Construcția plasmidică

Care scFv anti-HA chimeric testat în acest studiu a fost construit prin grefarea a șase bucle CDR ale unui anticorp anti-HA 12CA5 pe fiecare schelet scFv selectat. Plasmidul \(\chi _{15{\mathrm{{{F}}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\) a fost construit în două etape: (1) un gblock scFv grefat cu bucla CDR și un vector H4K20me1 mintbody 15F1138 liniarizat prin situsuri de restricție EcoRI au fost ligaturate prin asamblare Gibson (master mix pregătit de House); (2) linkerul care leagă scFv și EGFP, precum și EGFP, a fost înlocuit cu un gblock care codifică un linker flexibil (G4S) × 5 și mEGFP prin asamblare Gibson prin situsuri de restricție NotI. Pentru celelalte patru plasmide scFv chimerice, fiecare gblock scFv grefat cu bucla CDR a fost ligat în vectorul \(\chi _{15{\mathrm{{{F}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\) liniarizat prin situsuri de restricție EcoRI prin asamblare Gibson.

Plasmidă țintă 1 × HA-mCh-H2B a fost construită prin înlocuirea sfGFP dintr-o plasmidă Addgene sfGFP-H2B (Plasmid # 56367) cu un gblock mCherry marcat cu epitopul 1 × HA, în care a fost inserat un sit de restricție NotI între epitopul 1 × HA și mCherry pentru următoarea clonare. 4 × HA-mCh-H2B a fost construit prin înlocuirea markerului 1 × HA din construcția 1 × HA-mCh-H2B cu un gblock cu epitopul 4 × HA prin situsurile de restricție AgeI și NotI. 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) a fost construit prin înlocuirea markerului 1 × HA din construcția 1 × HA-mCh-H2B cu smHA amplificat dintr-o plasmidă Addgene smHA-KDM5B-MS2 (plasmidă nr. 81085) utilizând primerii NZ-098 și 099 (toate secvențele de primer sunt prezentate în tabelul suplimentar 1). SmHA-H2B a fost construit prin înlocuirea 1 × HA-mCh din construcția 1 × HA-mCh-H2B cu smHA amplificat din plasmidul smHA-KDM5B-MS2, utilizând amorsele NZ-098 și 100.

O altă plasmidă țintă 4 × HA-mCh-β-actină a fost construită prin înlocuirea H2B din construcția 4 × HA-mCh-H2B cu un amplicon de β-actină prin intermediul situsurilor de restricție BglII și BamHI. Ampliconul de β-actină a fost amplificat dintr-o plasmidă Addgene smFlag-ActinB-MS2 (plasmidă nr. 81083) folosind amorsă NZ-073 și NZ-074.

Plasmidă 4 × HA-mRuby-Kv2.1 a fost generată prin amplificarea mai întâi a marcajului 4 × HA din 4 × HA-mCh-H2B folosind amorsă NZ-105 și 106. Apoi, ampliconul 4 × HA a fost introdus într-o plasmidă publicată pCMV-mRuby2-Kv2.161 (un cadou de la Dr. Michael Tamkun), care a fost liniarizată printr-o digestie de restricție cu AgeI, folosind asamblarea Gibson. Plasmidul smHA-Kv2.1 a fost generat prin amplificarea prin PCR a secvenței codificatoare Kv2.1 de șobolan din pBK-Kv2.140 și ligarea ulterioară în situsurile de restricție AsiSI și PmeI de pe plasmidul smHA-KDM5B-MS2, folosind primerii Kv2.1-1 și 2.

Plasmidul H2B-mCh-1 × HA a fost construit în două etape: (1) înlocuirea markerului 1 × HA din 1 × HA-mCh-H2B cu H2B prin situsurile AgeI și NotI, în care H2B a fost amplificat din 1 × HA-mCh-H2B folosind primerii NZ-092 și 093; (2) înlocuirea H2B de la extremitatea C-terminală a mCherry cu un marker 1 × HA prin situsurile BglII și BamHI, în care markerul 1 × HA a fost sintetizat prin PCR suprapusă cu primerii NZ-094 și 095. Mito-mCh-1 × HA a fost construit prin înlocuirea H2B în H2B-mCh-1 × HA cu Mito gblock23 prin site-urile AgeI și NotI. Mito-mCh-mCh-smHA a fost construit prin înlocuirea markerului 1 × HA din Mito-mCh-1 × HA cu smHA amplificat din smHA-KDM5B-MS2 folosind primerii NZ-096 și 097. mCh-H2B a fost generat prin înlocuirea sfGFP din plasmidă sfGFP-H2B cu un gblock mCherry folosind asamblarea Gibson.

