Asamblarea și adnotarea genomului

Pentru a asambla genomul H. medicinalis, am extras ADN de la o lipitoare adultă. Înainte de a fi prelucrată, lipitoarea a fost menținută fără hrană timp de cel puțin 2 luni. Am creat un set de trei biblioteci shotgun pentru a efectua secvențierea cu ajutorul a trei platforme diferite (tabelul suplimentar 1). Toate seturile de date citite au fost combinate, iar un singur ansamblu a fost creat de SPAdes . Ansamblul rezultat conținea 168.624 de contig-uri cu o lungime N50 a contig-urilor de 12,9 kb (tabelul suplimentar 2).

Analiza preliminară (contig-uri BlastN) a relevat prezența secvențelor bacteriene în ansamblul rezultat. Prin urmare, am efectuat binning pentru a discrimina contigurile lipitoare (un bin lipitoare). Am construit o distribuție a contigurilor în funcție de abundența GC, de frecvențele tetranucleotidelor și de acoperirea citirilor. Pentru a crește acuratețea binning-ului, acoperirea citirilor a fost determinată prin combinarea citirilor ADN cu citirile corespunzătoare unui transcriptom combinat de H. medicinalis (a se vedea mai jos). Discriminarea contigurilor eucariote și procariote este ilustrată în Fig. 1a/b, în tabelul suplimentar 3 și în datele suplimentare 2. În plus, am selectat contigurile mitocondriale pentru a asambla genomul mitocondrial al lipitorilor .

Contigurile eucariote au fost supuse unei proceduri de scheletare folosind lecturi împerecheate. Eșafodajele au fost generate utilizând seturi de date Illumina cu citire împerecheată și cu citire pereche de către SSPACE . După scheletare, ansamblul a constat din 14 042 de secvențe cu o lungime de schelet N50 de 98 kb (tabelele suplimentare 4 și 5). Lungimea genomului lipitorilor este estimată la 220-225 Mb. Lungimea totală a proiectului de genom asamblat este de 187,5 Mbp, ceea ce corespunde la 85 % din dimensiunea teoretică a genomului de lipitoare (a se vedea tabelul suplimentar 6). În total, au fost prezise 14.596 de gene care codifică proteine.

De asemenea, am identificat noi omologi ai genelor care codifică anticoagulante cunoscute sau proteine legate de mesele de sânge. Alinierile multiple de aminoacizi pentru fiecare dintre aceste familii de proteine (Figurile suplimentare 1, 2) Pe baza datelor de secvență a genomului și folosind secvențe de proteine cunoscute, am determinat organizarea acestor gene (Tabelul suplimentar 7, Fig. 1b). Pozițiile și lungimile exonilor și intronilor au fost prezise folosind secvențele cADN și proteice respective ca referințe. În unele cazuri, genele sunt localizate în schele comune și formează tandemuri sau clustere Fig. 1b.

mRNA-seq, asamblare și adnotare a transcriptomului

Pentru a obține probe de ARNm specifice țesuturilor din trei specii de lipitori medicinale, H. medicinalis, H. verbаna și H. orientalis, am izolat celulele salivare și mușchii din criosecțiile părților anterioare ale corpului cu ajutorul microdisecției cu laser (Fig. 2a). Apoi, am construit două biblioteci de ADNc cu și fără normalizare pentru fiecare probă de ARNm folosind primerul oligo-dT și le-am secvențiat pe Ion Torrent PGM (tabelul suplimentar 8). Patru seturi de date de citire corespunzătoare bibliotecilor de ADNc construite au fost utilizate pentru asamblarea de novo a unui transcriptom combinat pentru fiecare specie de lipitori medicinale cu ajutorul ansamblatorului Trinity RNA (tabelul suplimentar 9). Am utilizat transcriptomii combinați pentru a cartografia citirile specifice țesuturilor nenormalizate. Cartografierea citirilor a fost necesară pentru a efectua analiza expresiei diferențiale consecutive.

Analiza Gene Ontology (GO) a transcriptelor detectate a fost efectuată cu ajutorul Blast2GO și BlastX. Baza de date „nr” a servit ca bază de date de referință. Analiza GO a demonstrat că toate cele trei specii de lipitori medicinale au avut distribuții similare de transcripte în toate categoriile GO (Figura suplimentară 3). Distribuția taxonomică a celor mai apropiate rezultate BlastX a fost, de asemenea, similară (Figura suplimentară 4). S-a constatat că majoritatea transcriptelor identificate se potrivesc cu două specii de Annelida: 59,8 % la H. robusta și 10,7 % la C. teleta. Această analiză a confirmat, de asemenea, absența contaminării cu transcripte care nu provin de la annelide.

