Termodinamica topirii joncțiunii.

Entropia ΔS și entalpia ΔH de topire obținute prin adaptarea experimentelor (romburi roșii) și a simulărilor (cercuri verzi) la ecuația van’t Hoff (ecuația 1). Inserția arată o relație liniară aproximativă de compensare entropie-entalpie. Atât datele experimentale cât și cele simulate prezintă o concordanță mai bună cu ecuația van’t Hoff evaluată la TM (ecuația 2, linia albastră).

care rezultă din ecuația 1 prin stabilirea lui α = 1/2 la TM. Figura 4 demonstrează coerența cu această relație și clarifică faptul că compensarea liniară între ΔH și ΔS este doar aproximativă; dacă valorile TM ar varia mai semnificativ cu concentrația, abaterile de la liniaritate între ΔH și ΔS ar fi mai evidente, în timp ce ecuația 2 ar trebui să rămână valabilă. Mai important din punct de vedere practic este faptul că aceste rezultate demonstrează eficacitatea modelului 3SPN.2 în reproducerea caracteristicilor energetice și termodinamice ale joncțiunilor care sunt în strânsă concordanță cu datele experimentale.

Abundanțe conformaționale și structură

Pentru a sonda în continuare capacitatea modelului 3SPN.2 de a prezice proprietățile experimentale ale joncțiunilor, examinăm populația relativă a conformațiilor joncțiunilor. Din punct de vedere experimental, se știe că forma plană deschisă este predominantă la o concentrație scăzută de sare, iar, la o concentrație mai mare de sare, joncțiunile adoptă conformații suprapuse (Fig. 1). La o concentrație relativ ridicată = 50 mM și T = 298 K, experimentele indică o abundență relativă de 23/77% a izoformelor suprapuse I/II, respectiv15. Aici, folosim modelul 3SPN.2 pentru a examina o gamă largă de concentrații de sare la T = 300 K pentru a valida modelul și pentru a oferi o predicție pentru dependența globală de concentrația de sare a populațiilor de joncțiuni. Rețineți că noi examinăm efectul Na+, mai degrabă decât al Mg2+, care dă rezultate similare16,45.

Așa cum au subliniat Thirumalai și colaboratorii26, corespondența dintre o medie de timp și media ansamblului (ergodicitate) pentru joncțiunile cu patru căi poate fi ruptă pe scări de timp observaționale destul de mari, datorită ratei de conversie între conformațiile joncțiunilor. Astfel, pentru a estima populațiile relative ale conformațiilor suprapuse, avem nevoie de un ansamblu semnificativ de simulări. În consecință, pentru fiecare concentrație de sare, efectuăm 100 de simulări independente, fiecare pornind de la configurația deschisă, deoarece această conformație se convertește rapid și aleatoriu fie în iso-I, fie în iso-II. Fiecare simulare este executată timp de 2 μs, obținându-se un total de 200 μs de date de traiectorie pentru fiecare concentrație de sare, împărțite între 100 de eșantioane independente. Acest lucru oferă o estimare inițială pentru populația relativă a fiecărei conformații. Pe baza acestei estimări, efectuăm alte 100 de simulări utilizând un raport de configurații inițiale deschise, iso-I sau iso-II care se conformează cu estimarea preliminară a populației, pentru a vedea dacă rezultatele noastre sunt sensibile la pornirea din starea deschisă. Constatăm că estimările privind populația rămân stabile în limitele incertitudinii noastre statistice, astfel încât nu găsim niciun efect semnificativ datorat începerii din starea deschisă. Rezultatele noastre sunt afectate dacă folosim fie toate configurațiile inițiale izo-I, fie toate configurațiile inițiale izo-II, din cauza inter-conversiei relativ lente a acestor stări.

Pentru a evalua populațiile de joncțiune, trebuie să identificăm o metrică care să distingă cu precizie între cele trei conformații primare de joncțiune. Experimental, studiile FRET utilizează în mod obișnuit distanța dintre capetele brațelor de selecție (care definește unghiul inter-duplex) pentru a distinge stările conformaționale. Inițial, am examinat unghiul inter-duplex, dar am constatat (după cum se discută mai târziu) că IDA fluctuează substanțial în fiecare izoformă, ceea ce face dificilă distingerea fără ambiguitate a conformațiilor. În schimb, am constatat că separările inter-baze din apropierea inimii joncțiunii oferă un indicator mai fiabil al conformației joncțiunii. Aceste distanțe ar trebui, de asemenea, să fie accesibile experimental folosind o pereche de analogi de baze nucleotide fluorescente, cum ar fi 6-metil izoxanthopterina (6-MI) sau 2-aminopurina, plasate în mod judicios aproape de centrul joncțiunii. Panourile inferioare din Fig. 1 prezintă cele opt baze din centrul joncțiunii în conformațiile izo-I și izo-II, precum și forma deschisă. În conformația izo-I, separarea dTT a bazelor T (pe catenele X și H) și separarea dCC a bazelor C (tot pe catenele X și H) sunt mult mai mici decât separările dAG ale bazelor A și G (pe catenele B și R); în conformația izo-II, suprapunerea inversă duce la un comportament opus al distanțelor relative. În forma deschisă, toate aceste distanțe sunt similare, dar mai mari decât distanțele conformerilor iso-I și II suprapuse.

