Cancerul colorectal fără polipoză ereditară (HNPCC) este o afecțiune eterogenă din punct de vedere genetic, cauzată de mutații germinale în una dintre mai multe gene MMR (Jiricny, 1998a,b), deși dovezile actuale sugerează că mutațiile germinale în hMSH2 și hMLH1 reprezintă majoritatea cazurilor de HNPCC (Peltomäki și Vasen, 1997). Purtătorii genei HNPCC moștenesc o mutație în una dintre alelele care codifică o genă MMR, iar cea de-a doua copie este mutantă sau pierdută ca un eveniment timpuriu în dezvoltarea unei tumori. Acest al doilea eveniment face ca repararea nepotrivirii ADN-ului (MMR) să devină deficitară în celule, conducând probabil la acumularea rapidă de mutații care determină dezvoltarea tumorii. Rămâne de elucidat ce anume cauzează predispoziția subiacentă la cancer colorectal la persoanele cu HNPCC. S-a demonstrat că o asamblare precisă a complexelor MMR umane este esențială pentru o MMR eficientă în vederea menținerii integrității genomice (Drummond et al., 1997). Aceste date sugerează că, în funcție de natura mutației în genele MMR și de expresia acestora, compoziția și, odată cu aceasta, activitatea complexelor de reparare a ADN-ului variază între indivizii cu HNPCC. De asemenea, implicarea cel puțin a hMLH1 și hMSH2 în alte căi celulare, cum ar fi recombinarea ADN-ului și reglarea punctului de control al ciclului celular (Jiricny, 1998a,b), care controlează stabilitatea genomului poate fi afectată de mutații în genele hMLH1 și hMSH2. Prin urmare, dezvoltarea tumorii și evoluția bolii pot varia între familiile HNPCC (Jäger et al., 1997). Importanța interacțiunilor proteină-proteină în complexele de reparare este susținută de constatările conform cărora hMSH2 există în complex fie cu hMSH6 (hMutSα), fie cu hMSH3 (hMutSβ), iar proteina hMLH1 în complex fie cu hPMS2 (hMutLα), hPMS1 (hMutLβ) sau hMLH3 (Drummond et al, 1995; Li și Modrich, 1995; Lipkin și colab., 2000; Palombo și colab., 1995; Papadopoulos și colab., 1995; Räschle și colab., 1999). S-a demonstrat, de asemenea, că proteina hMSH2 interacționează cu exonucleaza umană 1 (hEXO1) (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998). Cu toate că nu se știe dacă hEXO1 este implicată în MMR, tulpinile de drojdie deficitare în activitatea exonucleazei 1 prezintă o rată crescută de mutație spontană și o mică creștere a recombinării atunci când heteroduplexul intermediar conține nepotriviri de bază-bază sau bucle mici (Nicholson et al., 2000; Tischkoff et al., 1997, 1998). Se știe că atât exonucleaza 1 (EXO1), cât și proteinele MMR sunt implicate în recombinarea omoloagă (Fiorentini et al., 1997; Saparbaev et al., 1996; Sugawara et al., 1997) și că EXO1 din drojdia EXO1 joacă un rol în repararea rupturilor dublu-catenare și în încrucișarea meiotică (Tsubouchi și Ogawa, 2000).

Multe studii privind HNPCC s-au concentrat pe identificarea mutațiilor în genele hMLH1 și hMSH2. Cu toate acestea, analiza mutațională a acestor gene nu determină defectele moleculare și biochimice care stau la baza acestei boli. Pentru a îmbunătăți înțelegerea relației dintre pierderea funcției genei hMLH1 și HNPCC, am caracterizat interacțiunile proteice-proteice specifice ale complexelor hMutLα și hMLH1-hEXO1, folosind forme mutante ale hMLH1 găsite la pacienții cu HNPCC. Am utilizat sistemul yeast two-hybrid, precum și un test de interacțiune prin fuziune (pull-down) cu glutation S-transferaza (GST) pentru a studia astfel de interacțiuni proteină-proteină in vivo și, respectiv, in vitro.