Predicerea regiunilor de codificare (sau a cadrelor deschise de citire, ORF) și adnotarea datelor transcriptomice au fost efectuate cu ajutorul Transdecoder și Trinotate. ORF-urile au fost traduse cu ajutorul algoritmului BlastP, iar secvențele de proteine au fost adnotate prin clasificarea EuKaryotic Orthologous Groups (KOG) folosind baza de date eggNOG (Figura suplimentară 5). Clasificarea KOG a evidențiat faptul că toate cele trei specii de lipitori medicinale au distribuții similare ale transcrierilor în categoriile KOG. De asemenea, s-a constatat că toate cele trei specii de lipitori medicinale împărtășesc marea majoritate a grupurilor lor ortologice (Figura suplimentară 6).

Analiza expresiei diferențiale

Pentru a estima nivelurile de expresie relativă ale transcriptelor identificate în celulele salivare și în mușchi și pentru a identifica transcriptele unice pentru celulele salivare, am cartografiat citirile ADNc specifice țesutului fără normalizare față de transcriptomul combinat al fiecărei specii de lipitori medicinale. De asemenea, am cartografiat citirile ADNc specifice țesutului de H. medicinalis în raport cu ansamblul genomului său. Genele exprimate diferențiat au fost detectate în conformitate cu un protocol recent . Pentru a identifica genele care sunt exprimate diferențiat în celulele salivare și în mușchi, a fost construit un grafic MA individual pentru fiecare specie de lipitori medicinale folosind transcriptomul său combinat (Fig. 2b, Figura suplimentară 7). Un grafic MA suplimentar a fost construit pentru H. medicinalis folosind ansamblul său genomic (Fig. 2c). Genele cu o valoare q (FDR) < 0,05 au fost considerate ca fiind exprimate diferențiat.

Am identificat 102, 174 și 72 de transcripte exprimate diferențiat în celulele salivare de H. medicinalis, H. orientalis și, respectiv, H. verbana. Deoarece cele trei sunt specii de lipitori medicinale strâns înrudite, secvențele proteice ale transcriptelor exprimate diferențiat au fost grupate în clustere ortologe pentru a simplifica analiza funcțională ulterioară. Am identificat 25 de clustere ortologe, exprimate diferențiat, împărtășite de trei specii de lipitori și 44 de clustere ortologe împărtășite de cel puțin două specii de lipitori (Fig. 3, tabelele suplimentare 10-11). Majoritatea secvențelor din clusterele ortologe identificate corespund unor proteine ipotetice notate în genomul H. robusta. Analiza domeniilor conservate în clusterele ortologe identificate a permis determinarea secvențelor aparținând familiilor de proteine cunoscute.

Am analizat, de asemenea, genele exprimate diferențiat de H. medicinalis folosind ansamblul genomului său. Lecturile ADNc pentru celulele salivare, mușchii și țesutul neural (lecturile au fost obținute din Sequence Read Archive (SRA)) au fost mapate pe ansamblul genomului. Pentru țesutul neural, am utilizat un set de date de citire pentru ganglionul 2, datorită localizării acestuia în segmentele preorale. Analiza expresiei diferențiale a identificat 42 de gene unice pentru celulele salivare ale H. medicinalis (Tabelul suplimentar 12).

Proteomica secreției celulelor salivare

Pentru analiza proteomică, am colectat SCS-uri de la trei specii de lipitori medicinale, H. medicinalis, H. orientalis și H. verbana, care au fost menținute fără hrană timp de cel puțin 2 luni. SCS-urile au fost colectate în conformitate cu o metodă raportată anterior, cu unele modificări (a se vedea secțiunea Metode).

Metoda de pregătire a probelor este esențială pentru repertoriul rezultat al proteinelor identificate, deoarece SCS-ul constă atât din componente cu greutate moleculară mică, cât și din componente cu greutate moleculară mare și conține inhibitori de protează, complexe glicoproteice și lipide. Aceștia din urmă pot forma complexe cu proteinele . Prin urmare, am combinat mai multe metode de pregătire a probelor și mai multe tehnici de spectrometrie de masă pentru a acoperi cel mai larg repertoriu al proteinelor din SCS. Seturile de date proteomice obținute prin diferite metode de pregătire a probelor și tehnici de spectrometrie de masă au fost combinate pentru a crea o listă finală a proteinelor identificate pentru fiecare specie de lipitori medicinale.