Plasmidele FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP au fost construite prin înlocuirea mEGFP din \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\) cu mCherry, HaloTag și, respectiv, SNAP-tag gblocks.

pET23b-FB-GFP, plasmidă pentru exprimarea și purificarea frankencorpului recombinant, a fost asamblată Gibson cu un amplicon FB-GFP și o plasmidă publicată pET23b-Sso7d62,63 liniarizată cu situsurile de restricție NdeI și NotI. Ampliconul FB-GFP a fost amplificat din \(\chi _{15{\mathrm{{{F}}}11}^{{\mathrm{{HA}}}}\) prin PCR cu amorsele NZ-075 și 077.

Pentru testul de traducere, construcția reporter smHA-KDM5B-MS2 și SunTag-kif18b au fost obținute de la Addgene (Plasmid # 81085 și # 74928), iar plasmidă SunTag scFv (Plasmid # 60907) a fost modificată prin eliminarea epitopului HA codificat în linker. Epitopul HA a fost îndepărtat prin mutageneză dirijată la fața locului cu QuikChange Lightning (Agilent Technologies), conform instrucțiunilor producătorului, folosind primerii HAout-1 și 2.

Blocurile g au fost sintetizate de Integrated DNA Technologies, iar plasmidele recombinate au fost verificate secvențial de Quintara Biosciences. Secvențele de primeri sunt prezentate în tabelul suplimentar 1. Toate plasmidele utilizate pentru traducerea imaginilor au fost pregătite cu ajutorul kitului NucleoBond Xtra Midi EF (Macherey-Nagel) cu o concentrație finală de aproximativ 1 mg mL-1.

Cultura de celule U2OS

Celele U2OS (ATCC HTB-96) au fost cultivate într-un incubator la 37 °C, umidificat, cu 5% CO2 în mediu DMEM (Thermo Scientific) suplimentat cu 10% (v/v) ser fetal de bovine (Altas Biologicals), 1 mM l-glutamină (Gibco) și 1% (v/v) penicilină-streptomicină (Gibco sau Invitrogen).

Transfecție și încărcare cu bile

Pentru urmărirea localizării proteinelor, celulele au fost plasate într-o cameră MatTek de 35 mm (MatTek) cu 2 zile înainte de imagistică și au fost transfectate tranzitoriu cu reactivul LipofectamineTM LTX cu reactiv PLUS (Invitrogen) în conformitate cu instrucțiunile producătorului cu 18-24 h înainte de imagistică.

Pentru imagistica traducerii cu ARNm marcat cu proteina MCP-Halo, celulele au fost plasate într-o cameră MatTek de 35 mm (MatTek) cu o zi înainte de imagistică. În ziua imagisticii, înainte de încărcarea bilelor, mediul din camera MatTek a fost schimbat în Opti-MEM (Thermo Scientific) cu 10% ser fetal de bovine. Un amestec de plasmide (smHA-KDM5B-MS2/FB) și proteina purificată MCP-HaloTag17 au fost încărcate cu bile, așa cum s-a descris anterior6,17,26. Pe scurt, după îndepărtarea mediului Opti-medium din camera MatTek, 4 µL de un amestec de plasmide (1 µg fiecare) și MCP-HaloTag (130 ng) în PBS au fost pipetate deasupra celulelor și bile de sticlă de ~106 µm (Sigma Aldrich) au fost distribuite uniform deasupra. Camera a fost apoi bătută ferm de șapte ori, iar Opti-medium a fost adăugat din nou în celule. La 3 ore după încărcarea bilelor, celulele au fost colorate în 1 ml de 0,2 nM de ligand JF646-HaloTag48 diluat în DMEM complet fără roșu de fenol. După o incubare de 20 de minute, celulele au fost spălate de trei ori în DMEM complet fără fenol roșu pentru a îndepărta bilele de sticlă și coloranții nelegat. Celulele au fost apoi pregătite pentru imagistică.