Prin urmare, ar trebui să putem distinge între izo-I și II pur și simplu pe baza acestor separări între baze. Pentru a confirma acest lucru, în Fig. 5 am trasat distribuția de frecvență normalizată a distanțelor inter-bază P(dTT ∪ dCC) și P(dAG), care demonstrează prezența a două vârfuri distincte pentru toate concentrațiile ≥50 mM. Pentru P(dAG) (Fig. 5a), vârful la o separare mică indică stările de conformație izo-II, iar vârful la o separare mai mare se datorează fie conformațiilor izo-I, fie conformațiilor deschise. Pentru P(dTT ∪ dCC) (Fig. 5b), vârful la distanțe mici indică stările izo-I, iar vârful la distanțe mai mari se datorează fie conformațiilor izo-II, fie conformațiilor deschise. Adoptăm o limită de separare de 12 Å, locația aproximativă a minimului distribuțiilor, pentru a distinge joncțiunile ca fiind fie conformația iso-I, fie iso-II suprapusă. Acele configurații care nu sunt identificate ca fiind nici iso-I, nici II sunt clasificate ca fiind conformații deschise. În concordanță cu așteptările conform cărora conformația deschisă domină la concentrații scăzute de sare, niciuna dintre distribuții nu are un vârf pentru o separare mică și astfel aproape toate configurațiile la concentrații scăzute de sare sunt identificate cu conformația deschisă.

Criteriu pentru distingerea conformațiilor de joncțiune.

Distribuția separării inter-baze la mijlocul joncțiunii pentru (a) bazele AG, unde o separare mică identifică conformația iso-II și (b) perechile TT sau CC, unde o separare mică identifică conformația iso-I. Vârful de distanță mai mare la o concentrație scăzută de sare se datorează conformațiilor deschise; la o concentrație mai mare de sare, acesta provine în principal de la forma complementară stivuită. Linia punctată verticală indică criteriul de tăiere pe care îl folosim pentru a identifica ulterior stările conformaționale ale configurațiilor individuale.

Utilizând aceste criterii pentru a distinge conformerii, identificăm configurațiile individuale cu unul dintre cei trei izomeri și arătăm serii de timp reprezentative ale conformațiilor de joncțiune pentru cinci simulări la = 300 mM în Fig. 6a. Figura 7a prezintă configurații reprezentative ale acestor conformeri. Datele seriilor de timp arată calitativ că conformația deschisă are o durată de viață extrem de scurtă și acționează ca o stare de tranziție între conformerii izo-I și izo-II cu durată de viață lungă. Acest lucru a fost dedus anterior din experimentele cu o singură moleculă8,15,16,50 , iar în acest studiu, observăm în mod explicit și confirmăm mecanismul de tranziție între stările de echilibru ale conformerilor. Demonstrăm cantitativ rolul conformației deschise ca intermediar prin evaluarea celor nouă probabilități de tranziție (inclusiv tranzițiile către aceeași conformație) între cei trei conformi. Figura 6b arată că probabilitățile de tranziție pentru Iso I→II și II→I sunt extrem de mici la scara acestor diagrame (zero, în limita incertitudinii calculului nostru). În consecință, singura cale între conformerii stivuiți este prin conformerul deschis, stabilindu-l ca stare de tranziție. Figura 6c arată modul în care probabilitățile de tranziție între conformațiile suprapuse și deschise variază în funcție de concentrația de sare, cu tranziții către starea deschisă care domină la concentrații scăzute de sare. Cele cinci serii temporale din figura 6a demonstrează, de asemenea, că media temporală a datelor variază de la un eșantion la altul. În mod clar, 2 μs este inadecvat pentru o eșantionare ergodică a abundențelor conformaționale și necesită abordarea noastră de a utiliza un ansamblu de simulări. Această abordare este posibilă pentru modelul cu granulație grosieră, dar depășește resursele de calcul actuale pentru un model pentru toți atomii. Această „ergodicitate ruptă” este similară cu constatarea experimentală conform căreia eșantionarea conformațională nu este ergodică la scări temporale mari26. Cu toate acestea, trebuie să fim atenți să subliniem faptul că ergodicitatea ruptă aici se datorează în întregime naturii stocastice a eșantionării conformaționale, în timp ce în experimentele din ref. 26, variațiile în legarea ionilor la joncțiunile individuale joacă, de asemenea, un rol.

