Abstract

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) este utilizat pe scară largă în medicina populară. Glicirrizina, un compus activ din G. glabra, posedă activitate antiinflamatoare. Acest studiu investighează extractul de metanol de G. glabra și glicirrizina pentru tratamentul neovascularizării corneei (CNV). G. glabra a fost extrasă în 70% metanol apos. Testele fitochimice, cromatografia în strat subțire (TLC) și cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) au fost utilizate pentru analiza compoziției chimice. Soluția topică de extract de metanol de G. glabra (2% p/v) și glicirrizină (1% p/v) a fost preparată în soluție salină normală. După arderea corneei (1 N NaOH), animalele au fost lăsate netratate timp de o săptămână, astfel încât să apară neovascularizația în toate grupurile. Tratamentele au început în ziua 7 și au continuat pentru următoarele 21 de zile consecutive. Animalele au fost tratate cu 3 picături de diferite soluții topice de trei ori pe zi. Analiza fotografiilor digitale și studiile histologice au fost utilizate pentru evaluarea CNV. Analiza fitochimică a extractului de metanol din G. glabra a evidențiat prezența saponinelor, fenolilor, carbohidraților, flavonoidelor și proteinelor. TLC și HPLC au confirmat prezența glicirrizinei. Analiza fotografică a extractului și a grupului tratat cu glicirrizină a arătat o scădere considerabilă a CNV. Studiul histologic al grupurilor tratate cu G. glabra și glicirrizină a arătat absența vaselor de sânge cu fibre de colagen dispuse corespunzător. Acest studiu a arătat că G. glabra și glicirrizina pot fi utilizate pentru tratamentul CNV. Izolarea ghidată de bioteste poate duce la prepararea de soluții oftalmice pentru tratamentul CNV.

1. Introducere

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) este originară din regiunea mediteraneană, din centrul Rusiei și din sudul Asiei, iar în prezent este cultivată pe scară largă în întreaga Europă și în Orientul Mijlociu. Lemnul dulce are o valoare nutritivă ridicată și a fost folosit în alimente încă din cele mai vechi timpuri. În alimente, este folosit în principal ca agent de îndulcire. De asemenea, are proprietăți de inhibare a senzației de sete . Uleiul de lemn dulce este aprobat de Food and Drug Administration (FDA) și are aplicații în diverse produse alimentare, cum ar fi băuturile, pasta de dinți, guma de mestecat și produsele cosmetice . G. glabra a fost utilizat pe scară largă în medicina populară pentru tratamentul diferitelor boli . Frunzele de G. glabra sunt utilizate pentru tratamentul rănilor rădăcinile pentru diabet, boala Graves și flatulență și tulpina pentru tratamentul tuberculozei . Este, de asemenea, folosit ca afrodiziac . Extractul de metanol din părțile aeriene de G. glabra a demonstrat o activitate antimicrobiană împotriva mai multor specii bacteriene . Extractul apos de metanol din G. glabra a inhibat proliferarea in vitro și in vivo a celulelor tumorale Ehrlich ascites și a prezentat o activitate antiangiogenică în testele in vivo, peritoneale și cu membrană corioalantoică . De asemenea, lemnul dulce a prezentat efecte antiagregante plachetare și a fost utilizat ca plantă medicinală pentru ameliorarea tusei din cele mai vechi timpuri . S-a constatat că rădăcinile de lemn dulce chinezesc inhibă creșterea Plasmodium falciparum și Leishmania donovani în studiile in vitro . Mai mult, s-a raportat că lemnul dulce are activități antibacteriene și antivirale .