Pentru traducerea imagistică fără marcarea ARNm, celulele placate pe camera MatTek au fost transfectate tranzitoriu cu plasmidele necesare, smHA-KDM5B-MS2/FB cu sau fără SunTag-kif18b/Sun (cu epitopul HA eliminat), folosind reactivul LipofectamineTM LTX cu reactivul PLUS (Invitrogen) în conformitate cu instrucțiunile producătorului în ziua imagisticii. La 3 h după transfecție, mediul a fost schimbat cu DMEM complet fără roșu de fenol. Celulele au fost apoi pregătite pentru imagistică.

Purificarea FB-GFP

Celele E. coli BL21 (DE3) pLysS transformate cu pET23b-FB-GFP au fost cultivate la 37 °C până la o densitate de OD600 0,6 în mediu 2xYT care conține Ampicilină (100 mg L-1) și Cloramfenicol (25 mg L-1) cu agitare. S-a adăugat izopropil-β-d-thiogalactozidă (IPTG) pentru a induce expresia proteinei la o concentrație finală de 0,4 mM, iar temperatura a fost coborâtă la 18 °C. Celulele au fost recoltate după 16 h prin centrifugare și resuspendate în tampon PBS suplimentat cu 300 mM NaCl, inhibitori de protează (ThermoFisher), 0,2 mM AEBSF (20 ml L-1 de cultură) și lizate prin sonicare. Lisatul a fost clarificat prin centrifugare. Supernatantul a fost încărcat pe două coloane HisTrap HP de 5 ml conectate (GE Healthcare), spălat și eluat printr-un gradient liniar de 0-500 mM imidazol. Fracțiunile care conțineau POI au fost grupate, concentrate cu ajutorul unui filtru centrifugal Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO (EMD Millipore) și încărcate pe o coloană HiLoad Superdex 200 PG cu excludere dimensională (GE healthcare) în tampon HEPES (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP40, 10% glicerol și 1 mM DTT). Fracțiunile care conțineau proteina FB-GFP au fost colectate, concentrate și depozitate la -80 °C după congelare rapidă cu azot lichid.

Imunodetecție

Celele U2OS au fost transfectate tranzitoriu cu 4 × HA-mCh-H2B sau 4 × HA-mCh-β-actină cu reactivul LipofectamineTM LTX cu reactivul PLUS (Invitrogen). 26 h după transfecție, celulele au fost fixate cu paraformaldehidă 4% (Electron Microscopy Sciences) timp de 10 min la temperatura camerei, permeabilizate în 1% Triton 100 în PBS, pH 7,4 timp de 20 min, blocate în Blocking One-P (Nacalai Tesque) timp de 20 min și colorate la 4 °C peste noapte cu proteina FB-GFP purificată (0,5 µg mL-1 în tampon de blocare 10%). În dimineața următoare, celulele au fost spălate cu PBS, iar POI a fost imaginat cu un microscop confocal cu disc rotativ Olympus IX81 (cap CSU22) folosind un obiectiv de imersie în ulei ×100 (NA 1,40) în următoarele condiții: 488 nm (0,77 mW; măsurat la planul focal posterior al obiectivului; în prezentul document, toate măsurătorile puterii laserului corespund planului focal posterior al obiectivului) și 561 nm (0,42 mW), imagistică secvențială pentru 50 de puncte de timp fără întârziere, viteză de rotație 2 × 2, timp de expunere de 100 ms. Imaginile au fost obținute cu o cameră CCD Photometrics Cascade II folosind software-ul SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Imaginile de imunocolorație au fost generate prin medierea imaginilor cu 50 de puncte temporale pentru fiecare canal de către Fiji64.