Proteina hMLH1 există în mod predominant într-un complex cu hPMS2, cunoscut și sub numele de heterodimerul hMutLα (Li și Modrich, 1995). Formarea unui complex hMutLα este esențială pentru activitatea MMR (Baker et al., 1995, 1996; Edelmann et al., 1996) și, prin urmare, incapacitatea proteinelor HNPCC-hMLH1 de a forma un complex cu hPMS2 ar putea duce la o activitate MMR ineficientă la persoanele cu HNPCC. Pentru a investiga cauza potențială care stă la baza HNPCC, am examinat dacă trei mutanți hMLH1 identificați la pacienții danezi cu HNPCC (figura 1) au fost capabili să interacționeze cu hPMS2. Mutațiile au inclus o mutație greșită de la treonină la metionină la codonul 117 (T117M) din hMLH1 și două noi mutații HNPCC, o mutație fără sens (de la CAG la TAG) la codonul 426 (Q426X) și o mutație frame-shift (inserție de A la nucleotidul 1813) care a dus la o oprire prematură la codonul 609 (1813insA) (Figura 1) (Figura 1). Testul „pull-down” cu proteine HNPCC recombinante marcate cu GST și hPMS2 transcris și tradus in vitro (IVTT) a evidențiat, așa cum era de așteptat, formarea unui complex între hMLH1 și hPMS2 (figura 2a, benzile 5 și 10). În plus, am detectat formarea unui complex între HNPCC-hMLH1 (T117M) și hPMS2 (figura 2a, banda 11). Cu toate că am constatat că proteina HNPCC-hMLH1 (T117M) este exprimată în celulele eucariote NIH3T3 (datele nu sunt prezentate), nu am reușit să reproducem interacțiunea cu hPMS2 în testul de hibridare a drojdiei (Figura 3a). O explicație pentru această discrepanță ar putea fi formarea de trei ori mai redusă a complexului între hPMS2 și proteina mutantă HNPCC-hMLH1 (T117M) în comparație cu proteinele hPMS2 și hMLH1, așa cum a fost cuantificată cu un fosfoimager (date nearătate) (figura 2a, benzile 10 și 11). În schimb, formațiunile complexe dintre trunchii proteinei hMLH1, HNPCC-hMLH1 (Q426X) și HNPCC-hMLH1 (1813insA), și hPMS2 nu au fost detectate în niciunul dintre teste (figura 2a, benzile 12 și 13 și figura 3a). A fost vizibilă o bandă slabă în reacția de extragere în jos care conținea HNPCC-hMLH1 (1813insA) și hPMS2 (figura 2a, banda 13), dar intensitatea a fost similară cu cea a benzii obținute în reacția care conținea doar proteina hPMS2 (figura 2a, banda 3) și, prin urmare, este puțin probabil ca aceasta să reprezinte un adevărat complex între HNPCC-hMLH1 (1813insA) și hPMS2.

(a) Alinierea secvenței familiei MutL. hMLH1: omologul MutL uman hMLH1, yMLH1: omologul MutL MLH1 din Saccharomyces cerevisiae MutL, MutL: MutL din Escherichia coli MutL. Reziduurile conservate sunt indicate cu caractere aldine. Alinierea secvențelor a fost realizată cu ajutorul ClustalW Multiple Sequence Alignment. (b) Structuri ale proteinelor hPMS2, hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X), HNPCC-hMLH1 (1813insA), hEXO1a/HEX1, hEXO1b, hEXO1a/HEX1-N-terminal, hEXO1a/HEX1-C-terminal și hEXO1b-C-terminal (Y5). Trei familii daneze diagnosticate cu HNPCC au fost identificate prin intermediul registrului danez HNPCC. Două noi mutații HNPCC, o mutație fără sens (de la CAG la TAG) la nivelul codonului 426 (Q426X) și o mutație frame-shift (inserție de A la nucleotidul 1813) care duce la o oprire prematură la nivelul codonului 609 (1813insA) al hMLH1, au fost identificate în familiile care îndeplineau criteriile de la Amsterdam. Cea de-a treia mutație, o mutație de tip missense de la treonină la metionină la codonul 117 (T117M) din hMLH1 a fost descrisă anterior (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm). Regiunea codificatoare hMLH1 a fost clonată în situsul EcoRI al pcDNA3 și utilizată ca șablon pentru mutageneza mediată de primer pentru a construi cele trei mutații HNPCC diferite în hMLH1, T117M, Q426X și 1813insA. Secvența ADN a tuturor mutațiilor sintetice și a fragmentelor amplificate prin PCR a fost confirmată prin secvențierea ADN. Celelalte construcții utilizate în acest studiu sunt hPMS2 (ADNc complet), HEX1-N (1355 bp regiunea N-terminală a HEX1/hEXO1a), HEX1-C (1182 bp regiunea C-terminală a HEX1/hEXO1a) și hEXO1b-C (Y5) (1952 bp regiunea C-terminală a hEXO1b). Toate construcțiile hEXO1 sunt descrise în detaliu în Rasmussen et al., 2000)