Am identificat 189, 86, 344 de proteine în SCS-urile de H. medicinalis, H. orientalis și, respectiv, H. verbana și le-am grupat în clustere ortologe, așa cum am descris mai sus. S-a constatat că toate cele trei specii de lipitori medicinale împărtășesc 39 de clustere ortologe, iar 50 de clustere ortologe au fost împărtășite de cel puțin două specii (Fig. 3, Tabelul suplimentar 13). Combinarea datelor transcriptomice și proteomice a evidențiat 25 de clustere ortologe de gene exprimate în mod unic în celulele salivare (tabelul suplimentar 11). O listă a componentelor individuale ale SCS de lipitoare este prezentată în Fig. 3. În mod surprinzător, genele care codifică anticoagulantele cunoscute ale SCS și proteinele legate de masa sanguină nu au prezentat expresia diferențiată între celulele salivare și mușchi. Pentru a valida această constatare, am examinat expresia saratinelor, a eglinei C, a bdellinelor, a hirustasinei, a destabilazei, a inhibitorului de metalo-carboxipeptidază, a apirazei și a enzimei de conversie a angiotensinei (ACE) prin PCR în timp real a unor biblioteci de ADNc suplimentare, independente și specifice țesutului, construite pentru celulele salivare și mușchi. Rezultatele PCR în timp real pentru hirudină și destabilază (figura suplimentară 8) au confirmat această constatare. Acest lucru indică faptul că genele care codifică anticoagulantele și proteinele legate de masa sanguină sunt implicate nu numai în alimentația sângelui, ci contribuie la alte funcții fiziologice, încă necunoscute.

În continuare, caracterizăm componentele SCS clasificate în grupuri funcționale și descriem posibilele lor roluri în hemostază. Secvențele proteinelor și alinierea lor sunt prezentate în figurile suplimentare 9-24.

Enzime

Proteaze

Rezultatele acestui studiu arată că metaloproteazele din familiile М12, M13 și M28 sunt principalele componente enzimatice ale SCS. Peptidazele M12B (ADAM/reprolysin) sunt o familie mare de metaloproteinaze asemănătoare dezintegrinei care au o gamă largă de funcții și sunt implicate în multe procese fiziologice . Aceste enzime se găsesc adesea în veninul de șarpe, în timp ce transcriptele sunt observate în sialotranscriptomii diferitelor specii hematofage . În hemostază, proteazele secretate din familia М12 pot participa la inhibarea adeziunii plachetare și la înmuierea cheagului datorită degradării fibrinogenului. Aceste proteine prezintă o activitate proteolitică dependentă de metale împotriva proteinelor din matricea extracelulară (gelatină, fibrinogen, fibronectină), afectând astfel reglarea inflamației și a răspunsurilor imune.

La mamifere, proteazele din familia M13 sunt implicate în formarea și dezvoltarea sistemului cardiovascular și în reglarea neuropeptidelor din sistemul nervos central . Una dintre cele mai importante funcții ale acestora este activarea peptidelor biologic active, în special a peptidelor implicate în reglarea tensiunii arteriale (angiotensina și bradikinina). La mamifere, ACE este o componentă importantă a sistemului renină-angiotensină (SRA). ACE este exprimată în sialotranscriptomii lipitoarei (Theromyzon tessulatum), melcului conic (Conidae), melcului vampir (Colubraria reticulata) și a speciilor de diptere (Diptera) .

Secvențele identificate de exopeptidaze din familia M28 aparțin carboxipeptidazelor de tip Q, cunoscute și sub numele de dipeptidaze lizozomale sau glutamat carboxipeptidază plasmatică (PGCP). S-a demonstrat că aceste peptidaze sunt implicate în reglarea metabolismului peptidelor secretate în plasma sanguină și în sistemul nervos central la mamifere . Aceste enzime par să servească la dezactivarea anumitor peptide de semnalizare din sânge și sunt componente ale sistemelor hemoglobinolitice la paraziții hematofagi, jucând rolul de exopeptidaze digestive . În special, secrețiile glandelor salivare ale lipitorilor conțin inhibitori de carboxipeptidaze, care probabil împiedică digestia intempestivă a mesei de sânge de către alte tipuri de peptidaze .

