Creșterea și producția de etanol de S. cerevisiae NCYC 2826 pe hidrolizat de paie de grâu

Figura 1A prezintă creșterea lui S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 crescut la 30°C timp de 36 h într-o cultură care conține un hidrolizat cu o concentrație de glucoză de 123 mM, preparat conform descrierii din secțiunea „Metode”. Tulpina S. cerevisiae a fost aleasă datorită toleranței ridicate la etanol și a robusteții sale în fermentațiile industriale. Figura 1A arată că, atunci când S. cerevisiae NCYC 2826 a fost cultivată numai cu hidrolizat de paie de grâu, s-a înregistrat o rată de creștere lentă μ de 0,036 h-1 și o densitate optică finală (DO) de 0,8. Adăugarea bazei nutritive de drojdie (YNB) la mediu a determinat o creștere a μ la 0,135 h-1 și o densitate optică finală de 1,5, în timp ce adăugarea a 2,3 mg ml-1 de uree la hidrolizatul de paie de grâu a dat o μ de 0,99 h-1 și o densitate optică finală de 1,3. Studii anterioare au arătat că suplimentele de uree pot crește producția de etanol în fermentația drojdiei și că ureea însăși este o componentă esențială în cele mai minimale medii de creștere a drojdiei . Rezultatele noastre susțin aceste constatări anterioare, confirmând cerința de uree pentru o creștere aproape optimă a drojdiei. După 36 de ore, s-a măsurat concentrația de etanol din culturi, iar randamentul de etanol obținut din 123 mM de glucoză a fost de aproximativ 90% din randamentul teoretic total pentru toate culturile. Deși în aceste trei condiții de cultură s-a produs etanol cu un randament comparabil, creșterea a fost mai lentă și densitatea optică finală a fost mai mică în cazul hidrolizatului de paie de grâu decât atunci când în cultură s-a adăugat uree sau YNB. Acest lucru sugerează că, deși glucoza era disponibilă pentru fermentare, hidrolizatul nu conținea suficiente elemente nutritive pentru a permite culturii să se dividă la rata sa maximă și să atingă densitatea optimă.

Pentru a investiga cauza scăderii creșterii celulare pe hidrolizatul de paie de grâu, S. cerevisiae NCYC 2826 a fost cultivată pe hidrolizatul obținut folosind o concentrație inițială de paie de 5%, 10%, 15% și 20% și suplimentat cu 2,3 mg ml-1 de uree. Figura 1B arată că, odată cu creșterea concentrației inițiale de paie, a crescut și faza de întârziere a creșterii, ajungând la 20 h la o concentrație inițială de paie de 20 %. DO finală a crescut, de asemenea, odată cu creșterea concentrației de paie, din cauza concentrațiilor crescute de glucoză eliberată. Creșterea fazei de decalaj este caracteristică pentru inhibarea creșterii de către compușii furanici adesea prezenți în hidrolizatele de paie. Analiza conținutului de furan din hidrolizat a arătat că conținutul de HMF a fost neglijabil (datele nu sunt prezentate), dar concentrația de furfural prezentă a crescut odată cu concentrația inițială de paie, ajungând la 0,5 mg ml-1 la un conținut inițial de paie de 20% (figura 2). Aceste date sugerează că creșterea S. cerevisiae NCYC 2826 pe hidrolizatul de paie de grâu este limitată de concentrația de furfural prezentă în hidrolizat.

Concentrația de glucoză (pătrate) și furfural (triunghiuri) prezentă în hidrolizatul de paie de grâu realizat conform descrierii din secțiunea ‘ Metode ‘ cu o concentrație crescătoare de paie inițială.

Analiza creșterii setului de tulpini SGRP pe furfural

Pentru a identifica tulpinile de drojdie care ar putea fi rezistente la furfuralul contaminant, setul de tulpini SGRP descris în metode a fost cultivat în YNB, 100 mM glucoză și în prezența a 1,5 mg ml-1 furfural. Tabelul 1 prezintă analiza toleranței setului de tulpini SGRP la 1,5 mg ml-1 de furfural, utilizând sistemul de notare descris în secțiunea „Metode”. A fost necesar un sistem de punctaj în locul timpilor medii de întârziere, deoarece replicile tulpinii care nu au reușit să crească nu au avut o fază de întârziere măsurabilă, dar trebuiau totuși incluse în setul de date.