G. glabra conține mai mulți constituenți chimici, cum ar fi saponina, flavonoidele, izoflavonoidele, stilbenoidele și cumarinele. Constituenții activi din saponine sunt glicirrizina, acidul liquiritic și glicirretolul. În cazul flavonoidelor, constituenții activi includ lichirtina, liquiritigenina și neoliquiritina. În cazul izoflavonoidelor, aceștia sunt glabridina, glabrona, glicarina și galbrena. În cumarine, constituenții activi sunt liqcoumarina și umbeliferona . În cele din urmă, în stilbenoizi, constituentul activ este dihidrostilbenele . Glicirrizina este o sare de potasiu și calciu a acidului glicirizinic. Este un glicozid saponinic care, prin hidroliză, produce acid glicirretinic . Glicirrizina, cunoscută și sub numele de acid glicirizic, este principalul constituent activ (10 până la 25%) al extractului de rădăcină de G. glabra . Glicirrizina ajută la inhibarea cancerului pulmonar și a sarcoamelor fibroase . În Japonia, a fost utilizată pentru tratamentul hepatitei C de peste 60 de ani . Mai mult, glicirrizina a prezentat proprietăți proapoptotice într-un model hepatocitar de leziuni hepatice colestatice. S-a constatat că acidul glicirretinic este un inhibitor puternic al apoptozei și necrozei induse de acizii biliari . S-a constatat că membrii flavonoidelor, cum ar fi isoliquiritigenina și licochalcona, posedă activități antioxidante, antitumorale, antiinflamatorii și antiangiogenice .

Corneea este un țesut transparent, avascular și exterior al ochiului. Transparența sa este necesară pentru claritatea vederii. În condiții normale, avascularitatea corneei este menținută de un echilibru între factorii angiogeni și antiangiogeni. Schimbarea acestui echilibru în favoarea factorilor angiogeni determină neovascularizarea corneei (CNV) . CNV este o afecțiune patologică în care transparența corneei se pierde din cauza creșterii de noi vase de sânge din regiunea limbusului ochiului. Dezvoltarea CNV duce la o reducere a transparenței corneei și, în consecință, cauzează deficiențe vizuale, de obicei pierderea vederii centrale sau poate duce chiar la orbire .

Deși cauza exactă a CNV nu este încă complet identificată, mai multe condiții patologice, cum ar fi inflamația, infecția, degenerarea și tulburările traumatice pot induce CNV. Utilizările lentilelor de contact induc, de asemenea, hipoxie, care poate duce în cele din urmă la CNV. Dintre acești factori, bolile infecțioase ale corneei sunt cea mai importantă cauză a CNV . În prezent, opțiunile de tratament pentru CNV includ medicamente precum medicamente antiinflamatoare nesteroidiene (AINS), steroizi și ciclosporină , terapii cu laser precum fotocoagularea termică cu laser cu argon , transplantul de membrană amniotică și transplantul limbal . Cu toate acestea, toate tratamentele disponibile au dezavantaje, cum ar fi costul ridicat, eficacitatea scăzută și efectele secundare severe.

Există o nevoie stringentă de a găsi un tratament nou și alternativ pentru CNV. În trecut, s-a observat că extractele și compușii cu activități antiinflamatorii și antiangiogenice au potențialul de a trata CNV. Pe baza informațiilor etnofarmacologice și a altor informații științifice despre activitățile antiinflamatorii și antiangiogenice ale extractului de G. glabra și ale principalului său constituent chimic, glicirizina, studiul actual a fost realizat pentru a evalua potențialul acestora pentru tratamentul CNV. S-a constatat că extractul de G. glabra a stopat în mod eficient CNV, dar s-a constatat că glicirrizina a fost relativ mai puțin eficientă în stoparea dezvoltării CNV în modelul animal.

2. Materiale și metode

2.1. Material vegetal

Rădăcinile de G. glabra au fost achiziționate în iunie 2015 de la un magazin autentic de plante medicinale din Abbottabad, Pakistan. Identificarea specimenului (număr de voucher gg-09-R/15) a fost confirmată de Dr. Abdul Nazir, profesor asistent, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Pakistan, iar specimenul de plantă a fost depus la Departamentul de Farmacie, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Pakistan.

2.2. Substanțe chimice

Glicirrizina (puritate 75%) a fost achiziționată de la Sigma Aldrich, SUA. Ketamina HCl (Indus Pharma, Pakistan), xilazina HCl (FARVET, Peru), proparacaina HCl (Alcon Laboratories, Inc., SUA) și soluție salină normală (Otsuka Pakistan Ltd.) au fost achiziționate de la un magazin farmaceutic local.