Superoxid dismutaza (EC 1.15.1.1)

Am identificat secvențe de enzime secretate din familia superoxid dismutazei (SODC, tip Cu/Zn). Această familie de metaloproteine este în principal tipică pentru eucariote și este implicată în inactivarea radicalilor liberi, care întârzie procesele oxidative. În sânge, superoxid dismutaza catalizează conversia superoxidului în oxigen molecular și peroxid de hidrogen și previne formarea radicalilor peroxinitrit și hidroxil . Este interesant faptul că peroxinitritul poate suprima funcția hemostatică prin nitrarea unor procoagulanți cheie , în timp ce peroxidul de hidrogen este o moleculă de semnalizare cheie implicată în reglarea multor procese (coagulare, tromboză, fibrinoliză, angiogeneză și proliferare). La căpușe, se presupune că SODC participă la reglarea colonizării tractului intestinal de către bacterii, inclusiv agenți cauzali ai bolilor . La SCS, SODC pare să prezinte un efect antibacterian împreună cu alte proteine ale sistemului imunitar înnăscut și previne oxidarea nedorită a sângelui în timpul hrănirii și al digestiei. În special, compușii care conțin hemi și fierul liber sunt implicați în formarea radicalilor liberi și în provocarea stresului oxidativ .

Anhidraza carbonică (EC 4.2.1.1)

Această enzimă este o componentă cheie a sistemului tampon de bicarbonat și este implicată în reglarea valorilor pH-ului în sânge, în tractul digestiv și în alte țesuturi . La animalele hematofage, această enzimă poate menține condițiile optime pentru digestia unei mese de sânge . Anhidraza carbonică pare să provoace o creștere locală a acidozei la locul mușcăturii, scăzând activitatea factorilor de coagulare a sângelui.

Hialuronidază (EC 3.2.1.35)

Aceste enzime sunt comune în datele proteomice și transcriptomice ale animalelor hematofage și veninoase. Se știe că secrețiile salivare ale diferitelor specii de lipitori conțin hialuronidază (heparinază, orgelază) . În proteom și transcriptom, am găsit trei clustere care conțin un domeniu al familiei 79 de glicozil-hidrolaze (O-glicozil-hidrolaze). Această familie include heparinazele, care joacă un rol important în țesuturile conjunctive. În veninuri și în secrețiile glandelor salivare, aceste enzime catalizează hidroliza acidului hialuronic, ducând la pierderea integrității structurale a matricei extracelulare și facilitând astfel pătrunderea anticoagulanților și a altor molecule active mai adânc în țesuturi . În plus, heparina cu greutate moleculară mică produsă prin scindare de către heparinază suprimă și inhibă coagularea sângelui .

Apaza (EC 3.6.1.5)

Apazele sunt nucleotidaze implicate în degradarea enzimatică a ATP și ADP în AMP. Apirazele și 5′-nucleazele secretate sunt componente bine cunoscute și bine caracterizate ale secrețiilor glandelor salivare ale animalelor veninoase și hematofage, inclusiv lipitorile . Apirazele sunt anticoagulante, deoarece elimină ADP, un inductor important al agregării plachetare la locurile de leziune tisulară .

Adenosina/AMP deaminaza (EC:3.5.4.4)

catalizează dezaminarea hidrolitică a adenozinei pentru a forma inozină. Adenozin deaminazele sunt bine studiate și au fost găsite în saliva diferitelor insecte hematofage . ADA se găsește, de asemenea, în secreția glandei salivare a melcului vampir C. reticulata, care aparține grupului Spiralia, precum și în lipitori . Se crede că ADA joacă un rol important în eliminarea adenozinei datorită implicării sale în procesele de percepție a durerii .

Inhibitori de protează

Antistaine

Am identificat secvențe corespunzătoare inhibitorului de protează I15 (antistasina lipitorilor) Fig. 4. Proteinele din această familie se găsesc în mod obișnuit la lipitorile care sug sânge și joacă un rol esențial în inhibarea coagulării sângelui. Principalele lor ținte sunt serin proteazele care participă la hemostază, cum ar fi factorul Xa, calicreina, plasmina și trombina . S-a demonstrat că ghilantenul, o antistasină din Haementeria ghilianii, inhibă agregarea plachetară, iar gigastasina din lipitoarea uriașă din Amazon (Hementaria ghilianii) a fost recent raportată ca inhibând puternic complementul C1 . Antistasina din Hementeria officinalis este cel mai apropiat omolog al secvențelor identificate în studiul nostru.