Dosarul proteinei de fuziune GST pentru a studia interacțiunea dintre proteinele hMLH1 și hEXO1b sau hPMS2. (a) Linia 1, proteina IVTT hPMS2 marcată IVTT; linia 2,+perle GST; linia 3,+lizatul BL21; linia 4,+proteina GST purificată; linia 5,+proteina GST-hMLH1 purificată; linia 6, proteina GST-hMLH1 purificată și vectorul IVTT marcat; banda 7, proteina GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) purificată și vectorul IVTT marcat; banda 8, proteina GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) purificată și vectorul IVTT marcat; banda 9, proteina GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) purificată și vectorul IVTT marcat; banda 10, proteina GST-hMLH1 purificată și proteina IVTT hPMS2 marcată; banda 11, proteina GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) purificată și proteina IVTT hPMS2 marcată; banda 12, proteina GST-HNPNPCC-hMLH1 (Q426X) purificată și proteina IVTT hPMS2 etichetată; și banda 13, proteina GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) purificată și proteina IVTT hPMS2 etichetată. (b) Banda 1, proteina IVTT hEXO1b; banda 2, + bila GST; banda 3, + lizatul BL21; banda 4, + proteina GST purificată; banda 5, + proteina GST-hMLH1 purificată; banda 6, proteina GST-hMLH1 purificată și vectorul IVTT marcat; banda 7, proteina GST-hMSH2 purificată și proteina IVTT hEXO1b marcată; banda 8, proteina GST-hMLH1 purificată și proteina IVTT hEXO1b marcată; banda 9, proteina GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) purificată și proteina IVTT hEXO1b marcată; banda 10, proteina GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) purificată și proteina IVTT hEXO1b marcată; și banda 11, proteina GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) purificată și proteina IVTT hEXO1b marcată. Toate reacțiile de translație a transcripției in vitro au fost efectuate cu ajutorul sistemului de lizat de reticulocit cuplat TNT (Promega). Pe scurt, lizații au fost incubați cu 1 μg de ADN, amestec de aminoacizi lipsit de cisteină, 35S-cisteină și ARN polimeraza T9, timp de 90 de minute la 30°C, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Vectorul pGEX (Pharmacia-Amersham) a fost utilizat pentru a construi GST-hMLH1, GST-hMLH1 (T117M), GST-hMLH1 (Q426X), GST-hMLH1 (1813insA) și GST-hMSH2. Toate construcțiile pGEX sunt proteine de fuziune GST N-terminale. Secvențierea ADN a întregii regiuni de codificare a confirmat toate construcțiile. Proteinele de fuziune au fost purificate așa cum au fost descrise de Guerrette et al. (1998), cu excepția utilizării culturilor de E. coli neinduse. Testele pull-down au fost efectuate conform descrierii lui Guerrette et al. (1998), cu excepția incubării proteinelor timp de 2 h la 30°C înainte ca amestecurile de reacție să fie încărcate pe geluri