2.3. Prelucrare și extracție

Materia vegetală uscată a fost măcinată și extrasă prin înmuiere a materialului pulverizat (745 g) în metanol apos 70% (3 L) la temperatura ambiantă. Amestecul a fost agitat ocazional cu o tijă din oțel inoxidabil timp de două săptămâni pentru a obține extractul maxim. Extractul a fost filtrat printr-o pânză de muselină, urmată de hârtie de filtru Whatman numărul 42 (125 mm). Extractul a fost concentrat cu ajutorul unui evaporator rotativ în vid (Yamato Rotary Evaporator, RE 801; Coreea de Sud) cu baia de apă setată la 40°C. Randamentul procentual final al extractului a fost de 12,2%.

2.4. Analiza fitochimică și amprentare

Extractul brut a fost supus unei analize fitochimice preliminare pentru toți constituenții chimici majori folosind teste chimice standard . Pentru alcaloizi, extractul (500 mg) a fost agitat cu 5 ml de HCl 1% și încălzit ușor timp de 1 min folosind o baie de apă. Apoi, s-a luat 1 ml din această soluție și s-a adăugat 0,5 ml de reactiv Wagner. Apariția turbidității sau a precipitatelor a indicat prezența alcaloizilor. Pentru steroizi, s-a folosit testul lui Salkwoski, în care s-au adăugat 2 ml de cloroform pentru a dizolva 100 mg de extract într-o eprubetă. Apoi, s-au adăugat cu grijă 2 ml de H2SO4 concentrat pentru a forma stratul inferior. Pe stratul superior s-a format o culoare verde care indică prezența steroizilor. Pentru saponine (testul de spumă), 3 mg de extract au fost dizolvate în 10 ml de apă distilată și au fost agitate energic într-o eprubetă și lăsate să stea timp de 1 minut. Formarea unei spume consistente indică prezența saponinelor. Pentru flavonoide (testul cu acetat de plumb), 1 ml de soluție de acetat de plumb (5%) a fost adăugat la 1 mg de extract de plantă într-un tub de testare. Amestecul a fost lăsat să stea nemișcat. Formarea precipitatelor de culoare galbenă a indicat prezența flavonoidelor. Pentru fenoli (testul cu clorură ferică), s-au luat 2 mg de extract într-o eprubetă și s-au adăugat 3 picături de clorură ferică 10%. Apariția unei culori negru-albăstrui a indicat prezența fenolilor. Pentru glicozide (testul nitroprusiatului), s-a adăugat extractul de metanol cu câteva picături de hidroxid de sodiu 10% și apoi s-a adăugat nitroprusiatul de sodiu la soluția de mai sus. Apariția unei culori albastre a indicat prezența glicozidelor în extract. Pentru zaharuri reducătoare, soluția lui Fehling (A și B) a fost adăugată la extractul apos de metanol (100 mg/mL) într-o eprubetă. Soluția rezultată a fost încălzită pe o baie de apă timp de 10 minute. Formarea unui precipitat roșu-portocaliu a fost o indicație pozitivă pentru prezența zaharurilor reducătoare. Pentru detectarea proteinelor, extractul de plantă a fost tratat cu câteva picături de acid azotic concentrat. Formarea unei culori galbene a indicat prezența proteinelor.

Cromatografia în strat subțire (TLC) a fost utilizată pentru identificarea diverșilor compuși, în special a principalului constituent chimic, glicirrizina. Extractul și glicirrizina au fost aplicate pe plăci TLC acoperite cu silicagel (60 F254) și dezvoltate în n-butanol, acid acetic și apă distilată (12 : 3 : 5) ca fază mobilă. Sulfatul de ceric a fost utilizat ca reactiv de pulverizare pentru vizualizarea compușilor pe plăcile TLC.