Western blots

Celele U2OS au fost transfectate tranzitoriu cu 4 × HA-mCh-H2B sau 4 × HA-mCh-β-actină cu reactivul LipofectamineTM LTX cu reactivul PLUS. La 10 h după transfecție, celulele au fost recoltate și lizate în 120 µL de tampon RIPA cu inhibitor de protează cOmplete (Roche). 6,5 µL din fiecare lizat celular au fost încărcate pe un gel de proteine NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) și rulate timp de 60 de minute la 100 V și 25 de minute la 200 V. Proteinele au fost transferate pe o membrană PVDF (Invitrogen), blocate în tampon de blocare (5% lapte praf în 0,05% TBS-Tween 20) timp de 1 h și colorate peste noapte fie cu proteina FB-GFP purificată (0,5 µg ml-1 în tampon de blocare), fie cu anticorpul parental anti-HA 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat #11583816001; diluție de 2000 de ori cu o concentrație finală de 0,5 µg ml-1 în tampon de blocare). Pentru anticorpul primar 12CA5, s-a efectuat o incubare suplimentară timp de 1 h cu anticorpul anti-șoarece/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; diluție de 5000 de ori în tampon de blocare). POI a fost detectată din fluorescența GFP pentru FB-GFP sau Alexa 488 pentru anticorpul anti-HA cu ajutorul unui Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) în următoarele condiții: lungime de undă de excitație 473 nm, filtru LPB (≥510 nm), tub fotomultiplicator de 300 V și dimensiune a pixelului de 10 µm. Western blot-urile netăiate și neprocesate sunt furnizate în Fig. suplimentară 3.

Recuperarea fluorescenței după fotobleaching

Pentru a studia afinitatea de legare a FB la epitopi HA în celulele vii, s-au efectuat experimente FRAP pe celule transfectate tranzitoriu cu 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) și FB-GFP (1,25 µg) cu 24 h înainte de FRAP. Imaginile au fost obținute cu ajutorul unui microscop confocal cu disc rotativ Olympus IX81 (cap CSU22) cuplat la o unitate de fotomanipulare Phasor (Intelligent Imaging Innovations) cu un obiectiv de imersie în ulei ×100 (NA 1,40). Înainte de fotoblematizare, au fost achiziționate 20 sau 10 cadre cu un interval de timp de 1 sau 5 s. Imaginile au fost capturate folosind un laser de 488 nm (0,77 mW) cu un timp de expunere de 100 ms, urmat de un laser de 561 nm (0,42 mW) cu un timp de expunere de 15 ms. Discul rotativ a fost setat la o rată de rotație de 1 × 1. După achiziția imaginilor pre-FRAP, laserul p488 nm (de la unitatea Phasor pentru fotoblemaj) la 17 mW cu un timp de expunere de 100 ms, sau 4 mW cu o expunere de 500 ms, a fost utilizat pentru a fotoblemaja o regiune circulară din nucleu. După fotodecolorare, au fost capturate 30 de imagini fără întârziere sau cu o întârziere de 500 ms, iar apoi au fost achiziționate 100 de imagini cu o întârziere de 1 s și 100 de imagini cu o întârziere de 5 s, utilizând aceleași setări de imagistică ca și imaginile pre-FRAP. Intensitatea fluorescentă în timp a spotului fotoblematizat a fost exportată cu ajutorul software-ului Slidebook. Intensitatea fluorescentă a nucleului și a fondului au fost obținute cu Fiji64 după corectarea mișcării celulelor cu ajutorul pluginului StackReg Fiji65. Curba FRAP și jumătatea au fost obținute cu ajutorul easyFRAP-web66, în conformitate cu instrucțiunile de pe site. Figura 4b, d au fost generate de Mathematica (Wolfram Research).

PurificareaMCP

MCP-HaloTag a fost purificată prin cromatografie de afinitate cu metale imobilizate17. Pe scurt, MCP-HaloTag cu marcaj His a fost purificat printr-o coloană de Ni-NTA-agaroză (Qiagen) împachetată conform instrucțiunilor producătorului, cu modificări minore. E. coli care exprimă proteina interesată a fost lizată într-un tampon PBS cu un set complet de inhibitori de protează (Roche) și 10 mM imidazol. Rășina a fost spălată cu un tampon pe bază de PBS care conține 20 și 50 mM imidazol. Proteina a fost apoi eluată într-un tampon PBS cu 300 mM imidazol. MCP cu marcaj His eluat a fost dializat într-un tampon pe bază de HEPES (10% glicerol, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% detergent NP-40 și 1 mM DTT), congelat în azot lichid și apoi depozitat la -80 °C.

