Cromatografia lichidă rapidă a proteinelor (FPLC) și cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC): două metode de cromatografie lichidă în comparație directă. Acest articol discută diferențele dintre cele două tehnici, punând un accent deosebit pe cerințele analiților respectivi.

Numele de cromatografie lichidă rapidă a proteinelor (FPLC) și cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) oferă un indiciu asupra diferențelor dintre aceste metode cromatografice. În timp ce HPLC lucrează cu presiune înaltă pentru a analiza compușii chimici mici, FPLC purifică biomoleculele mari, cum ar fi proteinele sau ADN-ul. Cromatografia biomoleculelor este foarte solicitantă și sensibilă, deoarece acestea nu suportă temperaturi ridicate, presiuni ridicate sau solvenții utilizați de obicei în HPLC. Din aceste motive, separarea biomoleculelor necesită o abordare alternativă la HPLC.

Diferiți termeni sunt utilizați în mod obișnuit pentru cromatografia lichidă rapidă a proteinelor, cum ar fi biocromatografie, bioseparare sau biopurificare. Această formă specială de cromatografie se aplică pentru purificarea biomoleculelor mari de mai mulți kilodaltoni (kDa), cum ar fi proteinele, nucleotidele sau peptidele (figura 1). Scopul utilizatorului de FPLC este de a obține un produs cât mai pur și nativ. Obiectivele HPLC clasice, pe de altă parte, sunt de a identifica și califica analiții, de obicei compuși mici, cu dimensiuni de la câțiva atomi până la aproximativ 3000 Da.

Provocarea de a obține o proteină pură dintr-un extract celular

În mod obișnuit, biomoleculele sunt purificate din celule bacteriene sau eucariote, care sunt pline de proteine, ADN, ARN și membrane celulare. Prin urmare, purificarea proteinei de interes dintr-un extract celular poate fi foarte dificilă. Biochimiștii aplică mai multe trucuri: unul dintre ele constă în utilizarea proteinelor recombinante, care sunt supraexprimate de celule. Supraexprimarea proteinei de interes permite purificarea în cantități mai mari. Al doilea truc este de a adăuga o etichetă la proteina de interes, care este recunoscută în mod specific de rășină (materialul coloanei). Proteinele fără marker nu se vor lega de coloană și vor fi eluate imediat, în timp ce proteina dorită este îmbogățită și poate fi separată cu ușurință.

Biomoleculele sunt purificate din lizate celulare, ceea ce înseamnă volume de probă mult mai mari decât în HPLC analitic. Prin urmare, pentru injectarea probei se folosesc bucle de eșantionare mai mari sau chiar pompe cu debite mai mari. În plus, materialele coloanelor FPLC și HPLC diferă complet. Pentru HPLC, se aplică bile de silice cu dimensiuni foarte mici ale particulelor și cu o rezistență mare la presiuni ridicate, în timp ce FPLC necesită agarose sau material polimeric cu dimensiuni mai mari ale particulelor pentru majoritatea metodelor. Rășinile utilizate pentru FPLC nu sunt la fel de stabile la presiune ca bilele de silice și sunt foarte sensibile la bulele de aer. În plus, diferă nu numai materialul coloanei, ci și hardware-ul coloanei. În HPLC clasică, se utilizează coloane din oțel inoxidabil rezistente la presiune. După cum s-a menționat deja, stabilitatea la presiune nu este importantă pentru FPLC și, prin urmare, este posibil să se lucreze cu coloane din sticlă transparentă și biocompatibilă. Acesta este un mare avantaj, deoarece utilizatorul poate verifica dacă există bule de aer în coloană sau poate monitoriza starea materialului în timpul unei serii de purificare.

Diverse biomolecule, diverse metode de purificare

Diferențele în ceea ce privește materialul coloanei se reflectă și în metode. În HPLC analitică, cromatografia cu fază inversă cu faze staționare hidrofobe și faze mobile polare este metoda de alegere, în timp ce în FPLC se aplică o varietate mai mare de metode (figura 2). Una dintre metodele FPLC este cromatografia de excludere a dimensiunii (SEC), în care moleculele sunt separate în funcție de dimensiunea lor. Moleculele mai mici pot difuza în porii perlelor, în timp ce moleculele mai mari trec prin coloană aproape fără a fi reținute. Moleculele mai mici se eluează mai târziu din coloană, generând un gradient al acestor molecule în funcție de mărimea lor. O altă abordare de separare este cromatografia cu schimb de ioni. Biomoleculele sunt separate și purificate în funcție de sarcina lor specifică, care depinde de pH-ul tamponului. Cu cât proteina este mai încărcată, cu atât se va lega mai bine de rășina cu sarcină opusă. Pentru a elua proteina de pe coloană, concentrația de ioni de sare este crescută în timpul ciclului. Ionii de sare concurează cu proteina pentru a se lega de rășină. O altă metodă FPLC importantă este cromatografia de afinitate, în care molecula de interes se poate lega în mod specific de coloană, în timp ce celelalte molecule nu se pot lega și vor fi eluate fără a se lega. Aici se folosesc coloane cu medii speciale care recunosc biomolecula dorită. O formă specială de cromatografie de afinitate este cromatografia de afinitate cu ioni metalici imobilizați (IMAC). Proteina de interes trebuie modificată genetic prin adăugarea unei etichete la proteină, care constă, de obicei, din șase histidine. Rășina IMAC recunoaște în mod specific acest „Hisâtag”. Eluția are loc prin creșterea concentrației de imidazol care concurează cu proteinele His-tagged. În plus, proteinele pot fi separate, de asemenea, în funcție de hidrofobicitatea lor specifică, utilizând metoda de separare prin interacțiune hidrofobă. Rășina este compusă în așa fel încât proteinele cele mai hidrofobe se vor lega cel mai puternic de coloană și sunt eluate prin diminuarea gradientului de sare.

