3.4 Modificarea inozinei și rotația ARNm

Modificarea adenozinei în inozină (A-I) a ARNm este catalizată de adenozina deaminazele care acționează asupra enzimelor ARN (ADAR). Aceste enzime au o preferință pentru regiunile de ARN bicatenar, iar conversia A-I (descrisă, de asemenea, ca editare în această secțiune) va schimba proprietățile de împerechere de baze ale bazelor modificate, deoarece acestea se vor împerechea acum în mod similar cu guanina. Așa cum s-a procedat anterior, vom separa efectele directe ale inozinei asupra stabilității ARNm de cele care rezultă din efectele indirecte. Introducerea inozinei în regiunile bicatenare ale ARN-ului poate declanșa degradarea prin recrutarea de ribonucleaze specifice pentru ARN-urile care conțin inozină. Prima enzimă propusă pentru a media acest efect este nucleaza Tudor-stafilococică (SN), care s-a dovedit a promova scindarea ARN-urilor dublu catenar hypereditate în extracte . Cele mai multe dintre rezultatele descrise în acest studiu demonstrează o activitate biochimică pentru Tudor-SN asupra substraturilor hiperedite in vitro. Cu toate acestea, nu este clar din aceste studii ce fracțiune de ARNm care conține inozină este supusă clivajului de către Tudor-SN in vivo și dacă Tudor-SN a fost sau nu endonucleaza directă. S-a constatat că Tudor-SN este localizat în granulele citoplasmatice de stres , astfel încât este posibil ca unele dintre transcriptele sale țintă să fie reglate în mod preferențial în condiții de stres. A doua nuclează cunoscută ca fiind specifică pentru ARN-urile care conțin inozină este endonucleaza umană V (hEndoV), care poate cliva o varietate de substraturi de ARN care conțin inozină in vitro . Un studiu a sugerat că hEndoV este adevărata endonucleasă a inozinei, Tudor-SN oferind o activitate stimulatoare pentru hEndoV . Este interesant faptul că hEndoV se localizează, de asemenea, în granulele citoplasmatice de stres , sugerând o funcție similară cu cea a lui Tudor-SN în reglarea potențială a nivelurilor de ARNm care conțin inozină în timpul stresului. În general, deși este clar că activitățile nucleazei specifice inozinei există în celulele eucariote (Fig. 5), contribuția lor la scindarea și reînnoirea ARNm rămâne puțin înțeleasă. Prin urmare, impactul fiziologic al scindării dsARN hyperedited de către Tudor-SN și/sau hEndoV trebuie explorat mai amănunțit.

Enzimele ADAR pot juca, de asemenea, un rol major în stabilitatea ARNm prin reglarea legăturii proteinelor de legare a ARN care influențează dezintegrarea ARNm. Influența ADAR-urilor asupra nivelului ARNm-urilor lor țintă a fost măsurată la nivel global și, în general, impactul lor asupra nivelului ARNm nu se corelează bine cu capacitatea lor de a promova formarea de inozină în aceste ARNm . Mai degrabă, se pare că impactul major al ADAR-urilor asupra stabilității ARNm este prin recrutarea proteinei de legare a ARN HuR (ELAVL1), care este un regulator major al dezintegrării ARNm. ADAR1 interacționează cu HuR într-o manieră dependentă de ARN, iar majoritatea ARNm-urilor care au fost reduse în absența ADAR1 conțin situsuri de legare a HuR . Astfel, ADAR1 pare să influențeze stabilitatea țintelor sale de ARNm prin recrutarea HuR la site-urile țintă situate în apropiere. ADARs poate, de asemenea, să reglementeze nivelurile mai multor ARNm și ARNc prin împiedicarea legării factorului de dezintegrare PARN, care este o nuclează specifică poli(A) . Această funcție pare, de asemenea, independentă de editare, deoarece un mutant ADAR inactiv din punct de vedere catalitic este capabil să îndeplinească funcțiile enzimei de control al descompunerii. Astfel, impactul ADAR-urilor asupra stabilității țintelor lor ARNm pare să fie în mare parte independent de capacitatea lor de a promova formarea de inozină.