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) (Perkin Elmer, Series 200 Auto sampler) a fost utilizată pentru analiza extractului și a glicirrizinei. Următoarele condiții au fost aplicate în timpul amprentei HPLC: detector UV-Vis (200-700 nm), coloană (C18) (5 μm, 150 mm × 4,6 mm), fază mobilă care a fost acetonitril și apă în proporție de 10 : 90, volum de injecție care a fost de 20 μL, debit care a fost de 1 ml/min și s-a utilizat un filtru cu membrană de 0,45 μm. Compușii au fost detectați la o lungime de undă de 254 nm. Pentru G. glabra, 100 mg de extract au fost luate în 25 ml de metanol apos 70% într-un balon volumetric (50 ml) și au fost sonicate timp de 50 de minute la temperatura ambiantă. Soluția standard de glicirrizină a fost preparată prin dizolvarea a 5 mg de glicirrizină în metanol, iar volumul final a ajuns la 10 mL cu adaos suplimentar de metanol. Soluțiile stoc de extract de G. glabra și de glicirrizină au fost filtrate și degazate cu ultrasunete înainte de analiză.

2.5. Animale

Cei de ambele sexe (1,5-2 kg) au fost utilizați ca model animal în studiul actual. Aceștia au fost achiziționați de pe piața locală din orașul Abbottabad. Protocolul experimental a fost aprobat în conformitate cu reglementările Comitetului de etică pentru animale al CIIT Abbottabad, cu numărul de aprobare PHM.Eth/SP.14-714-CIIT-ATD la 11 iulie 2015, care respectă toate recomandările din Ghidul de etică animală al NIH (1986). Iepurii au fost separați în mod aleatoriu în patru grupuri, cu un minim de cinci animale pe grup. După aceea, fiecare iepure a fost în continuare etichetat la ureche în cadrul grupurilor pentru a garanta separarea lor pe parcursul întregii proceduri experimentale. Animalele au fost plasate în condiții standard și au avut acces liber la hrană și apă.

2.6. Inducerea arsurii corneei în ochiul iepurelui

Pentru inducerea CNV, ochii drepți ai tuturor animalelor experimentale au fost deteriorați prin arsură alcalină (soluție de hidroxid de sodiu 1 N) folosind protocolul raportat . Pe scurt, animalele experimentale au fost înfometate timp de 12 h înainte de începerea experimentului. Animalele au fost anesteziate cu ajutorul unei injecții intramusculare de ketamină HCl (50 mg/kg) și xilazină (5 mg/kg) în combinație. După aceea, ochiul drept al iepurelui a fost deschis cu un speculum de sârmă, astfel încât arsura alcalină să poată fi indusă în mod corespunzător. Cu aproximativ 2 minute înainte de arsură, s-au instilat câteva picături de proparacaină HCl în ochiul drept al fiecărui iepure pentru a minimiza iritarea corneei. S-a folosit un perforator de hârtie pentru a produce un disc de 7 mm din hârtie de filtru Whatman. Discurile de hârtie de filtru au fost ușor scufundate în soluție de hidroxid de sodiu 1 N timp de aproximativ 90 s și, ulterior, au fost plasate central pe cornee timp de 2 minute pentru a induce arsuri grave. Ochii au fost spălați cu soluție salină normală pentru umezire și pentru a obține sterilitate. După arderea corneei, iepurii au fost ținuți timp de o săptămână pentru dezvoltarea CNV fără alte tratamente.

2.7. Prepararea picăturilor oculare și protocoale de tratament

Soluția topică de extract de G. glabra (2% p/v) a fost preparată în soluție salină normală folosind 10% dimetilsulfoxid (DMSO) și câteva picături de Tween-80 și amestecată cu ajutorul mixerului vortex. În mod similar, soluția de glicirrizină (1% p/v) a fost preparată în soluție salină normală. Pentru prepararea vehiculului, s-a amestecat dimetilsulfoxid (DMSO) (10% v/v) și câteva picături de Tween-80 în soluție salină normală. Dexametazona (0,1%) (ALCON-COUVREUR, Belgia) a fost obținută de pe piața locală și utilizată ca martor pozitiv. Toate soluțiile topice au fost ambalate în picături speciale achiziționate de pe piața locală și depozitate la 4°C. Tratamentele au fost începute în a 7-a zi de la apariția arsurilor corneene și au continuat pentru următoarele 21 de zile consecutive. Ochii diferitelor grupuri de animale au fost tratați topic cu 3 picături din diferite soluții de trei ori pe zi. Primul grup a primit tratament cu extract de G. glabra, în timp ce al doilea grup a fost tratat cu glicirrizină. Al treilea grup a primit vehiculul, iar al patrulea grup tratat cu dexametazonă (0,1%) a fost considerat drept control pozitiv.