CAP/CRISP

Superfamilia proteinelor secretorii bogate în cisteină/antigen 5/proteine legate de patogeneză 1 (CAP) include numeroase familii de proteine, în special proteinele secretorii bogate în cisteină (CRISP) Fig. 5a. Acestea se găsesc frecvent în veninul șerpilor și al altor reptile, iar cele mai multe dintre ele sunt toxine . În unele investigații, s-a considerat că CRISP din speciile hematofage sunt implicate în hemostază (HP1). Secvențele identificate prezintă similitudini cu secvențe proteice de la nematodul parazit hematofag Ancylostoma caninum (hookworm), cum ar fi blocantul canalelor de potasiu AcK1 și posibilul inhibitor al agregării plachetare HPI , precum și cu toxinele de șarpe triflin (Protobothrops flavoviridis) și natrin-1 (Naja atra) . Printre genele exprimate diferențiat, am identificat secvențe cu un nou motiv „Cys-rich” Fig. 5b. Acest grup de proteine se caracterizează prin prezența unei peptide semnal și a două modele de cisteină CX {5,14} CX {7} CX {8} СС {2} С și CX {7,17} CX {9} CX {8} СС {2} С.

Eglin-like

Eglinele sunt proteine mici fără cisteină care aparțin familiei I13 de inhibitori de serin-proteinază . Eglinele din lipitori au activitate inhibitoare împotriva elastazelor neutrofile și a catepsinelor G și, de asemenea, de a participa la protecția conținutului culturilor împotriva proteolizei intempestive . De remarcat, secvențele identificate în prezentul studiu au o homologie scăzută cu eglina clasică din lipitori Fig. 6a.

Cistatină

Am identificat o secvență de cistatină doar în proteomul de H. verbana. Cistatinele sunt mici proteine inhibitoare ale proteazelor cu cisteină (catepsine B, H, C, L, S) și se găsesc adesea în sialotranscriptomii diferitelor căpușe . La căpușe, cistatinele joacă un rol important în procesele legate de răspunsul imunitar, de reglarea cistein-proteazelor endogene implicate în digestia sângelui și în detoxifierea hematiilor . Nematodul Nippostrongylus brasiliensis utilizează cistatinele pentru a se sustrage sistemului imunitar al gazdei .

Domeniul PAN

Acest domeniu este prezent în numeroase proteine, inclusiv în proteinele din sânge, plasminogenul și factorul de coagulare XI . Se știe că domeniul PAN/apple al precalicreinei plasmatice mediază legarea acesteia de kinogenul cu greutate moleculară mare, iar domeniul PAN/apple al factorului XI se leagă de factorii XIIa și IX, de trombocite, de kininogen și de heparină . S-a constatat că secreția glandei salivare a lipitoarei H. officinalis conține proteina antiplachetară a lipitoarei (LAPP), care are un domeniu PAN și este implicată în hemostază. Această proteină prezintă afinitate pentru colagenii I, III și IV și, prin urmare, inhibă adeziunea plachetară mediată de colagen .

Alfa-2-macroglobulină (α2M)

Apha-2-macroglobulina (α2M)

Apha-2-macroglobulina multifuncțională, foarte bine conservată, este implicată în inhibarea unei game largi de proteaze (serină, cisteină, aspartică și metaloproteaze), interacționează cu citokinele și hormonii și joacă un rol în chelarea zincului și a cuprului . Poate acționa ca un inhibitor al plasminei, inhibând astfel fibrinoliza, dar, în unele cazuri, inhibă coagularea prin inactivarea trombinei și a calicreinei . Se crede că această proteină nu numai că este implicată în procesele imune ale lipitorilor, dar este, de asemenea, o componentă importantă a secreției glandei salivare care îmbunătățește procesele de anticoagulare.

Molecule implicate în aderență

Ficolina

Ficolinele sunt o componentă a sistemului imunitar înnăscut și declanșează o cale de activare a complementului dependentă de lectină . La nevertebrate, ficolinele sunt implicate în recunoașterea componentelor peretelui celular bacterian . Domeniul asemănător fibrinogenului este prezent în proteinele cu afinitate pentru eritrocite, de exemplu, tachylectina-5A (TL5A). TL5A prezintă o puternică activitate hemaglutinantă și antibacteriană în prezența ionilor de Ca2+ . În veninul reptilelor, se presupune că proteinele asemănătoare ficolinei, ryncolin (de la Cerberus rynchops) și veficolin-1 (UniProt: E2IYB3) (de la Varanus komodoensis), declanșează agregarea plachetară și coagularea sângelui.