O consecință majoră a modificării inozinei asupra rotației ARNm se datorează impactului inozinei asupra reglării genice mediate de microARN. Prezența inozinei poate influența două etape majore ale acestei căi: (i) biogeneza microARN-urilor și (ii) specificitatea țintirii ARNm-urilor de către microARN-uri. În ceea ce privește impactul inozinei asupra biogenezei microARN-urilor, s-a demonstrat că precursorii primari ai microARN-urilor pot fi editați de ADAR1 sau ADAR2 . Prezența inozinei în acești precursori are două efecte dăunătoare asupra producției de microARN-uri mature . În primul rând, inozina reduce eficiența procesării precursorilor primari de către Drosha; în al doilea rând, precursorii care conțin inozină devin acum o țintă pentru ribonucleazele specifice inozinei, cum ar fi Tudor-SN și/sau hEndoV. Aceste efecte combinate ale modificării inozinei asupra precursorilor primari ai microARN-urilor au ca rezultat o scădere a nivelurilor de microARN-uri produse din acești precursori, cu o creștere concomitentă a ARNm-urilor țintă. Acest proces poate fi reglementat, deoarece s-a demonstrat că precursorii microARN-ului miR-151 sunt editați în timpul dezvoltării timpurii, ceea ce duce la degradarea precursorilor de către Tudor-SN . Mai general, precursorii microARN-urilor care conțin inozină sunt degradați în timpul etapelor postzigotice la șoareci . Aceste rezultate arată că editarea A-I a precursorilor de microARN-uri poate regla biogeneza acestora în timpul dezvoltării, ceea ce, la rândul său, afectează direct expresia țintelor lor ARNm. Cu toate acestea, efectul ADAR-urilor asupra biogenezei microARN-urilor este complex, deoarece s-a demonstrat, de asemenea, că ADAR1 se heterodimerizează cu enzima RNază III Dicer pentru a crește eficiența procesării microARN-urilor , jucând astfel un rol pozitiv în biogeneza microARN-urilor. Complexitatea efectelor directe și indirecte ale ADAR-urilor asupra biogenezei ARN-urilor mici a fost, de asemenea, demonstrată la nivelul genomului la Caenorhabditis elegans. În cele din urmă, ADAR1 poate, de asemenea, să se lege de siARN-uri independent de editarea ARN în celulele de mamifere, ceea ce limitează eficacitatea tratamentului cu siARN . Prin urmare, ADAR-urile par a fi o sabie cu două tăișuri pentru silențierea genelor mediată de microARN și ARN mic, deoarece efectul supresiv al modificării inozinei asupra procesării și stabilității precursorilor de microARN poate fi contrabalansat de capacitatea ADAR-urilor de a promova procesarea microARN-urilor prin asocierea lor cu Dicer și de efectul lor asupra disponibilității siARN-urilor. Cu toate acestea, aceste enzime joacă funcții-cheie în controlul diferențierii celulare prin editarea precursorilor de microARN. De exemplu, s-a demonstrat că hipereditarea precursorului microARN Let-7 de către ADAR1 în leucemie promovează reînnoirea celulelor stem leucemice , subliniind importanța reglării fine a editării precursorilor de microARN în timpul diferențierii celulare.

Inosina influențează, de asemenea, reglarea ARNm mediată de microARN prin afectarea formării duplexului de ARN, care este esențială în determinarea specificității interacțiunilor microARNm-ARNm (Fig. 5). Acest lucru a fost demonstrat pentru prima dată prin faptul că introducerea inozinei în microARN-ul miR-376 a dus la reprimarea unui grup diferit de ARNm în raport cu cele reprimate de miR-376 nemodificat. În cazul în care situl editat se află în secvența de semințe a microARN-ului, modificarea are ca rezultat o schimbare a specificității pentru microARN, deoarece inozina se împerechează preferențial cu C. În mod reciproc, editarea A-I în secvențele 3′-UTR ale ARNm va schimba potențialul de direcționare a acestor UTR-uri de către microARN-uri și poate crea noi situri de legare a microARN-urilor. S-a demonstrat că editarea reglată este potențial importantă în reglarea oncogenelor și a genelor supresoare de tumori prin microARN-uri în timpul transformării celulare .

În cele din urmă, inozina poate influența stabilitatea ARNm prin efecte indirecte. S-a constatat că ARNm care conțin inozină sunt restricționate la nucleu în celulele imune stimulate de LPS , împiedicând expunerea lor la mașinăria citoplasmatică de dezintegrare a ARNm. Cu toate acestea, reținerea nucleară a acestor ARNm le-ar supune degradării preferențiale prin căile de degradare nucleară, cum ar fi exosomul nuclear. Acest lucru poate avea ca rezultat o creștere sau o scădere a stabilității, în funcție de eficiența relativă a fiecăreia dintre aceste căi de degradare asupra ARNm-urilor specifice. Inozina are, de asemenea, un impact asupra splicingului alternativ, care, la rândul său, ar putea duce la izoforme de ARNm cu stabilități diferite. Acest lucru este valabil mai ales în cazul în care speciile splitate alternativ conțin situsuri de legare pentru proteine de legare a ARN-ului distincte care le modulează stabilitatea. Prin urmare, inozina și ADAR-urile pot afecta stabilitatea și expresia ARNm în multe moduri printr-o combinație de efecte directe și indirecte.

.