Informații generale
Transfecția ADN-ului prin electroporare este o tehnică consacrată care se aplică probabil la toate tipurile de celule. Ea produce o frecvență ridicată de transformanți stabili și are o eficiență ridicată a expresiei genetice tranzitorii. S-a demonstrat acum că electroporarea este eficientă în livrarea de ADN plasmidic in vivo la o varietate de tipuri de țesuturi. Electroporarea se folosește de faptul că membrana celulară acționează ca un condensator electric care nu este capabil să treacă curentul (cu excepția canalelor ionice). Supunerea membranelor la un câmp electric de înaltă tensiune duce la ruperea temporară a acestora și la formarea unor pori suficient de mari pentru a permite macromoleculelor (precum și moleculelor mai mici, cum ar fi ATP) să intre sau să iasă din celulă. Redeschiderea porilor membranari este un proces natural de descompunere care este întârziat la 0°C.
În timpul în care porii sunt deschiși, acidul nucleic poate intra în celulă și, în cele din urmă, în nucleu. ADN-ul liniar cu capetele libere este mai recombinogen și are mai multe șanse de a fi integrat în cromozomul gazdei pentru a produce transformanți stabili. ADN-ul superbobinat este mai ușor de împachetat în cromatină și este, în general, mai eficient pentru exprimarea tranzitorie a genelor.
Utilizarea șocurilor electrice de înaltă tensiune pentru a introduce ADN în celule a fost realizată pentru prima dată de Wong și Neumann folosind fibroblaste (Wong și Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). Tehnica a fost apoi generalizată (Potter et al., 1984) la toate tipurile de celule – chiar și la cele precum limfocitele care, spre deosebire de fibroblaste, nu pot fi transfectate prin alte proceduri (de ex, fosfat de calciu sau coprecipitate de ADN DEAE-dextran).
Oliver Smithies și colegii săi au folosit apoi electroporarea pentru a introduce ADN în celulele stem embrionare (ES) și au proiectat vectori de direcționare care au permis ADN-ului introdus să se recombine cu regiuni omologe din genom și să introducă fie o genă modificată, fie o secvență perturbatoare pentru a genera celule ES cu o genă specifică „knocked in” sau „knocked out”. Celulele ES modificate au fost apoi utilizate pentru a genera șoarecii knockin sau knockout corespunzători. Electroporarea a fost necesară pentru aceste aplicații de transfer de gene, deoarece introduce ADN-ul în celule într-o formă goală care poate participa cu ușurință la recombinarea omoloagă. Această extindere a electroporației i-a adus doctorului Smithies împărțirea Premiului Nobel pentru Medicină sau Fiziologie din 2007. Metodologia de electroporare a celulelor ES este, în esență, aceeași ca și în cazul altor celule de mamifere. Dacă se dorește înlocuirea omologă a genelor, atunci trebuie concepuți vectori care să permită o selecție „pozitivă-negativă” (Bronson și Smithies, 1994; Joyner 2000), astfel încât o selecție să recupereze toate celulele în care ADN-ul electropatinat s-a inserat în genom, iar cea de-a doua selecție să fie împotriva clonelor ES în care ADN-ul s-a inserat la întâmplare. Șoarecii knockin/out pot fi apoi generați prin fuzionarea celulelor ES clonate selectate cu embrioni, reimplantarea pentru a permite dezvoltarea și reproducerea chimerelor rezultate pentru a genera șoareci în care toate celulele poartă gena modificată.
Deși s-a raportat că plantele întregi sau țesutul foliar sunt transfectabile prin electroporare, celulele vegetale trebuie, în general, să fie transformate în protoplaste înainte ca ADN-ul să poată fi introdus cu ușurință în ele (protocol alternativ; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Ca și în cazul celulelor de mamifere, protoplastele de plante pot fi electroporate într-o varietate de condiții electrice (parametri critici). Atât tensiunea înaltă cu capacitate scăzută (durată scurtă a impulsurilor), cât și tensiunea joasă cu capacitate ridicată (durată lungă a impulsurilor) au fost utilizate pentru a realiza cu succes transferul de gene (Chu et al., 1991). Inițial, EP in vivo a fost utilizată pentru a administra agenți chimioterapeutici în tumorile solide și a progresat de la studii preclinice până la studii clinice (Gothelf, et al., 2003). Livrarea in vivo de ADN plasmidic prin electroporare a fost raportată pentru prima dată la începutul și mijlocul anilor 1990 (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996) și a fost un progres logic bazat pe succesul transfecțiilor in vitro cu electroporare și pe demonstrarea faptului că procedura poate fi efectuată în siguranță in vivo la livrarea de molecule mici, cum ar fi agenții chimioterapeutici. Utilizarea electroporației in vivo pentru livrarea de ADN plasmidic a cunoscut o creștere extraordinară a numărului de studii preclinice efectuate și a fost recent transpusă în clinică (Heller, et al., 2006a și Bodles-Brakhop, et al.,2009).