Variații de la o moleculă la alta în eșantionarea conformațională și în probabilitățile de tranziție conformațională.

(a) Exemplu de serii de timp de conformații ale joncțiunilor pentru cinci dintre cei 100 de membri ai ansamblului la = 300 mM. Izoforma deschisă este de scurtă durată și acționează ca o stare de tranziție între iso-I și iso-II. (b) Matrice a probabilităților de tranziție de la o anumită stare inițială la starea finală la = 300 mM. Nu sunt prezentate probabilitățile de tranziție către aceeași stare (elementele diagonale), deoarece tendința de a rămâne în starea curentă domină scala celorlalte probabilități de tranziție49. Rețineți că probabilitățile de tranziție pentru iso I→II (și viceversa) sunt aproape zero. (c) Dependența concentrației de sare a celor patru probabilități de tranziție cheie.

Conformații de joncțiune, abundență și structură.

(a) Conformații reprezentative observate în simulările noastre; pentru simplificare, este prezentată doar coloana vertebrală a ADN-ului. (b) Abundența relativă a izoformelor primare în funcție de concentrația de sare. Identitățile izoformelor sunt definite de separările bazelor la interiorul joncțiunii, așa cum este descris în text. (c) Unghiul inter-duplex (IDA) pentru fiecare conformație. Rețineți că conformația plană deschisă este predominantă doar la sare scăzută. La sare mai mare, fracțiunea mică de conformații deschise eșantionate adoptă (în medie) o conformație tetraedrică.

Pe baza datelor din seriile de timp pentru conformația joncțiunii, evaluăm direct fracțiunea de configurații în conformații deschise, iso-I sau iso-II în funcție de concentrația de sare (Fig. 7b). Așa cum ne așteptăm, pentru concentrații scăzute de sare (= 10 mM), observăm în esență doar starea plană deschisă cu geometrie pătrată. La toate concentrațiile mai mari de sare, sunt preferate conformațiile suprapuse, cu o medie de ≈58% în iso-II și 36% în iso-I (pentru ≥200 mM). Simulările noastre prevăd că, cu excepția concentrațiilor de sare destul de scăzute, fracția relativă de conformeri nu depinde în mod semnificativ de sare. Dominanța conformațiilor suprapuse la concentrații mari de sare poate fi așteptată din cauza ecranării puternice a interacțiunilor electrostatice, similar cu dependența concentrației de sare a temperaturii de topire. Cu toate acestea, această ecranare nu explică tendința spre conformația iso-II stivuită. Diferența în populația de izomeri trebuie să apară din cauza efectelor secvenței de baze din apropierea nucleului de joncțiune, așa cum s-a observat experimental16,17. Faptul că modelul reproduce tendința cunoscută din punct de vedere experimental către iso-II indică gradul de succes al modelului cu granulație grosieră în captarea structurii dependente de secvență. De asemenea, găsim o fracțiune mică, 6%, de configurații de joncțiune în stare deschisă la sare mare. După cum s-a discutat mai sus, aceste conformații sunt de scurtă durată și facilitează transformările între conformațiile suprapuse. În comparație cu experimentele lui Ha și ale colaboratorilor15 la concentrații relativ ridicate de sare, modelul 3SPN.2 subestimează cu aproximativ 15% tendința spre iso-II. Diferența se poate datora în parte diferenței dintre criteriile experimentale și cele de calcul utilizate pentru definirea izoformelor; în mod specific, noi examinăm separările bazelor la interiorul joncțiunii, în timp ce experimentele FRET utilizează etichete care sunt sensibile la separarea capetelor brațelor R și X ale joncțiunii (efectiv IDA). Pentru conformațiile de tip H cu un centru de joncțiune deschis (observate experimental în prezența endonucleazelor12), aceste abordări alternative ar diferi sistematic în clasificarea lor: (i) pe baza capetelor de joncțiune, conformațiile H ar fi clasificate ca izo-I sau II; (ii) invers, pe baza separării la centrul joncțiunii, conformațiile H ar fi clasificate ca deschise, astfel încât criteriile noastre vor da întotdeauna o fracție stivuită mai mică.