2.8. Analiza microscopică și fotografică

Progresia CNV în toate grupurile a fost monitorizată periodic cu ajutorul unui microscop cu lampă cu fantă (Olympus-CX21) cu o sursă de lumină artificială atașată manual. Fotografiile au fost realizate cu ajutorul unei camere foto digitale (DSC-W70, Sony, Japonia) cu mărire ×12, obiectiv de 85 mm, zoom de 100% și distanță de fotografiere de 29 cm. Fotografiile au fost realizate în zilele 1, 7, 14, 21 și 28 și au fost stocate în calculator pentru utilizare ulterioară.

2.9. Studii histologice ale țesuturilor corneenei

În ultima zi a experimentului, animalele au fost sacrificate prin dislocare cervicală. Ochii întregi au fost extrași și conservați în 10% formalină neutră. După conservare, eșantioanele de țesut cornean au fost îndepărtate din întregul ochi cu ajutorul unor lame chirurgicale. Țesuturile au fost apoi transferate în borcane perforate (capsule) cu ajutorul unor pensete. Aceste țesuturi au fost scufundate în formol (15%) și apoi în soluție salină de formaldehidă alcoolică (15%) timp de 3 h fiecare. Țesuturile au fost apoi deshidratate folosind grade crescânde de alcool (etanol). În timpul acestui proces, țesuturile au fost tratate cu alcool de 70% și 80% timp de 2 ore fiecare și, în final, cu alcool de 100% timp de 6 ore. În etapa următoare, probele au fost curățate în xilen pur timp de 6 ore (3 schimbări la fiecare 2 ore în borcane diferite). Țesuturile au fost apoi încorporate în ceară de parafină cu ajutorul unei cabine calde automate cu un interval de temperatură de 58 ± 5°C. Țesuturile au fost imersate în ceară de parafină timp de 4 ore (2 ore în 2 schimburi și în borcane diferite). După aceasta, au fost obținute secțiuni de 4 μm de țesut cornean cu ajutorul unui microtometru rotativ (Thermo Fisher Scientific, Germania). Pentru o fixare adecvată, au fost plasate picături de albumină de ou pe lamele și s-a montat o singură secțiune de țesut pe aceasta. Apoi, lamelele au fost plasate timp de 2 h într-un incubator de convingere mecanică de precizie (încălzitor de lamele) (Model 4EM Cat. nr. 31574). S-a efectuat colorarea histologică cu hematoxilină & eozină (H&E) prin diferite etape, inclusiv deparafinare, hidratare, colorare cu hematoxilină, decolorare (colorare cu eozină) și deshidratare.

3. Rezultate

3.1. Analiza fitochimică a extractului de G. glabra

Analiza fitochimică a extractului de G. glabra a fost efectuată pentru a afla prezența principalelor clase de constituenți fitochimici. Rezultatele au evidențiat prezența flavonoidelor, carbohidraților, proteinelor, saponinelor și fenolilor, așa cum se arată în tabelul 1. Prezența alcaloizilor, a fitosterolului și a glicozidelor nu a fost confirmată în investigația actuală (tabelul 1).

Rezultatele obținute în urma testelor chimice au fost confirmate ulterior prin analiza TLC. Extractul a fost standardizat cu referire la principalul său constituent chimic, glicirrizina. Rezultatele au fost prezentate în figura 1. Valorile factorului de retenție (Rf) ale constituenților din extract au fost comparate cu glicirrizina. După cum se arată în figura 1, valoarea Rf pentru pata vizibilă A din extractul de G. glabra a fost de 0,43, în timp ce pentru B a fost de 0,15. Valoarea Rf pentru glicirrizină (pata vizibilă C) s-a dovedit a fi, de asemenea, de 0,15. Pe baza acestor rezultate, se poate confirma faptul că glicirrizina a fost prezentă în extract ca unul dintre compușii majori.

