Infecția cu Giardia lamblia este una dintre cele mai frecvente cauze de boală diareică la nivel mondial (22). Acest protozoar patogen colonizează intestinul subțire și se poate atașa la epiteliu, dar nu invadează mucoasa. În mod normal, infecțiile se autolimitează, deoarece gazdele imunocompetente pot controla și, de obicei, eradica G. lamblia, un proces care implică celulele T CD4 și generarea de imunoglobulină A (IgA) secretorie și de alți efectori, slab înțeleși (6, 8, 9, 18). În ciuda simptomelor clinice frecvent severe, diaree, dureri abdominale, malabsorbție și pierdere în greutate, infecția nu este însoțită de o inflamație semnificativă a mucoaselor (12). Aceste observații sugerează că este posibil ca mediatorii inflamatori să nu fie importanți pentru diareea indusă de parazit, deși mecanismele care guvernează diareea în giardioză sunt slab cunoscute. Nu s-a demonstrat că Giardia eliberează enterotoxine care ar putea explica perturbarea absorbției sau secreției de lichide intestinale. La infecția cu Giardia la șoareci se produce o reducere a suprafeței de absorbție datorită pierderii microvililor epiteliali (16), ceea ce ar putea duce la diaree determinată osmotic asociată cu malabsorbția, dar reducerea absolută a suprafeței este modestă în comparație cu rezerva anatomică prevăzută a intestinului subțire. Oamenii infectați cu G. lamblia prezintă semne de hipermotilitate intestinală la examenul radiologic (15), un fenomen observat, de asemenea, la gerbilii mongoli infectați experimental (5). Mecanismele care stau la baza și semnificația funcțională a acestor constatări sunt în prezent neclare. Prin urmare, scopul prezentului studiu a fost de a testa ipoteza că hipermotilitatea intestinală reprezintă un mecanism de apărare a gazdei împotriva Giardia, folosind modele murine de giardioză.

Șoareci adulți C57BL/6, SCID și șoareci cu deficit de oxid nitric neuronal sintetază (nNOS) au fost obținuți de la The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Pentru infecțiile cu Giardia muris, chisturile au fost purificate prin flotare cu zaharoză, numărate într-un hemocitometru sub un microscop cu contrast de fază și administrate prin gavare orală în apă la 104 chisturi/șoarece în 0,2 ml (9). Pentru infecțiile cu G. lamblia, trofozoiții tulpinii GS/M (ATCC 50580) (11) au fost crescuți în mediu TYIS-33 și administrați prin gavare orală la o concentrație de 107/șoarece în 0,2 ml din același mediu (9). Motilitatea intestinului subțire a fost determinată printr-o metodă modificată de testare a mesei. Șoarecii au fost ținuți la post peste noapte și li s-a administrat 0,2 ml dintr-o suspensie de 106 bile de polistiren fluorescente (microsfere de carboxilat Fluoresbrite YG cu diametrul de 10 μm; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) și 6 % colorant carmin în 5 % gumă arabică în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). După 20 de minute, intestinul subțire a fost îndepărtat rapid, iar poziția frontului de colorant carmin și întreaga lungime a intestinului subțire au fost înregistrate. Intestinul a fost apoi împărțit în opt bucăți de dimensiuni egale, fiecare dintre acestea fiind deschisă longitudinal, plasată în 2 ml de PBS și răcită la gheață timp de 10 minute. Amestecurile au fost agitate energic pentru a desprinde trofozoiții și bilele, care au fost apoi numărate separat cu ajutorul microscoapelor cu contrast de fază și, respectiv, cu ajutorul microscoapelor cu fluorescență. Distanța parcursă de frontul de colorant carmin a fost exprimată ca procent din întreaga lungime a intestinului subțire. Numărul de mărgele pe segment a fost exprimat ca procent din numărul total de mărgele din intestinul subțire. Pentru a evalua consecințele inhibării motilității intestinului subțire asupra clearance-ului giardial, șoarecii au fost mai întâi infectați pe cale orală cu G. muris sau G. lamblia GS/M și tratați prin gavare orală o dată la două zile, începând cu ziua 7 sau, respectiv, ziua 4, cu 30 mg/kg de loperamidă sau cu PBS ca martor. Numărul de trofozoiți din intestinul subțire a fost determinat în ziua 21 pentru G. muris și în ziua 9 pentru G. lamblia.

