În ultimul deceniu, tehnicile chimiogenetice și optogenetice au revoluționat neuroștiința integrativă prin furnizarea de noi instrumente pentru a manipula în mod reversibil activitatea unor populații specifice sau a unor sisteme de neurotransmițători cu o mai mare selectivitate (Sternson și Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al., 2017). În comparație cu optogenetica, care permite o modulare neuronală rapidă și fazică cu o rezoluție temporală ridicată, chimiogenetica permite o modulare mai extinsă a sistemelor, ceea ce este deosebit de util pentru studiile axate pe fenomene tonice (de exemplu, investigarea implicării dopaminei în procesele motivaționale; Whissell et al., 2016). Printre instrumentele chimiogenetice, receptorii de design activați exclusiv de medicamente de design (DREADD) sunt utilizați pe scară largă și sunt numiți un sistem biologic de „blocare și închidere” pentru manipularea selectivă a activității celulare prin intermediul căilor de semnalizare a proteinelor G. Dezvoltați pentru prima dată în mod foarte elegant de către grupul lui Roth (Armbruster et al., 2007), acest receptor cuplat cu proteina G (GPCR) este un receptor muscarinic: lacătul, care a fost mutat pentru a răspunde numai la clozapină-N-oxid (CNO), cheia, un metabolit derivat al antipsihoticului atipic clozapină, altfel, potențial, fără activitate farmacologică.

Dar, începând din 2016, unele publicații au ridicat probleme îngrijorătoare în ceea ce privește utilizarea CNO. În primul rând, dozele relativ mari de CNO (10 mg/kg) administrate pe cale sistemică pot avea o activitate farmacologică în afara țintei, după cum reiese din inducerea de efecte comportamentale la șobolani și șoareci care nu sunt mediate de DREADD (MacLaren et al., 2016; Gomez et al., 2017; Baerentzen et al., 2019). În plus, Gomez et al. (2017) au arătat că CNO nu traversează cu ușurință bariera hemato-encefalică, poate prezenta o afinitate scăzută de legare la DREADD și a fost retro-metabolizat în clozapină, devenind adevăratul efector al DREADD. Pe baza acestor observații surprinzătoare, aceștia au sugerat utilizarea directă a unor doze mici de clozapină (0,1 mg/kg) pentru a activa DREADD-urile în locul CNO. Cu toate acestea, utilizarea unor doze mici de clozapină în locul unor doze mari de CNO care se transformă treptat în clozapină duce la două limitări majore. În primul rând, nu este evident că clozapina, în injecție acută sau difuzie prelungită, acționează asupra DREADDs în același mod (Mahler și Aston-Jones, 2018). În al doilea rând, deoarece clozapina este un agent antipsihotic atipic, are numeroase ținte endogene, cum ar fi receptorii serotoninergici, muscarinici sau dopaminergici, cu afinități relativ puternice (Meltzer, 1989; Schotte et al., 1993; Brunello et al., 1995; Ashby și Wang, 1996; Armbruster et al., 2007) și sunt susceptibile de a induce efecte în afara țintei, chiar și cu doze mici. Într-adevăr, s-a constatat că doza de 0,1 mg/kg de clozapină recomandată pentru experimentele DREADD crește semnificativ comportamentul legat de anxietate la șoareci (Manzaneque et al., 2002), precum și la șobolani (un efect pe care l-am observat și noi; R. Goutaudier și S. Carnicella, observații nepublicate), unde clozapina afectează, de asemenea, locomoția prin sedare potențială și afectează flexibilitatea cognitivă (Ilg et al., 2018).

Deși apariția acestor efecte poate depinde de specia, tulpina sau sexul utilizat și poate fi foarte discretă (deoarece nu toate dimensiunile comportamentale sunt afectate); acestea au potențialul de a interfera semnificativ cu performanța animalelor într-o varietate de sarcini comportamentale. Stresul ridicat și anxietatea pot fi factori de confuzie în studiile privind memoria sau durerea, de exemplu (Sousa et al., 2006; Sorge et al., 2014). În plus, comportamentul legat de droguri de abuz sau de tulburări psihiatrice, cum ar fi schizofrenia, anxietatea sau flexibilitatea cognitivă, poate modifica întregul fenotip (Floresco et al., 2009; Koob și Schulkin, 2018). Pe baza acestor observații, sunt necesare precauții importante cu clozapina pentru a evita studiile comportamentale părtinitoare.