Pregătirea celulelor pentru urmărirea lanțului nazal

Plasmidul reporter smHA-KDM5B-MS2 (plasmidul Addgene #81085) și construcția FB au fost fie transfectate tranzitoriu fără proteina MCP-HaloTag, fie încărcate cu proteine MCP-HaloTag în celule U2OS placate pe camere MatTek de 35 mm cu 4-6 ore înainte de imagistică. 3 ore mai târziu, în cazul în care proteina MCP-HaloTag a fost încărcată cu microsfere, celulele au fost colorate cu ligandul JF646-HaloTag, apoi au fost spălate cu mediu DMEM complet fără roșu de fenol. Dacă nu a fost nevoie de proteină MCP-HaloTag, mediul celulelor a fost schimbat cu mediu DMEM complet fără roșu-fenol la 3 h după transfecție. Celulele au fost apoi pregătite pentru imagistică.

Pentru imagistică multiplexată, două plasmide reporter, smHA-KDM5B-MS2 și SunTag-kif18b, precum și două sonde, FB-mCh și Sun-GFP (cu epitopul HA eliminat), au fost transfectate tranzitoriu în celule U2OS plasate pe o cameră MatTek cu 4-6 ore înainte de imagistică. 3 h mai târziu, mediul celulelor a fost schimbat cu un mediu DMEM complet fără roșu de fenol. Celulele au fost apoi pregătite pentru imagistică.

Condiții de imagistică pentru testele de traducere și colocalizare

Pentru a imagina ARNm individuali și starea de traducere a acestora cu FB, s-a folosit un microscop cu fluorescență cu câmp larg construit la comandă, bazat pe o schemă de iluminare înclinată (HILO)17,67. Pe scurt, fasciculele de excitație, lasere cu semiconductori de 488, 561, 637 nm (Vortran), au fost cuplate și focalizate în afara axei pe planul focal posterior al obiectivului (APON 60XOTIRF, Olympus). Toate puterile laser raportate au fost măsurate în planul back-focal al obiectivului. Semnalele de emisie au fost divizate de o oglindă dicroică ultra-plană de calitate imagistică (T660lpxr, Chroma). Semnalele de emisie mai lungi (roșu îndepărtat) după divizare au fost trecute printr-un filtru trece-banda (FF01-731/137-25, Semrock). Semnalele de emisie mai scurte (roșu și verde) după divizare au fost trecute fie printr-un filtru trece-banda pentru roșu (FF01-593/46-25, Semrock), fie printr-un filtru trece-banda pentru verde (FF01-510/42-25, Semrock) instalat într-o roată de filtrare (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). Semnalele de emisie mai lungi (roșu îndepărtat) și mai scurte (roșu și verde) au fost detectate de două camere EM-CCD separate (iXon Ultra 888, Andor) prin focalizare cu ajutorul unei lentile dublete acromatice de 300 mm (AC254-300-A-ML, Thorlabs). Combinația dintre obiectivul obiectiv ×60 de la Olympus, lentila tubulară de 300 mm și iXon Ultra 888 produce imagini ×100 cu 130 nm pixel-1. Un incubator de tip „stage top” pentru temperatură (37 °C), umiditate și 5% CO2 (Okolab) este echipat pe o scenă piezoelectrică (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) pentru imagistica celulelor vii. Laserele, camerele, scena piezoelectrică și roata de filtrare au fost sincronizate de un microcontroler open source, placa Arduino Mega (Arduino). Achiziția imaginilor a fost realizată cu ajutorul software-ului Micro-Manager open source (1.4.22)68.