Pentru a determina dacă șoarecii adulți normali sunt un model adecvat pentru studierea rolului motilității intestinale în controlul infecției giardice, am infectat șoareci C57BL/6 în vârstă de 8 până la 10 săptămâni cu chisturi ale agentului patogen murin natural G. muris. Motilitatea intestinală mică a fost determinată printr-o metodă de testare a mesei, utilizând colorant carmin ca marker de fază lichidă (14) și bile de polistiren de 10 μm ca marker de particule comparabile ca dimensiune cu trofozoiții Giardia (19). Infecția cu G. muris a accelerat tranzitul intestinului subțire, deoarece fronturile atât ale colorantului de carmin (Fig. (Fig. (Fig.1A)1A), cât și ale bilelor de polistiren (Fig. (Fig.1B)1B) au parcurs o distanță semnificativ mai mare la șoarecii infectați decât la martorii neinfectați. O analiză a evoluției în timp a acestui fenomen a arătat că hipermotilitatea a apărut în decurs de o săptămână după infecție, dar a atins un vârf la 2 până la 3 săptămâni, într-un moment în care numărul de trofozoiți a scăzut în comparație cu numărul de trofozoiți din momentul infecției maxime la 1 săptămână (Fig. (Fig. (Fig.1A).1A). Astfel, modificările maxime ale motilității intestinului subțire au fost întârziate în raport cu vârful încărcăturii de trofozoiți, ceea ce sugerează că aceste modificări pot fi cauzate de un alt mecanism decât stimularea directă a giardelor.

Această constatare amintește de rapoartele privind pierderea de microvilli epiteliali intestinali indusă de Giardia, în care s-a constatat că răspunsul imunitar adaptativ al gazdei este responsabil (16, 17). Pentru a evalua dacă mecanisme similare pot fi implicate în provocarea hipermotilității intestinului subțire, am evaluat șoareci cu imunodeficiență combinată severă (șoareci SCID). Acești șoareci nu au celule T și B funcționale din cauza unui defect al subunității catalitice a proteinei kinazei dependente de ADN, PRKDC, care este necesară pentru o recombinare normală V(D)J, și nu pot eradica Giardia (9, 18). Infecția cu G. muris a șoarecilor SCID nu a alterat tranzitul intestinului subțire, ceea ce a contrastat puternic cu observațiile făcute la martorii imunocompetenți (Fig. (Fig.2).2). Aceste rezultate indică faptul că hipermotilitatea intestinală mică asociată cu giardioza a fost dependentă de inducerea unui răspuns imunitar adaptativ normal la agentul patogen.

Pentru a testa dacă hipermotilitatea intestinală mică observată a contribuit la eliminarea Giardia, am tratat șoarecii cu loperamidă, un medicament care inhibă tranzitul intestinal prin activarea receptorilor μ-opioizi din tractul gastrointestinal (2, 13, 21). Tratamentul medicamentos a fost început la momentul de vârf al infecției cu G. muris (ziua 7) pentru a ne asigura că modificările induse farmacologic în motilitate nu vor interfera cu stabilirea inițială a infecției. Inhibarea motilității intestinului subțire de către loperamidă a compromis în mod semnificativ clearance-ul giardial, cu un număr de trofozoiți de 25 de ori mai mare la șoarecii tratați cu loperamidă decât la martorii tratați cu PBS la 21 de zile (Fig. (Fig.3).3). Tratamentul cu loperamidă nu a avut niciun efect asupra dezvoltării imunității adaptative, deoarece titlurile de IgA antigiardial în secrețiile mucoasei intestinale nu au fost afectate de tratament (datele nu sunt prezentate). Mai mult, această strategie experimentală a evidențiat un efect inhibitor similar asupra infecției murine cu G. lamblia GS/M, un agent patogen giardian uman care poate infecta șoarecii adulți normali (3, 9). Șoarecii tratați cu PBS au eliminat în mare parte infecția până la 9 zile, în timp ce șoarecii tratați cu loperamidă începând cu ziua 4 au continuat să aibă un număr semnificativ de trofozoiți G. lamblia în intestinul subțire (fig. (Fig.) Astfel, inhibarea motilității intestinului subțire a compromis eliminarea Giardia la gazda murină, indiferent de specia giardică. Ca o abordare suplimentară pentru a determina importanța motilității intestinale în apărarea antigiardică a gazdei, am utilizat o abordare genetică în care întreruperea genei pentru nNOS interferează cu propulsia eficientă în intestin la șoareci (20). Analiza motilității a confirmat faptul că șoarecii cu deficit de nNOS au prezentat o întârziere constitutivă a tranzitului gastro-intestinal în comparație cu partenerii lor de litieră de tip sălbatic (Fig. (Fig.4A).4A). În paralel, șoarecii knock-out nu au reușit să elimine în mod normal infecția cu G. lamblia (Fig. (Fig. (Fig.4B).4B). Astfel, folosind abordări farmacologice și genetice, am constatat că scăderea motilității intestinale a fost asociată cu afectarea apărării gazdei împotriva Giardia.

