem. 1978;90:1-12, http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(78)90002-7.

47. Bellini MH, Mathor MB, De Luca M, Cancedda R, Bartolini P. Ultrasensitive in vivo bioassay detectes bioactive human growth hormone in transduced primary human keratinocytes. J Endocrinol Invest. 1998;21:1-6, http://dx.doi.org/10.3109/07435809809031865.

48. Ghigo E, Arvat E, Arvat E, Muccioli G, Camanni F. Peptide de eliberare a hormonului de creștere. Eur J Endocrinol. 1997;136:445-60, http://dx.doi.org/10.1530/eje.0.1360445.

49. Lall S, Tung LYC, Ohlsson C, Jansson JO, Dickson SL. Stimularea independentă de hormonul de creștere (GH) a adipozității de către secretagogii GH. Biochem Biophys Res Commun. 2001;280:132-38, http://dx.doi.org/10.1006/bbrc.2000.4065.

50. Sornson MW, Sornson MW, Sornson MW, Wu W, Dasen JS, Flynn SE, Norman DJ, O’Connell SM, et al. Determinarea liniei hipofizare de către Prophet a factorului de homeodomaină Pit-1 defectuos în nanismul Ames. Nature. 1996; 384:327-33, http://dx.doi.org/10.1038/384327a0.

51. Li S, Crenshaw EB 3rd, Rawson EJ, Simmons DM, Swanson LW, Rosenfeld MG, Dwarf locus mutants lacking three pituitary cell types result from mutations in the POU-domain gene pit-1. Nature. 1990;347:528-33, http://dx.doi.org/10.1038/347528a0.

52. Hayashida CY, Gondo RG, Ferrari RG, Ferrari C, Toledo SP, Salvatori R, Levine MA, et al. Deficiența familială a hormonului de creștere cu gena mutantă a receptorului GHRH: constatări clinice și hormonale la indivizi homozigoți și heterozigoți din Itabaianinha. Eur J Endocrinol. 2000;142:557-63, http://dx.doi.org/10.1530/eje.0.1420557.

53. Pernasetti F, Toledo SP, Vasilyev VV, Hayashida CY, Cogan JD, Ferrari C, et al. Axa adrenocorticotropină-suprarenală afectată în deficitul combinat de hormoni hipofizari cauzat de o deleție de două perechi de baze (301-302delAG) în profetul genei Pit-1. J Clin Endocrinol Metab. 2000;85:390-7, http://dx.doi.org/10.1210/jc.85.1.390.

54. Maheshwari HG, Rahim A, Shalet SM, Baumann G. Lipsa selectivă a răspunsului hormonului de creștere (GH) la peptida eliberatoare de GH hexarelin la pacienții cu deficit de receptor al hormonului de eliberare a GH. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84:956-59, http://dx.doi.org/10.1210/jc.84.3.956.

55. Fintini D, Alba M, Schally AV, Bowers CY, Parlow AF, Salvatori R. Efectele tratamentului combinat pe termen lung cu un analog al hormonului de eliberare a hormonului de creștere și cu un secretagog al hormonului de creștere la șoarecele knock-out al hormonului de eliberare a hormonului de creștere. Neuroen docrinologie. 2005;82:198-207, http://dx.doi.org/10.1159/000092520.

56. Alba M, Fintini D, Bowers CY, Parlow AF, Salvatori R. Effects of longterm treatment with growth hormone-releasing peptide-2 in the GHRH knock-out mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005;289:E762-E767, http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.00203.2005.

57. Cheng TC, Beamer WG, Phillips JA, Bartke A, Mallonee RL, Dowling C. Etiologia deficitului de hormon de creștere la șoarecii pitici Little, Ames și Snell. Endocrinologie. 1983;113:1669-78, http://dx.doi.org/10.1210/endo-113-5-1669.

58. Marmary Y, Parlow AF, Goldsmith CM, He X, Wellner RB, Satomura K, et al. Construcția și eficacitatea in vivo a unui adenovirus recombinant cu deficit de replicare care codifică hormonul de creștere murin. Endocrinologie. 1999;140:260-65, http://dx.doi.org/10.1210/en.140.1.260.

59. Hammer RE, Palmiter RD, Brinster RL. Corectarea parțială a tulburării de creștere ereditară murină prin încorporarea în linia germinală a unei noi gene. Nature. 1984;311:65-7, http://dx.doi.org/10.1038/311065a0.

60. Hahn TM, Copeland KC, Copeland KC, Woo SLC. Corecția fenotipică a nanismului prin exprimarea constitutivă a hormonului de creștere. Endocrinologie. 1996;137:4988-93, http://dx.doi.org/10.1210/en.137.11.4988.

61. Tschop M, Smiley DL, Heiman ML. Ghrelin induce adipozitatea la rozătoare. Nature. 2000;407:908-13, http://dx.doi.org/10.1038/35038090.

62. Toshinai K, Mondal MS, Nakazato M, Date Y, Murakami N, Kojima M, et al. Upregulation of ghrelin expression in the stomach upon fasting, insulin-induced hypoglycemia, and leptin administration. Biochem Biophys Res Commun. 2001;281:1220-25, http://dx.doi.org/10.1006/ bbrc.2001.4518.

63. Tschop M, Statnich MA, Suter TM, Heiman ML. GH-releasing peptide-2 crește masa de grăsime la șoarecii lipsiți de NPY: indicație pentru un rol mediator crucial al proteinei hipotalamice legate de agouti. Endocrinologie. 2002;143:558-68, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.2.558.

64. Akamizu T, Shinomiya T, Irako T, Fukunaga M, Nakai Y, Nakai Y, et al. Măsurarea separată a nivelurilor plasmatice ale ghrelinei acilate și desacilate la subiecții sănătoși folosind un nou test ELISA direct. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90:6-9, http://dx.doi.org/10.1210/jc.2004-1640.