Din moment ce criteriile noastre ne permit să clasificăm conformațiile configurațiilor individuale de joncțiune, putem, de asemenea, evalua direct structura medie a fiecăreia dintre aceste conformații. Caracterizăm structura joncțiunii prin unghiul inter-duplex (IDA), pe care îl definim prin unghiul format de brațele XR și RH cu vertexul joncțiunii51. În consecință, IDA pentru izo-II ar trebui să fie substanțial mai mic decât cel al izo-I. Figura 7c confirmă această așteptare, cu IDA al izo-II apropiindu-se de 90° la o concentrație mare de sare și IDA al izo-I aproape de 140°. O valoare de 90° pentru izo-II este mare în comparație cu estimările experimentale, care sunt de ordinul a 40-60° pe baza măsurătorilor FRET de echilibru41,44,45, un aspect asupra căruia vom reveni. Ar trebui, de asemenea, să fie clar că 90° pentru izo-II nu implică o configurație plană, ceea ce este evident din punct de vedere vizual în configurațiile reprezentative prezentate în Fig. 7a; datorită structurii tridimensionale, chiar și o structură stivuită poate adopta un unghi apropiat de 90°. La cele mai mici concentrații de sare, nu putem estima unghiul pentru conformațiile suprapuse, deoarece acestea nu sunt, în esență, eșantionate. La = 10 mM, constatăm că IDA al joncțiunii deschise este de 95°, în concordanță cu o joncțiune aproape plană, ceea ce este, de asemenea, vizibil în Fig. 7a. La concentrații mai mari de sare, fracțiunea mică de configurații deschise adoptă un unghi ceva mai mare de ≈105°. Acest unghi mai mare este în concordanță cu o configurație aproape tetraedrică (Fig. 7a), care ar trebui poate să fie considerată distinctă de configurația deschisă plană la concentrații scăzute de sare. Astfel, rezultatele noastre sugerează că stările de tranziție între conformațiile stivuite sunt predominant conformații tetraedrice deschise, mai degrabă decât planare. Astfel de intermediari de tip tetraedric au fost observați anterior în simulări23. Într-adevăr, posibilitatea existenței unei multitudini de conformații de joncțiune a fost dedusă din analiza datelor cu o singură moleculă26.

Comparații ale structurii de joncțiune

Ca un ultim punct de comparație, analizăm modul în care IDA evaluată din modelul 3SPN.2 se compară cu măsurătorile experimentale și cu cea estimată din simularea noastră AMBER cu un singur atom. Măsurătorile FRET au estimat că IDA a izo-II este de 43 ± 8° la T = 283 K și concentrația de sare = 200 mM45. În consecință, simulăm atât modelul AMBER, cât și modelul 3SPN.2 în condiții corespunzătoare, pornind de la o configurație inițială a izo-II cu o IDA de 43° (a se vedea Fig. 1b). Atât pentru modelul 3SPN.2, cât și pentru modelul AMBER, joncțiunea se deschide la o IDA mai mare și se stabilizează la o valoare constantă după ≈50 ns (inset Fig. 8). Panoul principal din Fig. 8 prezintă valorile IDA eșantionate de fiecare model în starea de echilibru. Modelul 3SPN.2 prezintă fluctuații mai ample ale IDA decât modelul AMBER, deși IDA medie este similară în cele două modele. Din punct de vedere cantitativ, pentru AMBER, IDA medie este de 85,3° cu o deviație standard de 12,3°; pentru 3SPN.2, media IDA este de 95,7° cu o abatere standard de 24,1°.

Comparația structurii de joncțiune între modelele all-atom și modelele cu granulație grosieră.

IDA pentru modelul AMBER all-atom (negru) și 3SPN.2 model cu granulație grosieră (roșu) la T= 283 K și = 200 mM. Panoul principal prezintă distribuția valorilor IDA eșantionate; liniile continue reprezintă frecvența calculată, iar liniile punctate reprezintă o distribuție normală cu aceeași medie și deviație standard ca și datele. Inset-ul prezintă seriile temporale originale pentru fiecare model, din care sunt determinate distribuțiile. Rețineți că, pentru modelul 3SPN.2, avem 2 μs de date, care nu sunt prezentate în întregime în inserție.

Ambele simulări arată o IDA substanțial mai mare decât cea anticipată din măsurătorile FRET și din studiile cristalografice45,52. Acest lucru poate sugera că niciunul dintre modele nu oferă o estimare exactă a IDA sau că aproximările care trebuie făcute pentru a estima IDA din datele FRET subestimează IDA. Cu siguranță, în experimentele FRET în masă, prezența coloranților externi, a legăturilor asociate acestora și orientarea lor relativă pot introduce o eroare considerabilă în determinarea distanței. Diferențele dintre determinările actuale ale IDA și cele măsurate prin cristalografie ar putea apărea din cauza unor constrângeri ale rețelei cristaline. La compararea modelelor atotatomice și cu granulație grosieră, aproape dublarea abaterii standard arată în mod clar că brațele de joncțiune sunt mai flexibile în modelul cu granulație grosieră. Acest lucru se poate datora, în parte, absenței solventului explicit, deoarece apa solvabilă din reprezentarea all-atomică împiedică în mod necesar flexibilitatea brațelor de joncțiune.

.