Studiul nostru arată că hipermotilitatea intestinală este o apărare importantă a gazdei împotriva Giardia, o concluzie la care s-a ajuns și într-un alt raport recent (10). Această apărare pare să depindă de dezvoltarea unui răspuns imunitar adaptativ normal împotriva parazitului, deoarece nu a apărut la șoarecii lipsiți de celule T și B, deși este posibil, în principiu, ca celulele T sau B să contribuie la hipermotilitate independent de rolul lor în imunitatea adaptivă antigiardiacă. Hipermotilitatea dependentă de imunitate funcționează în apărarea gazdei împotriva altor paraziți enterici, în special a helminților. De exemplu, eradicarea viermilor rotunzi Trichinella spiralis, care își petrece o parte semnificativă a ciclului său de viață în intestinul subțire, este puternic corelată cu creșterea motilității intestinale (4, 23). De asemenea, expulzarea viermelui Nippostrongylus brasiliensis la șobolani este însoțită de hipermotilitatea intestinului subțire, sugerând un rol în apărarea gazdei împotriva acestui helmint (7). Punctul comun al tuturor acestor agenți patogeni enterici este localizarea lor primară, dacă nu exclusivă, în lumenul intestinal. Din punct de vedere anatomic, acest focar de infecție este situat în afara corpului propriu-zis căptușit cu epiteliu și, prin urmare, nu este ușor accesibil multor celule și molecule efectoare ale sistemului imunitar, cum ar fi neutrofilele sau complementul, care acționează eficient în interiorul organismului. De fapt, o apărare antimicrobiană eficientă în lumenul intestinal reprezintă o provocare specială pentru gazdă, care are un repertoriu limitat de apărare în acest loc. Dintre acestea, IgA secretorie este considerată în mod obișnuit ca fiind un prim mecanism de apărare luminal, dar importanța sa reală în eliminarea giardică pare să fie variabilă și poate depinde de factori slab definiți ai gazdei și ai parazitului (6, 9, 18). Datele noastre și lucrările anterioare cu helminți (4, 23) indică faptul că hipermotilitatea intestinală este un alt mecanism de apărare important împotriva colonizării lumenului intestinal.

Hipermotilitatea dependentă de imunitate poate oferi o explicație mecanicistă pentru diareea asociată cu giardioza, așa cum s-a observat în rapoartele anterioare (5, 15). În principiu, diareea poate fi cauzată de scăderea absorbției de lichide sau de creșterea secreției sau de o combinație a acestor două mecanisme. Există puține dovezi pentru o secreție crescută de ioni și lichide în giardioză, lăsând absorbția deficitară de lichide ca fiind cauza probabilă. Un timp de contact mai scurt cu fluidele luminale, care pot fi ingerate sau derivate din secrețiile gastrice sau pancreatice, ar trebui să compromită eficacitatea transportului ionilor prin epiteliu, în special atunci când hipermotilitatea este combinată cu pierderea raportată a suprafețelor epiteliale absorbante (16). Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că șoarecii nu prezintă diaree sinceră la infecția cu Giardia. Cu toate acestea, este posibil ca un dezechilibru al fluidelor intestinale să apară atât la gazdele umane, cât și la cele animale și că acesta rămâne compensat la șoareci, dar nu și la oameni. Dacă hipermotilitatea contribuie într-adevăr la patogeneza diareei, constatarea noastră că șoarecii SCID nu au prezentat hipermotilitate indusă de Giardia ar implica faptul că pacienții cu imunodeficiențe celulare asociate cu o sensibilitate crescută la infecțiile cu Giardia (de exemplu, imunodeficiența variabilă cronică) ar putea fi mai puțin susceptibili de a dezvolta diaree asociată cu infecția. Mai mult, rezultatele noastre sugerează că este indicată prudența atunci când se ia în considerare utilizarea inhibitorilor motilității intestinale în tratamentul diareei induse de Giardia (1), deoarece un astfel de tratament poate prelungi infecția subiacentă.

.