Interacțiunea dintre hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) și HNPCC-hMLH1 (1813insA) cu hPMS2 sau hEXO1 în sistemul cu două punți hibride din drojdie. (a) Activitatea β-galactosidazei, indicată ca unități Miller, a fost determinată conform descrierii din Rasmussen et al. (2000). (b) și (c) Tulpinile care conțineau diferite plasmide au fost strecurate pe plăci SD-LEU-TRP+X-gal. Plasmidele conținute în fiecare tulpină testată sunt indicate în partea de sus a fiecărei coloane și în stânga fiecărui rând. AD: domeniu de activare, BD: domeniu de legare. Vectorii pAS2-1, pBRIDGE și pACT2 (CLONTECH) au fost utilizați pentru a construi proteine de fuziune GAL4. Testele yeast two-hybrid au fost efectuate așa cum au fost descrise anterior (Rasmussen et al., 2000). Pe scurt, regiunile codificatoare ale hMLH1 sau HNPCC-hMLH1 au fost amplificate prin PCR și clonate în situsurile EcoRI și BamHI din pBRIDGE sau în situsurile NcoI și BamHI din pACT2. hPMS2 a fost amplificat prin PCR folosind pREP4-hPMS2 (Risinger et al., 1998) ca șablon și clonat în situsul NdeI și BamHI din pAS2-1 și în situsurile SmaI și EcoRI din pACT2. Toate celelalte plasmide sunt descrise în Rasmussen et al. (2000). Niciunul dintre plasmide nu a prezentat vreo interacțiune cu vectorii bi-hibrid fără inserție

În mod constant, s-a demonstrat anterior, prin mutageneză de deleție, că interacțiunea dintre hMLH1 și hPMS2 este mediată prin partea C-terminală a hMLH1 (aminoacizii 506-756) și partea C-terminală a hPMS2 (aminoacizii 675-850) (Figura 1b) (Guerrette et al, 1999). Mutația HNPCC-hMLH1 (T117M) a fost raportată în nouă familii HNPCC fără legătură între ele, din diferite părți ale lumii (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm și date nesemnalate), sugerând, așa cum s-a demonstrat deja la drojdie (Shcherbakova și Kunkel, 1999; Shimodaira și colab., 1998), că mutația nu este un polimorfism legat. Mutația HNPCC-hMLH1 (T117M) se află pe o secvență conservată (figura 1), despre care se crede că este direct implicată în legarea și/sau hidroliza ATP (Ban et al., 1999). Astfel, mutația cu sens greșit HNPCC-hMLH1 (T117M) poate inactiva activitatea MMR prin alterarea capacității acestei proteine mutante de a lega și/sau hidroliza ATP și, odată cu aceasta, formarea de complexe cu alte proteine MMR. În concordanță cu această ipoteză, noi arătăm că indivizii HNPCC purtători ai mutațiilor HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) și HNPCC-hMLH1 (1813insA) sunt afectați în formarea heterodimerului hMutLα, ceea ce duce la un defect în activitatea MMR atunci când cea de-a doua alelă hMLH1 este pierdută sau inactivată.

În încercarea de a identifica factorii asociați MMR specifici pentru țesut, noi și alții am identificat recent o exonuclează umană care interacționează cu hMSH2 (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998; Tishkoff et al., 1998; Wilson III et al., 1998). Am demonstrat că hMSH2 interacționează cu ambele forme de hEXO1, hEXO1b și hEXO1a/HEX1, și că această interacțiune este mediată prin intermediul domeniilor lor C-terminale. În schimb, nu am detectat nicio interacțiune între hMSH6 și hEXO1 în sistemul cu două hibride (Rasmussen et al., 2000). Nu se știe dacă hEXO1 joacă un rol în MMR sau dacă interacțiunea sa cu hMSH2 este importantă pentru recombinare. Noi arătăm că proteina hMLH1, ca și hMSH2, interacționează cu ambele forme de hEXO1 (hEXO1b și hEXO1a/HEX1) și că această interacțiune este mediată prin intermediul domeniilor C-terminale ale exonucleazelor (figura 2b, benzile 5 și 8 și figura 3). Nu am detectat nicio interacțiune între hPMS2 și hEXO1 (Figura 3a,c). Datele noastre preliminare sugerează că prezența ambelor proteine hMLH1 și hPMS2 nu a împiedicat hEXO1 să se lege de hMLH1 (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, nu credem că formarea hMutLα blochează neapărat legarea hEXO1 la hMLH1. Pentru a caracteriza în continuare interacțiunea hMLH1-hEXO1, am construit fuziuni de proteină fluorescentă atât a hMLH1, cât și a hEXO1 și le-am introdus în celulele NIH3T3 (Figura 4). Rezultatele noastre arată că CFP-hMLH1 este prezentă în principal în nucleu, dar detectăm, de asemenea, o fracțiune din această proteină în citoplasmă (Figura 4, panoul 1). În schimb, detectăm doar YFP-hEXO1 în nucleu (Figura 4, panoul 2). Cu toate acestea, la cotransfecția cu YFP-hEXO1, CFP-hMLH1 a fost în întregime nucleară (Figura 4, panourile 3 și 4).