Figura 1

Profilul TLC pentru analiza extractului de G. glabra și a glicirrizinei folosind plăci TLC acoperite cu gel de silice și n-butanol : acid acetic : apă (12 : 3 : 5) ca fază mobilă.

Analiza HPLC a extractului brut derivat din G. glabra și a glicirrizinei a fost efectuată pentru a obține vârfurile majore pentru diverși constituenți chimici din extracte și pentru a confirma prezența compusului principal (glicirrizina). Cromatograma rezultată a prezentat diverse vârfuri la timpi de retenție diferiți pentru extractul de G. glabra, după cum se arată în figura 2(b). Cromatograma a arătat, de asemenea, un vârf la un timp de retenție de 40 de minute pentru glicirrizină, așa cum se arată în figura 2(a). Similar glicirrizinei, s-a observat, de asemenea, un vârf în cromatogramă pentru extract la același timp de retenție (40 min), așa cum se arată în figura 2(a). Rezultatele au confirmat prezența glicirrizinei ca fiind componenta majoră în extractul de G. glabra.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figura 2

Cromatograma HPLC a (a) glicirrizinei și (b) G. glabra extract. Condițiile HPLC au fost lungimea de undă (254 nm), faza mobilă (acetonitril : apă), volumul de injecție (20 μL) și debitul (1 ml/min).

3.2. Analiza CNV a grupurilor tratate cu extract de G. glabra, glicirrizină, vehicul și control pozitiv

Pentru a observa eficacitatea tratamentului cu extract de G. glabra și glicirrizină, progresia CNV a fost monitorizată la microscop și prin analiză fotografică în diferite zile de tratament. Fotografiile realizate în diferite zile de tratament au fost prezentate în figura 3 pentru grupurile tratate cu extract și vehicul. S-a observat la microscop și se poate vedea, de asemenea, în fotografii că, chiar și în prima săptămână de tratament, grosimea neovesselului (NV) crește în grupul tratat cu extract. Cu toate acestea, s-a observat o scădere mai rapidă a grosimii vasului după a doua săptămână (figura 3) și a continuat până la finalul experimentului. Rezultatele obținute au arătat că extractul de G. glabra a dispărut aproape complet CNV în ziua 28 a experimentului, în comparație cu grupul de control cu vehicul (Figura 3). Grupul tratat cu dexametazonă (control pozitiv) (Figura 3) a prezentat, de asemenea, aceeași tendință ca și cea a grupului tratat cu extract de G. glabra. A reieșit, de asemenea, din observația microscopică, precum și din analiza fotografică, că glicirizina a prezentat, de asemenea, efecte pozitive în blocarea CNV. Atunci când ochii au fost analizați cu ajutorul unui microscop cu rezoluție de mare putere, s-a observat că există o estompare treptată a vaselor de sânge și o reluare a formei normale în ultima zi de tratament (figura 3), cu prezența doar a câtorva NV. Aceste rezultate au arătat că activitatea anti-CNV a glicirrizinei a fost ușor mai mică decât cea a extractului brut.

Figura 3

Fotografii reprezentative ale CNV la G. extract de glabra, glicirrizină, vehicul și grupul tratat cu dexametazonă (control pozitiv) în zilele 0, 7, 14, 21 și 28. Există o scădere treptată a diametrului și grosimii NV, iar în ultima zi a experimentului aproape că a dispărut. Grupul tratat cu glicirrizină a prezentat, de asemenea, o scădere a diametrului și a grosimii NV, dar activitatea a fost mai mică decât cea a extractului de G. glabra.

3.3. Analiza histologică a corneei tratate cu G. glabra și glicirrizină în comparație cu vehiculul și grupul de control pozitiv

Analiza histologică a fost efectuată pentru a cunoaște prezența inflamației, recuperarea fibrelor corneene și existența vaselor de sânge. Microfotografiile reprezentative colorate cu H&E au fost prezentate în figura 4. Histologia ochiului stâng al fiecărui animal a fost considerată ca fiind un țesut de referință, deoarece nu au fost induse arsuri alcaline și au fost păstrate în condiții normale. În corneea de referință, nu a existat nicio creștere epitelială și NV, precum și nicio modificare a morfologiei, după cum se arată în figura 4. În grupul de control cu vehicul (figura 4), au existat vase de sânge extinse și întreruperi extinse ale colagenului, ceea ce a arătat dezvoltarea CNV. Pe de altă parte, histologia corneei tratate cu extracte de G. glabra a arătat că regiunea corneei și-a revenit aproape la normal, cu vasele de sânge aproape diminuate și colagenul în formă normală. Analiza histologică a grupului tratat cu glicirrizină (figura 4) a arătat că, deși regiunea corneei și-a revenit în mare parte la forma normală, există unele indicii că leziunile sunt încă prezente. Au existat unele semne pentru hipertrofia epitelială și s-au observat, de asemenea, mai puține vase de sânge. Aceste rezultate au arătat că glicirrizina este eficientă în inhibarea CNV, dar într-o măsură mai mică decât extractul de G. glabra. În comparație, microfotografia lamelelor colorate cu H&E a corneei tratate cu dexametazonă (figura 4) a arătat o reducere a creșterii epiteliale și a formării de vase de sânge în regiunea corneei, dar fibrele de colagen erau cumva într-o stare distrusă și dispuse la întâmplare.

Figura 4

Microfotografie histologică a corneei G. extractul de glabra și grupul tratat cu glicirrizină în comparație cu controlul vehiculului și controlul pozitiv.

4. Discuție

CNV este una dintre cauzele majore de orbire în întreaga lume. S-a estimat că aproximativ 4,14% din populația mondială este afectată de această boală . Principala cauză moleculară pentru CNV este dezechilibrul dintre factorii angiogeni și antiangiogeni. Printre acești factori, factorul de creștere endotelială vasculară (VEGF) promovează propagarea, trecerea și formarea de tuburi a celulelor endoteliale vasculare . Așadar, există posibilitatea de a trata CNV cu agenți anti-VEGF; cu toate acestea, nu poate fi tratată complet doar cu terapia anti-VEGF, deoarece există, de asemenea, unii regulatori suplimentari ai angiogenezei . În plus, inflamația și angiogeneza sunt procese interdependente și, prin urmare, tratamentul anti-VEGF poate să nu aibă succes . În trecut, s-a observat că extractele și compușii cu activitate antitumorală și antiinflamatorie sunt utile în inhibarea NV și CNV . Extractul brut de G. glabra a demonstrat un efect antiinflamator, în timp ce extractul apos de G. glabra a inhibat angiogeneza în testele in vivo . Prin urmare, s-a emis ipoteza că extractul de G. glabra și principalul său constituent chimic, glicirrizina, ar putea avea capacitatea de a controla CNV și astfel a fost întreprins studiul actual.

Este important să se cunoască compoziția chimică a oricărui extract înainte de a-l evalua pentru activități biologice. Prin urmare, a fost efectuată analiza fitochimică a extractului de G. glabra, care a arătat că acesta conține constituenți chimici importanți, cum ar fi flavonoide, carbohidrați, proteine, saponine și fenoli. Studiile anterioare au raportat prezența saponinei, flavonoidelor, alcaloizilor, terpenoidelor, taninurilor și glicozidelor, dar nu au fost detectați carbohidrați, proteine, flobatani, compuși fenolici și antrachinone . Un alt studiu a arătat prezența carbohidraților, a compușilor fenolici și a proteinelor împreună cu alți constituenți în extractul de G. glabra . Motivele pentru aceste diferențe pot fi anotimpul și vârsta plantelor colectate.

TLC și HPLC au confirmat prezența glicirrizinei în extractul brut. Cromatogramele TLC și HPLC ale extractului au evidențiat un compus la valoarea Rf (0,15) și timpul de retenție (aproximativ 40 min) ca cel al glicirrizinei standard. Aceste rezultate reprezintă o mică abatere de la observațiile anterioare, în care glicirrizina standard a fost reperată la 0,22 . Motivul principal ar putea fi utilizarea unor reactivi și condiții diferite în studiul anterior și în cel prezent. În studiul anterior, cloroformul, metanolul și apa au fost folosite ca fază mobilă și acidul anisaldehidic-sulfuric ca reactiv de pulverizare, în timp ce în studiul de față n-butanol, acid acetic și apă distilată au fost folosite ca fază mobilă și sulfat ceric ca reactiv de pulverizare.

Glicirrizina, unul dintre componentele majore ale G. glabra, a fost raportată ca având activități antiinflamatorii și anticancerigene . Rezultatele studiului actual au arătat că extractul de G. glabra a avut succes în inhibarea CNV, deoarece NV au fost aproape diminuate după 21 de zile de tratament (Figura 3). Fiind compusul principal, s-a considerat că inhibarea CNV s-ar putea datora glicirrizinei. Analiza anti-CNV a glicirrizinei a arătat unele efecte pozitive asupra inhibării CNV, dar nu a fost capabilă să diminueze complet vasele de sânge din regiunea corneei (figura 3). Glicirrizina este un glicozid triterpenoidic (saponină) cu acid glicirretinic. Anterior, s-a raportat că acidul glicirretinic are un efect direct asupra receptorilor mineralocorticoizi și produce efecte asemănătoare celor inflamatorii , ceea ce poate fi unul dintre motivele pentru efectele mai scăzute ale glicirrizinei. Acest studiu sugerează că, împreună cu glicirrizina, unii alți compuși pot fi responsabili pentru inhibarea CNV în extractul de G. glabra.

A fost, de asemenea, important să se studieze efectele extractului de G. glabra și ale glicirrizinei asupra anatomiei microscopice (microanatomie) a țesutului cornean. Prin urmare, s-a efectuat o analiză histologică, iar rezultatele acesteia au confirmat efectele anti-CNV ale extractului de G. glabra. Mai mult decât atât, nu a existat niciun semn clar de toxicitate, deoarece fibrele de colagen au fost aranjate într-o matrice în corneea animalelor tratate cu extract de G. glabra. Anatomia microscopică a corneei tratate cu extract de G. glabra a fost foarte asemănătoare cu cea a controlului normal. Pe de altă parte, nu au existat semne de vase de sânge în corneea tratată cu dexametazonă (control pozitiv), dar fibrele de colagen erau încă în dezordine, ceea ce a arătat că dexametazona poate avea unele efecte toxice asupra corneei. Deși, studiile anterioare au raportat, de asemenea, efecte toxice ale dexametazonei , sunt necesare cercetări suplimentare pentru a confirma acest fenomen la nivel microanatomic. De asemenea, este important de menționat că, deși glicirrizina a reușit în mare măsură să controleze CNV, nu a reușit să recupereze complet corneea deteriorată de alcalii și au fost observate și unele vase de sânge.

5. Concluzii

Se poate concluziona din rezultate că picăturile oftalmice din extractul brut de G. glabra au inhibat creșterea vaselor în regiunea corneei, ceea ce indică faptul că ar fi eficient în tratamentul CNV. Mai mult, compusul majoritar al G. glabra, glicirrizina, nu a fost în măsură să împiedice complet apariția CNV. Acest lucru înseamnă că, alături de glicirrizină, este posibil ca și un alt (alți) constituent(i) să fie responsabil(i) pentru activitatea anti-CNV a extractului. În acest scop, sunt necesare cercetări suplimentare privind izolarea ghidată de bioteste pentru identificarea componentei (componentelor) principale responsabile de inhibarea CNV. În plus, studiile moleculare vor fi, de asemenea, utile pentru a afla mecanismul molecular exact al extractului de G. glabra în tratamentul CNV.

Conflicte de interese

Autorii declară că nu există conflicte de interese.

Contribuțiile autorilor

Syed Luqman Shah și toți ceilalți autori au contribuit în mod egal la această lucrare. Lucrarea finală este aprobată de toți autorii.

Recunoștințe

Autorii doresc să îi mulțumească lui Christie Ronge, Departamentul de Farmacie, Froedtert & the Medical College of Wisconsin, 9200 West Wisconsin Avenue, Milwaukee, WI, pentru asistență în corecțiile lingvistice/gramaticale.

.