Domeniul F5/8 tip C

O serie de secvențe identificate conțin unul sau mai multe motive discoidină (DS), cunoscute sub numele de domeniul F5/8 tip C. Acest domeniu este prezent în numeroase proteine transmembranare și extracelulare, de exemplu, neuropilinele, neurexina IV și proteinele receptoare ale domeniului discoidin, precum și în proteinele implicate în hemostază, cum ar fi factorii de coagulare V și VIII . Domeniul DS joacă un rol important în legarea diferitelor molecule ligand, inclusiv a fosfolipidelor și a carbohidraților . Datorită acestor caracteristici, proteinele care conțin DS sunt implicate în mod activ în adeziunea celulară, în migrație, în proliferarea și activarea cascadelor de semnalizare . Proteinele care conțin domenii DS ale lipitorilor par să acționeze ca lectine cu afinitate mare pentru galactoză și pot fi componente ale sistemului imunitar înnăscut al lipitorilor. În plus, se pot lega de colagen sau de fosfatidilserină de pe suprafața trombocitelor și a endoteliului și, astfel, prin inhibiție competitivă, afectează interacțiunile dintre factorii hemostatici.

Familia de receptori ai lipoproteinelor de joasă densitate a

Familia de receptori ai lipoproteinelor de joasă densitate (LDLR) este o componentă importantă a plasmei sanguine și este implicată în recunoașterea și endocitoza lipoproteinelor de joasă densitate în sângele mamiferelor . Spre deosebire de proteinele omoloage cunoscute, acești receptori sunt mai degrabă proteine secretorii decât proteine membranare și conțin patru repetări LDLR clasa A (bogate în cisteină). Se presupune că unele nevertebrate, inclusiv viermii segmentați, sunt incapabile să sintetizeze colesterolul și hormonii steroizi, iar în timpul hrănirii, lipitorile dobândesc colesterolul în principal din sângele gazdei ca sursă exogenă . Noi presupunem că această proteină poate fi utilizată de către lipitoare pentru curățarea și transportul complexelor lipoproteice bogate în colesterol.

Lectina de tip R

Proteinele care conțin domeniul lectinei de tip ricină de tip beta-treflă au fost găsite la procariote și eucariote. La animale, lectinele de tip R prezintă activități diverse . Ele sunt prezente în receptorii scavenger (receptorii de mannoză, fucose, colagen), N-acetilgalactosaminiltransferaze, toxine hemolitice (CEL-III din Cucumaria echinata) și citotoxine care induc apoptoza . Anterior, secvențe similare au fost identificate în transcriptomii de lipitori; cu toate acestea, autorii au presupus că această moleculă are o localizare mitocondrială . Un alt omolog apropiat demn de luat în seamă este lectina de legare a galactozei EW29 de la viermele de pământ Lumbricus terrestris. EW29 este alcătuită din două domenii omologe și s-a demonstrat experimental că prezintă activitate hemaglutinantă . Deoarece multe lectine de tip R cunoscute sunt implicate în adeziune și declanșează hemoliza , această moleculă prezintă interes pentru un studiu mai aprofundat.

domeniul vWFA

Acest domeniu este prezent în diverse proteine plasmatice: factori de complement, integrine și colagenii VI, VII, XII și XIV . O proteină identificată în proteomul lipitoarei este o proteină secretată care constă din patru copii ale domeniului vWFA Fig. 7. Secvența conține mai multe situsuri de recunoaștere presupuse: situsul de adeziune dependent de ioni metalici (MIDAS), situsul de legare a integrinei-colagenului și situsul de legare a glicoproteinei Ib (GpIb). În conformitate cu analiza BlastX, acest domeniu este omolog cu colagenul de tip VI. Având în vedere organizarea domenială a proteinei și prezența situsurilor de legare a glicoproteinei și a colagenului, unul dintre mecanismele de acțiune putative implică legarea la suprafața endoteliului sau a trombocitelor, împiedicând astfel interacțiunea acestora cu colagenul. Această legare stă la baza inhibiției competitive din timpul hemostazei (plachetelet scavenging) .

.