Am observat anterior că creșterea inoculului în culturile care conțin furfural a dus la o scădere a fazei de întârziere, probabil prin maximizarea cantității de celule de drojdie viabile introduse în mediu, ceea ce a dus la stabilirea mai rapidă a fazei exponențiale de creștere (date neevidențiate). Prin urmare, pentru aceste experimente, s-a utilizat un volum de inocul de 5 % din cultura de peste zi. Datele din tabelul 1 arată că creșterea pe plăcile de replică a fost extrem de variabilă și, de asemenea, dependentă de tulpină, demonstrând că o concentrație de 1,5 mg ml-1 de furfural este suficientă pentru a distinge toleranța la furfural la tulpinile de S. cerevisiae și S. paradoxus. Atunci când creșterea tulpinilor a fost testată în YNB care conținea 100 mM de glucoză și 2,0 sau 3,0 mg ml-1 de furfural, s-a observat o creștere foarte mică în oricare dintre aceste condiții la oricare dintre tulpinile analizate. Prin urmare, s-a decis să se selecteze tulpinile folosind datele de 1,5 mg ml-1 și să le supunem unei examinări mai detaliate a furfuralului. Analiza datelor prezentate în tabelul 1 arată că, în general, tulpinile de S. cerevisiae au crescut mai bine decât tulpinile de S. paradoxus la 1,5 mg ml – 1 de furfural. Aproape 20 % din tulpinile de S. paradoxus testate nu au primit nota maximă în sistemul de notare, în timp ce pentru S. cerevisiae acest procent a fost mai mic de 10 % și s-a reflectat, de asemenea, în scorul general mediu mai mare pentru S. cerevisiae, de 2,5 ± 1,4, față de 2,1 ± 1,4 pentru S. paradoxus. Cu toate acestea, în cadrul fiecărui grup de tulpini a existat o variație semnificativă, scorurile variind de la 1,7 la 3,7 pentru S. cerevisiae și de la 0,3 la 3,0 pentru S. paradoxus. Tulpinile care au obținut un scor de peste 2,9 cu o deviație standard mai mică de 1,5 au fost considerate ca prezentând o toleranță semnificativă la furfural. În consecință, tulpinile S. cerevisiae NCYC 3284 (ex sol, SUA), NCYC 3290 (ex vin de bili, Africa de Vest), NCYC 3312 (ex sol, Țările de Jos) și NCYC 3451 (ex must, Irlanda), împreună cu S. paradoxus NCYC 3277 (ex scoarță de stejar, Regatul Unit) au fost examinate în continuare în cadrul unui screening mai detaliat al furfuralului.

Efectele concentrațiilor crescânde de furfural asupra creșterii și producției de etanol

Figura 3 arată creșterea în prezența unor cantități variabile de furfural (0,1 până la 4,0 mg ml-1) pentru tulpinile S. cerevisiae NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 și NCYC 3451 și tulpina S. paradoxus NCYC 3277 identificată în tabelul 1 din setul de tulpini SGRP ca având o rezistență sporită la furfural. Fișierul suplimentar 1: Figura S1 prezintă datele de creștere corespunzătoare reprezentate pe o scară logaritmică. Tulpina de control S. cerevisiae NCYC 2826 a fost, de asemenea, inclusă în scopuri comparative. Pentru toate cele șase tulpini, pe măsură ce concentrația de furfural a crescut, curbele de creștere au început să prezinte creșteri ale fazei de întârziere, așa cum s-a observat anterior în creșterile care conțin furfural. Toate tulpinile testate au fost capabile să crească pe YNB suplimentat cu 100 mM glucoză și 0,1 până la 1,5 mg ml-1 de furfural. S. cerevisiae NCYC 2826, tulpina noastră de control, a fost capabilă să crească doar cu până la 1,5 mg ml-1, ceea ce a dus la o reducere de 30 % a DO finale în comparație cu creșterea cu 0,1 mg ml-1 de furfural. Tabelul 2 arată că producția de etanol de către NCYC 2826 în aceste condiții a fost considerabil redusă în comparație cu randamentul de aproximativ 90 % observat atunci când a crescut doar pe YNB și glucoză sau pe hidrolizat de paie de grâu. S. cerevisiae NCYC 2826 a fost izolată din must de struguri și, prin urmare, este puțin probabil să fi evoluat capacitatea de a crește și de a fermenta în timpul expunerii la furfural.