Utilizarea pe scară largă a electroporației a fost posibilă în mare parte datorită disponibilității aparatelor comerciale care sunt sigure și ușor de utilizat și care dau rezultate extrem de reproductibile. Modelele acestor aparate variază substanțial, dar se împart în două categorii de bază care utilizează mijloace diferite de control al duratei impulsurilor și al tensiunii (cei doi parametri electrici care guvernează formarea porilor). Un tip utilizează un sistem de descărcare a condensatorului pentru a genera un impuls de curent cu descreștere exponențială, iar celălalt tip generează o undă pătrată reală (sau o aproximare a acesteia). Instrumentele cu descărcare de condensator își încarcă condensatorul intern la o anumită tensiune și apoi îl descarcă prin suspensia celulă-ADN. Atât dimensiunea condensatorului, cât și tensiunea pot fi modificate. Deoarece impulsul de curent este o funcție de descreștere exponențială a (1) tensiunii inițiale, (2) setarea capacității instrumentului și (3) rezistența circuitului (inclusiv a probei), modificarea dimensiunii condensatorului pentru a permite stocarea unei cantități mai mari (sau mai mici) de sarcină la tensiune va avea ca rezultat timpi de descreștere mai lungi (sau mai scurți) și, prin urmare, o durată efectivă diferită a impulsului. În schimb, generatoarele de unde pătrate controlează atât tensiunea, cât și durata impulsului cu ajutorul unor dispozitive de comutare în stare solidă. De asemenea, acestea pot produce impulsuri care se repetă rapid. Pentru aplicațiile in vivo, sunt preferate generatoarele de unde pătrate. În plus față de durata și amplitudinea impulsurilor, numărul de impulsuri și configurația electrozilor influențează, de asemenea, eficiența administrării.
Cele mai multe dintre experimentele noastre de electroporare in vitro au folosit Bio-Rad Gene Pulser, un dispozitiv de descărcare cu condensator, dar sunt direct aplicabile altor dispozitive de descărcare cu condensator și, cu unele ajustări, generatoarelor de unde pătrate. Dispozitivele de descărcare cu condensator sunt, de asemenea, disponibile de la GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific și International Biotechnologies (a se vedea ANEXA 4 pentru adresele furnizorilor). Aceste aparate, fie într-o singură unitate, fie prin componente suplimentare, pot furniza o varietate de condiții de electroporare adecvate pentru majoritatea aplicațiilor. Generatoarele de unde pătrate sunt disponibile de la BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan și IGEA și oferă un control mare asupra lățimii impulsurilor, permit impulsuri multiple și rapide și pot fi mai eficiente pentru celulele foarte sensibile sau dificil de transfectat. Utilizarea electroporației pentru a realiza terapia genică la animale vii sau la oameni necesită, de asemenea, un control bun al parametrilor de electroporare pentru a asigura un transfer eficient de ADN cu deteriorarea minimă a țesuturilor, iar acest lucru necesită, în general, generatoare de unde pătrate. Generatoarele sunt disponibile pentru a administra impulsuri fie ca tensiune constantă, fie ca curent constant. Pe lângă furnizarea de generatoare de unde pătrate, acești furnizori oferă și electrozi adecvați pentru electroporarea in vivo. Aceste aparate sunt, în general, mai scumpe. A devenit evident că impulsurile de curent alternativ la ~100 kHz pot fi cea mai eficientă formă de undă pentru electroporare și, eventual, electrofuziune (Chang, 1989).
Majoritatea experimentelor noastre in vivo au utilizat generatoare de unde pătrate BTX T820 sau T830. Aceste experimente au utilizat electrozi disponibili în comerț, cum ar fi o matrice de 2 ace, electrozi de calibru și electrozi de forceps, precum și electrozi concepuți la comandă. După cum s-a menționat mai sus, principalii furnizori de echipamente de electroporare au la dispoziție o varietate de electrozi penetranți și nepenetranți. Generatoarele de undă pătrată permit un control mai bun al parametrilor impulsurilor, ceea ce este deosebit de important atunci când se efectuează o administrare in vivo. Creșterea gradului de utilizare a electroporării in vivo este direct legată de livrarea eficientă a acesteia în mușchi . Aplicarea administrării intramusculare a genelor prin electroporare a fost deosebit de importantă în scopul vaccinării (Abdulhagg, et al., 2008). De asemenea, s-a demonstrat că mușchiul este un depozit excelent pentru aplicațiile de înlocuire a proteinelor pe bază de gene (Trollet, et al., 2006). Administrarea în mușchi poate fi utilizată, de asemenea, pentru administrarea de vaccinuri anticancer (Bodles-Brakhop, et al., 2009). Transmiterea la nivelul pielii a fost, de asemenea, acceptată ca o țintă versatilă. Livrarea la nivelul pielii poate fi utilizată pentru tratarea directă a bolilor cutanate, livrarea de proteine în circulație pentru terapia sistemică, terapia împotriva cancerului și pentru livrarea de vaccinuri ADN (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
Electroporarea poate fi mai ușor de realizat decât tehnicile alternative, motiv pentru care este din ce în ce mai utilizată. Dezavantajul său pentru utilizarea în cazul analizelor tranzitorii este că sunt necesare de aproape cinci ori mai multe celule și ADN decât în cazul transfecției mediate de fosfat de calciu sau DEAE-dextran (UNITATEA 9.1, 9.2 & 16.12). Principala diferență între procedurile de electroporare și de coprecipitare cu fosfat de calciu este starea ADN-ului integrat după selectarea în medii antibiotice adecvate. În cazul fosfatului de calciu, cantitatea de ADN preluată și integrată în genomul fiecărei celule transfectate este de ordinul a 3 × 106 bp. Ca urmare, ADN-ul transfectat se integrează adesea sub forma unor rețele mari în tandem care conțin multe copii ale ADN-ului transfectat. Acesta ar fi un avantaj în cazul în care se dorește transfectarea ADN genomic în celule receptoare și selecția pentru o anumită modificare fenotipică, cum ar fi transformarea malignă; în acest caz, este esențială o cantitate mare de ADN integrat per celulă receptoare. În schimb, electroporarea poate fi ajustată astfel încât să rezulte una până la mai multe copii de ADN inserat per celulă receptoare. Acesta ar fi un avantaj pentru studiile de expresie genică, deoarece identitatea copiei particulare responsabile de expresia genei poate fi controlată și, așa cum s-a discutat mai sus, este esențială pentru direcționarea genetică a celulelor ES pentru a genera șoareci transgenici.
.