Localizarea nucleară a proteinelor de fuziune CFP-hMLH1 și YFP-hEXO1b. În ziua tratamentului, celulele NIH3T3 murine au fost transfectate tranzitoriu cu 3,5 μg de CFP-hMLH1 (panoul 1) sau de YFP-hEXO1b (panoul 2) sau cu ambele construcții (panourile 3 și 4). Celulele au fost incubate peste noapte, iar în ziua următoare localizarea subcelulară a proteinelor de fuziune a fost examinată prin microscopie confocală cu scanare laser. Celulele transfectate sunt, de asemenea, prezentate în imaginea Nomarski corespunzătoare. ADNc hMLH1 a fost clonat în situsurile EcoRI și BamHI ale vectorului pECFP-C2 (CLONTECH), iar ADNc hEXO1b a fost clonat în situsurile BamHI și SalI ale vectorului pEYFP-C1 (CLONTECH). Ambele construcții de proteină fluorescentă sunt fuziuni N-terminale

În rezumat, aceste rezultate demonstrează că cel puțin două proteine MMR, și anume, hMSH2 și hMLH1, interacționează cu exonucleaza 1 umană, în timp ce alte două proteine MMR, hPMS2 și hMSH6, nu sunt direct implicate în interacțiunea cu hEXO1 atunci când sunt evaluate în testul cu două hibride in vivo.

Pentru a examina dacă interacțiunile hMLH1 și hEXO1 ar putea fi afectate la pacienții cu HNPCC, a fost caracerizată asocierea celor trei proteine mutante hMLH1 descrise mai sus cu hEXO1. Interacțiunea pozitivă a fost demonstrată doar între HNPCC-hMLH1 (T117M) și proteina hEXO1b de lungime completă prin intermediul testului pull-down in vitro (figura 2b, banda 9). Cu toate acestea, cu ajutorul testului cu două hibride in vivo, nu au putut fi detectate interacțiuni proteină-proteină între proteinele HNPCC-hMLH1 și construcțiile de exonucleasă 1 testate (figura 3). Nu am putut studia interacțiunea dintre hEXO1 de lungime completă fuzionată cu domeniul de activare GAL4 și proteinele hMLH1, deoarece aceste construcții nu sunt funcționale în testul cu două hibride pe drojdie (Rasmussen et al., 2000). În mod similar, am constatat că hMLH1 și derivații hMLH1 fuzionați cu domeniul de activare GAL4 au dus la proteine de fuziune care sunt nefuncționale în testul two-hybrid (Figura 3 și datele nu sunt prezentate).

În concluzie, rezultatele noastre arată că trei noi mutații HNPCC-hMLH1 cunoscute ca fiind cosegregate cu predispoziția la cancer la pacienții cu HNPCC duc la un defect de asamblare a heterodimerului hMutLα care ar putea duce la o activitate MMR redusă. În mod similar, proteinele mutante HNPCC-hMLH1 sunt, de asemenea, incapabile să interacționeze cu proteina hEXO1 recent identificată, o proteină care acum pare să interacționeze cu hMLH1 și hMSH2, dar nu și cu hMSH6 și hPMS2. În prezent, căile biologice precise și contribuțiile globale ale acestor interacțiuni documentate rămân neclare, în mare parte pentru că s-a constatat că hMLH1 joacă un rol atât în MMR, cât și în recombinare. Disecarea defectelor moleculare în HNPCC prin testarea proteinelor MMR patogene în teste funcționale concepute pentru a cuantifica interacțiunile din complexele proteice ar trebui, împreună cu screening-ul mutațional, imunohistochimia și analiza microsateliților, să ajute la dezvoltarea de strategii pentru diagnosticarea și tratarea purtătorilor de HNPCC.

.