Pentru a purifica o proteină dorită, se folosește de obicei o combinație de metode. În prima etapă, așa-numita etapă de „captare”, proteina este purificată din extractul brut. În mod obișnuit, pentru această primă etapă de purificare se utilizează cromatografia de afinitate. În cea de-a doua etapă, etapa „intermediară”, se elimină contaminarea suplimentară prin cromatografie de schimb de ioni sau interacțiune hidrofobă. Scopul etapei finale de „lustruire” – de obicei o etapă de cromatografie de excludere a dimensiunilor – este de a scăpa de toate impuritățile rămase pentru a obține un produs de înaltă puritate. Această strategie de purificare a proteinelor depinde în totalitate de biomolecula specifică. În unele cazuri, o purificare în două etape poate fi suficientă. Cu cât se combină mai multe metode, cu atât mai mult din proteina de interes se pierde în timpul purificării, dar se poate obține o puritate mai mare.

După purificare, proba obținută poate fi analizată în ceea ce privește puritatea, concentrația și funcția sau activitatea enzimatică folosind HPLC, electroforeza pe gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE), testele de activitate enzimatică sau spectrometria de masă.

Cerințele FPLC

Proteinele sunt compuse din aminoacizi aliniați ca un lanț. Acest lanț este pliat într-o structură tridimensională, care este cheia pentru funcția și activitatea fiecărei proteine. Prin urmare, este foarte important să se mențină această structură proteică în timpul procesului de purificare. Factorii externi, cum ar fi temperatura ridicată, presiunea ridicată, pH-ul extrem sau solvenții, pot perturba structura proteică și, prin urmare, sunt evitați în FPLC. Temperatura de lucru pentru proteine este, de obicei, de 4 °C. Acesta este motivul pentru care un aparat FPLC este adesea plasat în interiorul unei camere reci sau al unei camere reci, unde este expus nu numai la temperaturi scăzute, ci și la umiditate de condensare. Componentele unui sistem FPLC trebuie să fie proiectate special pentru aceste condiții. În plus, componentele FPLC se confruntă cu o provocare suplimentară, și anume soluțiile tampon saline care sunt utilizate ca eluenți. De obicei, se aleg un pH izosmotic și concentrații de sare similare mediului celular. Sistemele de cromatografie sunt, în general, fabricate din oțel inoxidabil. Pe de o parte, sarea din tampoane poate duce la coroziune și, pe de altă parte, ionii metalici din oțelul inoxidabil pot interfera cu proteina și îi pot perturba structura. Prin urmare, este important să se evite oțelul inoxidabil și să se utilizeze materiale biocompatibile, cum ar fi ceramica din polieter eter cetonă (PEEK) sau titanul, atunci când se efectuează FPLC. Ca și sistemele HPLC, sistemele FPLC sunt, de asemenea, controlate prin software. Există diferențe considerabile între software-ul FPLC și HPLC. Acesta din urmă este utilizat în principal pentru a analiza probele și conține o mulțime de instrumente analitice. În FPLC, însă, nu sunt necesare multe instrumente analitice și este obișnuit să se genereze metode bazate pe volum sau chiar pe volumul coloanei (figura 3). Pentru majoritatea aplicațiilor FPLC, sunt preferate metodele bazate pe volumul coloanei, ceea ce facilitează extinderea. Software-ul FPLC este, în cea mai mare parte, foarte intuitiv și ușor de utilizat și include controlul direct, care permite ajustarea parametrilor în timpul unei rulări. Astfel, utilizatorul poate reacționa la diferite situații foarte spontan.

Este, prin urmare, clar că există diferențe majore între aceste două domenii cromatografice (tabelul 1). Metodele, hardware-ul și software-ul diferă foarte mult în funcție de faptul că molecula este analizată sau purificată. În cazul aplicațiilor FPLC, natura sensibilă a probelor și ambiția de a le păstra cât mai native posibil se adaugă la provocare. În general, ambele tehnici sunt domenii extrem de interesante pe care toți cei care lucrează în domeniu ar trebui să le cunoască.

Stephanie Runde a absolvit Universitatea Tehnică din München, Germania, cu o diplomă în biochimie. Și-a obținut doctoratul la Freie Universität Berlin, Germania, iar în prezent lucrează la Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH ca manager de produs pentru FPLC.

.