Dimensiunea imaginii a fost setată la centrul 512 × 512 pixeli2 (66,6 × 66,6 µm2), iar timpul de integrare al camerei a fost setat la 53,64 ms. Timpul de citire a camerelor din combinația dintre dimensiunea imaginii noastre, modul de citire (30 MHz) și viteza de deplasare verticală (1,13 µs) a fost de 23,36 ms, rezultând o rată de imagistică de 13 Hz (70 ms pe imagine). Semnalele roșii și verzi au fost imaginate alternativ. Poziția filtrului de emisie a fost schimbată în timpul timpului de citire a camerei. Pentru a reduce la minimum sângerarea, semnalul roșu îndepărtat a fost imaginat simultan cu semnalul verde. Pentru a capta întreaga grosime a celulelor, au fost imaginate 13 stive z cu o dimensiune a pasului de 500 nm (6 µm în total), utilizând stația piezoelectrică. Acest lucru a dus la rata noastră totală de imagistică celulară de 1 Hz pentru imagistica fie a semnalelor roșii, fie a celor verzi, și de 0,5 Hz pentru imagistica atât a semnalelor roșii, cât și a celor verzi, indiferent de imagistica în roșu îndepărtat.

Pentru figurile 1c, d, 2a, e, un singur plan al celulelor a fost imaginat continuu la 6,5 Hz pentru 100 de puncte de timp și a fost calculată media pe tot parcursul timpului (lasere: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (Fig. 1c), 90 µW (Fig. 1d), 19 µW (Fig. 2a), 155 µW (Fig. 2e); 637 nm, 220 µW). Pentru Fig. 2b (stânga), celula a fost imaginată în mod continuu la 0,5 Hz, cu laserele de 488 nm (100 µW) și 561 nm (10 µW) cu 13 z-stacks la fiecare punct de timp și cu o medie pe tot parcursul timpului. Cele 13 z-stacks medii dobândite au fost deconvoltate cu ajutorul Fiji. Pentru Fig. 6b, c, e și f, celulele au fost imaginate la fiecare 10 s cu 13 z-stacks per punct de timp (lasere: 488 nm, 13 µW (Fig. 6b), 18 µW (Fig. 6c); 561 nm, 172 µW (Fig. 6f); 637 nm, 150 µW (Fig. 6b, c), 35 µW (Fig. 6e)). Pentru Fig. 7b, celula a fost imaginată în mod continuu la 0,5 Hz, cu 13 stive Z la fiecare punct de timp (lasere: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). Pentru Fig. 8b, celulele au fost imaginate la fiecare 14 s cu 13 z-stacks la fiecare punct de timp (laser: 488 nm, 70 µW). Pentru Fig. 8c, celulele au fost imaginate la fiecare 40 s cu 13 z-stack-uri la fiecare punct de timp (laser: 488 nm, 130 µW). Pentru determinarea vitezei petelor de translație motorizată (Fig. 8e), neuronii au fost imaginate continuu la 1 Hz cu 13 z-stacks la fiecare punct de timp.

Pentru Fig. 2b (dreapta) și 2c, colocalizarea a fost imaginată cu ajutorul microscopului confocal cu disc rotativ Olympus IX81 (cap CSU22) descris anterior, folosind un obiectiv cu imersie în ulei ×100 (NA 1,40) în următoarele condiții: imagistică secvențială la 488 nm (0,77 mW) și 561 nm (0,42 mW) pentru cinci momente de timp fără întârziere, cu mai multe felii z pentru a acoperi întregul corp celular pentru fiecare moment de timp, viteză de rotație 1 × 1, timp de expunere ajustat în funcție de luminozitatea celulelor. Imaginile au fost achiziționate cu o cameră CCD Photometrics Cascade II folosind software-ul SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Imaginile afișate în figuri au fost generate prin medierea a cinci puncte de timp și apoi s-a realizat o proiecție maximă a tuturor feliilor z cu Fiji64.

Dezvăluirea particulelor din situsurile de translație

Dezvăluirea și urmărirea situsurilor de translație unice au fost realizate pe imaginile de proiecție de intensitate maximă cu un cod Mathematica (Wolfram Research) personalizat17. Pe scurt, imaginile au fost procesate cu un filtru trece-bandă pentru a evidenția particulele și apoi au fost binarizate pentru a detecta centrele de intensitate ale acestora ca poziții folosind rutina încorporată în Mathematica ComponentMeasurements. Particulele detectate au fost urmărite și legate în timp prin intermediul unei căutări a celui mai apropiat vecin. Coordonatele precise (locațiile super-rezolvate) ale ARNm și ale situsurilor de translație au fost determinate prin ajustarea (cu ajutorul rutinei încorporate Mathematica NonlinearModelFit) imaginilor originale la Gaussians 2D de următoarea formă: