Rezultate

Analiza probelor clinice.

În septembrie 2006, virusul gripal A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) a fost izolat de la mai mulți porci în vârstă de 5 până la 6 săptămâni cu bronhopneumonie multifocală la o crescătorie comercială de porci cu surse multiple. Leziunile pulmonare au inclus bronhopneumonie purulentă moderată, subacută până la cronică, și pneumonie interstițială cu bronșiolită și peribronșită. Țesutul pulmonar a fost negativ pentru virusul sindromului respirator și de reproducere a porcinelor (PRRSV), pentru circovirusul porcin de tip 2 (PCV2) și pentru Mycoplasma hyopneumoniae, dar a fost pozitiv pentru Streptococcus suis. Din cauza leziunilor caracteristice asemănătoare gripei și a semnelor clinice de pneumonie, omogenatul de țesut pulmonar a fost inoculat pe celule de rinichi canin Madin-Darby (MDCK). Efectele citopatice au fost detectate în ziua 3 postinoculare (p.i.). Gena nucleoproteinei (NP) a virusului gripal a fost detectată în celulele infectate prin RT-PCR. Virusul nu a reacționat cu antiserul porcin de referință (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) în testele de inhibiție a hemaglutinării (HI), iar RT-PCR multiplex nu a detectat gene H1N1 sau H3N2 (14). Virusul a fost trimis la Centrul Național pentru Bolile Animalelor (NADC) în februarie 2007 pentru subtipare și secvențiere.

După ce izolatul din septembrie a fost subtipat și secvențiat (descris mai jos), o căutare a înregistrărilor de caz a arătat că un alt izolat gripal „netipabil” fusese trimis în aprilie 2006. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) fusese izolat de la un porc de 12 săptămâni cu boală respiratorie la o altă fermă comercială de creștere și finisare a porcilor. Leziunile pulmonare erau caracteristice, din punct de vedere histopatologic, gripei porcine (inflamație severă, subacută a alveolelor și bronhiilor, cu necroză și metaplazie a celulelor epiteliale bronhiolare). Plămânul a fost negativ pentru PRRSV, PCV2 și M. hyopneumonia, dar a fost pozitiv pentru virusul gripal A prin RT-PCR (specific pentru gena NP) și S. suis. Virusul a fost trimis la NADC în martie 2007 pentru subtipare și secvențiere.

Subtipare și analiză filogenetică.

Pentru identificarea și caracterizarea ambelor virusuri gripale, au fost efectuate secvențierea acidului nucleic și analiza moleculară și filogenetică. Ambele virusuri au fost secvențiate direct din izolate cu trecere joasă folosind celule MDCK, iar secvențele au fost confirmate după purificarea în plăci și resecvențiere. Acestea au fost identificate ca fiind virusuri H2N3 prin secvența nucleotidelor și o căutare BLAST în baza de date privind secvențele de influență (www.flu.lanl.gov). Segmentul genei HA al Sw/4296424 a fost cel mai apropiat de cel al virusurilor H2 izolate de la rațe sălbatice din America de Nord. Segmentul său NA a fost strâns înrudit cu cel al unui virus H4N3 al gripei aviare (AIV) izolat de la o rândunică cu aripi albastre (98,3% identitate). Cu excepția genei acidului polimerazei (PA), genele sale interne proveneau de la virusurile contemporane de gripă porcină triplu-reasigurătoare care se găsesc în prezent în Statele Unite. Aceste virusuri poartă gene interne de origine umană (PB1), aviară (PB2, PA) și de origine porcină (tabelul SI 4). Segmentul său PA a fost identic în proporție de 99,2 % cu cel al virusului AIV H6N5 izolat de la rațe sălbatice (tabelul SI 4). Virusurile Sw/2124514 și Sw/4296424 au prezentat o identitate totală a secvenței de nucleotide de 99,3-99,9% (tabelul SI 5). Ambele izolate au fost clonate pe plăci în mod repetat, retestate și confirmate prin secvențiere ca aparținând subtipului H2N3. Subtipul H2N3 a fost confirmat serologic prin teste de inhibiție a hemaglutinării și de inhibiție a neuraminidazei. Analiza filogenetică bazată pe genele HA și NA a arătat că aceste două virusuri aparțin liniei aviare americane care este distinctă de tulpinile aviare eurasiatice și de virusurile H2N2 izolate de la om după pandemia de gripă din 1957 (Fig. 1).

Analiză moleculară a proteinelor de suprafață HA și NA.

Virusurile gripale A conțin două proteine de suprafață: HA este glicoproteina de legare a receptorilor și de fuziune a membranei, iar NA este o enzimă care distruge receptorii. HA virală este un factor critic al specificității speciei gazdă a virusurilor gripale (15). Pentru a caracteriza reziduurile din cadrul HA care pot fi asociate cu adaptarea unui virus aviar la gazda mamiferă, am comparat secvențele de aminoacizi ale HA de porc cu cele ale virusurilor aviare de referință presupuse. Comparația moleculară a moleculelor HA ale celor două izolate H2N3 de porc a arătat că acestea diferă de virusul H2N3 de referință putativ izolat de la rațe sălbatice prin șase substituții comune de aminoacizi (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I și L506V) (tabelul SI 6). Substituția Q226L a fost găsită în ambele izolate H2N3 de porc, în timp ce poziția 228 conținea G, identic cu secvența consensuală aviară (tabelul 1) (16). În schimb, moleculele HA umane de subtip H2 conțin 226L și 228S, în timp ce izolatele H2 umane timpurii conțin 226L și 228G (tabelul 1), similar cu izolatele porcine. Pozițiile 36N, 274I, 316I și 419I sunt unice pentru cele două izolate porcine H2N3 (tabelul SI 6), în timp ce pozițiile respective în izolatele umane și aviare descrise în figura 1 a sunt 36D, 274T, 316V și 419L. În cazul izolatelor de gripă descrise în figura 1 a, poziția 506V este conservată la om, la cele două izolate porcine H2N3 și la izolatele aviare, cu excepția A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), după cum se arată în tabelul SI 6. Două modificări comune ale aminoacizilor în secvența de aminoacizi NA a ambelor izolate porcine au fost găsite în comparație cu virusul H4N3 de referință izolat de la rândunica cu aripi albastre: H47Y și H253Y (tabelul SI 7). Poziția 47Y în ambele izolate H2N3 porcine este aceeași cu aminoacidul respectiv din izolatele aviare eurasiatice descrise în Fig. 1 b; invers, poziția din izolatele aviare nord-americane este 47H. Poziția 253Y este unică pentru izolatele H2N3 de porc, iar poziția 253H este conservată în izolatele aviare eurasiatice și nord-americane reprezentate în Fig. 1 b. Este interesant faptul că Sw/4296424 (H2N3), izolat cu 5 luni mai târziu decât Sw/2124514 (H2N3), a prezentat două substituții suplimentare (P162S și L321V) în molecula HA și trei substituții suplimentare (V30I, I49T și A135T) în molecula NA în comparație cu HA și NA din Sw/2124514 (tabelele SI 6 și 7). Poziția 30I (Sw/4296424) în molecula NA este similară cu cea a izolatelor eurasiatice, în timp ce poziția 30V (Sw/2124514) este conservată în izolatele aviare nord-americane.

Patogenitatea și transmisibilitatea virusului gripal porcin H2N3 la porci.

Pentru a investiga gradul de adaptare a virusului H2N3 la porci, am investigat patogenitatea acestuia la această gazdă prin inocularea a 20 de porci în vârstă de 4 săptămâni cu 2 × 106 doze infecțioase de 50% din cultura de țesut (TCID50) a virusului Sw/4296424. A fost ales doar un singur virus H2N3, din cauza identității ridicate dintre cele două izolate. Doisprezece porci de control au fost inoculați în mod fictiv cu supernatant de cultură celulară neinfecțios. Am evaluat transmisibilitatea prin colocarea a 10 porci de contact de aceeași vârstă cu porcii inoculați, începând cu ziua 3 p.i. Toți porcii utilizați pentru studiu au fost seronegativi în ziua 0 în ceea ce privește anticorpii împotriva virusurilor gripei porcine H1N1, H1N2, H2N3 și H3N2 prin testul HI. Cinci porci inoculați și trei porci de control au fost eutanasiați pentru necropsie în zilele 3, 5 și 7 p.i. Cei 10 porci de contact și cei 5 porci inoculați cu virusul au fost testați serologic cu H2N3 prin testul HI în ziua 24 după contact sau, respectiv, în ziua 27 p.i. Nu s-au observat semne respiratorii acute. Necropsia a evidențiat leziuni pulmonare macroscopice severe (zone consolidate, de culoare prună) la porcii inoculați, dar nu a evidențiat niciuna la porcii de control (tabelul 2). Scorul histopatologic (0-3) care exprimă gradul de afectare a arhitecturii pulmonare a fost >2 la porcii inoculați (tabelul 2). Plămânii de la porcii inoculați eutanasiați în ziua 3, 5 sau 7 p.i. prezentau pneumonie interstițială ușoară până la moderată și bronșiolită necrozantă acută sau subacută, cu o ușoară manșetă limfocitară a bronhiolelor și a vaselor (Fig. 2). Virusul a fost titrat în lichidul de lavaj bronhoalveolar (BALF) și a fost izolat din probele de tampoane nazale. Titrul virusului în plămâni a variat între 104,3 și 106,5 TCID50/ml în zilele 3 și 5 p.i. (tabelul SI 8) și a fost negativ în ziua 7 p.i. În grupul inoculat cu H2N3, virusul a fost izolat din probe de tampoane nazale la 25 % (5 din 20) dintre porci în ziua 3, 67 % (10 din 15) în ziua 5 și 20 % (2 din 10) în ziua 7 p.i.; în grupul de contact, 10 % (1 din 10) dintre probe au fost pozitive în zilele 5 și 7 după contact. În schimb, 100% (10 din 10) dintre porcii de contact au fost seropozitivi după 24 de zile de la contactul cu porcii inoculați (tabelul SI 9). Unii porci de control au prezentat ocazional un mic focar de pneumonie interstițială ușoară (tabelul 2), dar au fost negativi pentru infecția cu virusul gripei porcine. Toți porcii au fost negativi pentru PRRSV și M. hyopneumoniae prin PCR. Rezultatele noastre indică faptul că virusul H2N3 este patogen la porci și este transmisibil între porci.