În studiul lor de genomică a populației, Liti et al. au identificat cinci linii genetice de S. cerevisiae bine definite și izolate geografic (Malaezia, America de Nord, Saké, Africa de Vest și „Wine/European”), precum și multe tulpini recombinate (mozaic) diferite din aceste linii genetice. Din rezultatele prezentului studiu reiese că rezistența la furfural nu este o caracteristică fenotipică specifică unei anumite linii de S. cerevisiae. Dintre cele patru tulpini SGRP S. cerevisiae SGRP rezistente la furfural identificate, NCYC 3284 (YPS128) aparține liniei nord-americane, NCYC 3290 (DBVPG 6044) aparține liniei vest-africane, NCYC 3312 (DBVPG 1373) aparține liniei „Wine/European”, în timp ce NCYC 3451 (un derivat cu un singur spor al NCYC 361) este o tulpină recombinantă.

S. cerevisiae NCYC 3451 a prezentat cea mai mare rezistență la furfural (Figura 3F, Fișierul suplimentar 1: Figura S1F) și a fost capabilă să crească în prezența a până la 3,0 mg ml-1 de furfural. Mai mult, producția de etanol în această tulpină nu a părut să fie inhibată de furfural, cea mai mare producție de etanol (95 ± 15 %; tabelul 2) fiind obținută la o concentrație (de furfural) de 3,0 mg ml-1 . După cum s-a menționat deja, NCYC 3451 este o tulpină recombinantă și s-a demonstrat că are un genom de tip mozaic derivat din cel puțin trei linii genetice diferite, și anume Saké, Africa de Vest și „Wine/European” (Liti et al. ). Deși a fost înregistrată ca fiind izolată din must ca drojdie de bere, structura extrem de complexă a genomului acestei tulpini ar sugera cu tărie, deși nu este dovedită, că este de origine industrială (de exemplu, o tulpină de panificație sau de fabricare a berii). Dintre cele patru tulpini SGRP rămase testate, tulpinile S. cerevisiae NCYC 3290 și NCYC 3312 au fost ambele capabile să crească cu 2,5 mg ml-1 de furfural (Figura 3D,C, Fișier suplimentar 1: Figura S1D și, respectiv, S1C), în timp ce S. cerevisiae NCYC 3284 (Figura 3E, Fișier suplimentar 1: Figura S1E) și S. paradoxus NCYC 3277 (Figura 3B, Fișier suplimentar 1: Figura S1B) au putut crește doar cu 2,0 mg ml-1 de furfural. În general, producția de etanol în cele cinci tulpini SGRP nu a fost afectată în mod semnificativ de prezența furfuralului. De fapt, pentru NCYC 3312, prezența a 0,5 mg ml-1 de furfural a dus la o creștere notabilă a randamentului de etanol, de la 41 ± 8 % din randamentul preconizat la 75 ± 5 % (tabelul 2). Acest lucru a fost observat, de asemenea, în cazul tulpinii NCYC 3451 de alterare a berii, dar într-o măsură mai mică (doar o creștere de 14 % a randamentului; tabelul 2). Într-adevăr, s-a demonstrat recent că cantități mici de alcool furfurilic, un produs al deshidratării furfuralului în drojdie, pot duce, de fapt, la o creștere a producției de etanol .

.