Ar fi mai selectivă o nouă moleculă concepută special pentru DREADDs? Compusul 21 (C21) este un ligand sintetic DREADD, dezvoltat în 2015 (Chen și colab., 2015) și parțial caracterizat in vitro, precum și in vivo în 2018 (Thompson și colab., 2018). Încă o dată, la doze mici (<3 mg/kg), a fost descris ca fiind lipsit de efecte comportamentale în afara țintei și capabil să modifice comportamentul animalelor care exprimă DREADD. Acest studiu a fost întărit de Jendryka et al. (2019), care au efectuat experimente farmacocinetice și farmacodinamice folosind șoareci și C21 (3 mg/kg). Aceștia au arătat că, la 30 min după administrarea de C21, concentrația moleculei în LCR a fost de >10 ori mai mare decât EC50 estimată pentru activarea DREADD (LCR = 40 nm și EC50DREADDs = 3 nm), și fără retro-metabolizare în clozapină. Cu toate acestea, rezultatele unui studiu recent BioRxiv preprint la șobolani, șoareci și macaci (Bonaventura et al., 2018) sugerează că, deși C21 prezintă o penetranță cerebrală scăzută, o doză de 1 mg/kg poate modifica deja funcția cerebrală la șoarecii de tip sălbatic. În plus, s-a observat o afinitate și o ocupare slabă pentru DREADD-uri in vitro în felii de creier de șobolan, precum și in vivo la șoareci și macaci într-un studiu de tomografie cu emisie de pozitroni. Pe baza aceleiași investigații experimentale ca și în cazul C21, aceștia au propus, ca alternativă, alți doi liganzi, JHU37152 și JHU37160, care posedă o potență in vivo mai mare pentru DREADDs și potențial mai puține efecte în afara țintei (Bonaventura et al., 2018). Deși această nouă generație de liganzi DREADD pare promițătoare, din cauza noutății lor, aceștia sunt încă slab caracterizați și rămân omologi din punct de vedere structural cu clozapina și CNO. Prin urmare, o caracterizare exhaustivă în cadrul investigației celulare la nivel comportamental va fi crucială pentru a exclude potențialele capcane găsite pentru CNO.

O soluție alternativă pentru îmbunătățirea selectivității abordărilor chimiogenetice ar fi utilizarea unei alte combinații de blocare și cheie. Ca atare, receptorul κ-opioid-DREADD (KORD) este un GPCR inhibitor mutant derivat din receptorul κ-opioid uman (Vardy et al., 2015). În comparație cu DREADD-urile clasice care se leagă de clozapină, CNO, C21 sau compușii JHU, KORD este angajat de salvinorina B, un metabolit asemănător unui medicament al agonistului KOR-selectiv salvinorina A. Deși această abordare chimiogenetică a fost utilizată în mod elegant în combinație cu un DREADD activator pentru a crea un sistem „ON și OFF” în cadrul aceleiași populații neuronale (Vardy et al., 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), aceasta rămâne utilizată marginal, deoarece reduce doar activitatea neuronală pe o perioadă scurtă de timp (Aldrin-Kirk și Björklund, 2019). În plus, salvinorina B prezintă o anumită afinitate pentru KOR endogen la concentrații ridicate și nu a beneficiat încă de o caracterizare aprofundată, așa cum se realizează în prezent pentru compușii legați de DREADD (Roth, 2016). Înlocuirea GPCR cu un canal ionic mutant, un alt receptor proiectat alternativ, numit canale ionice portate de ligand (LGIC), este o opțiune dezvoltată de laboratorul Stenson (Magnus et al., 2011). Comparativ cu DREADD-urile, LGIC-urile combină domeniul de legare a ligandului al unui receptor nicotinic mutant cu domeniul porului ionic al unui alt receptor ales pentru a crea un canal ionic chimeric. Similar cu DREADD-urile, acest canal hibrid este activat de un agonist mic derivat din chinuclidinil benzamidă, un agonist al receptorului α7 nicotinic al acetilcolinei, și permite schimbul de ioni prin membrana neuronală. Printre alte limitări specifice acestei abordări (Aldrin-Kirk și Björklund, 2019), aceasta împărtășește, de asemenea, cu DREADD-urile utilizarea unui ligand farmacologic care poate interacționa potențial cu receptorii endogeni, în funcție de condițiile experimentale. În cele din urmă, toate aceste încuietori derivă din receptorii endogeni și, ca atare, nu reușesc să scape de limitările legate în mod intrinsec de farmacologie.

Dincolo de aceste evoluții recente și de întrebările care rămân, ar trebui să se pună o întrebare crucială: se va găsi vreodată o cheie total selectivă și inertă? Probabil că nu. Este esențial să se țină cont de faptul că DREADD-urile sunt instrumente chimiogenetice care combină genetica și farmacologia. Deși abordările genetice oferă un control puternic al expresiei încuietorilor (adică a DREADD-urilor) în populații celulare specifice, sau în subpopulații cu abordări condiționate, acestea derivă din GPCR-uri endogene și, ca atare, sunt supuse acelorași limite ca și farmacologia clasică pentru cheie. Prin urmare, este puțin probabil să se găsească molecule care să prezinte o afinitate de legare ridicată pentru DREADD fără afinitate pentru unii dintre numeroșii receptori care sunt deja prezenți în creier și care sunt strâns legați de DREADD. De exemplu, clozapina are o afinitate foarte mare pentru DREADD, dar și pentru receptorul serotoninergic 5-HT2 (Ki = 10-8 pentru ambele; Armbruster et al., 2007; Gomez et al., 2017), precum și o afinitate ridicată pentru o gamă largă de alți GPCR (Ki = 10-7 până la 10-6; Armbruster et al., 2007). Chiar și liganzii sintetici care sunt special concepuți pentru această tehnică chimiogenetică prezintă afinități substanțiale pentru receptorii endogeni. De exemplu, deși JHU37152 și JHU37160 au o afinitate mai mică pentru receptorii 5-HT decât clozapina, aceștia au un profil de țintă global similar cu acest medicament, cu o afinitate chiar mai mare pentru receptorii muscarinici (Bonaventura et al., 2018), sugerând efecte potențial mai puternice în afara țintei. C21 prezintă, de asemenea, o afinitate mai mare pentru receptorul histaminergic H1 decât pentru DREADD (Ki > 10-8 și, respectiv, Ki = 10-7,2; Thompson et al., 2018) și un potențial de legare mai mare la receptorii opioizi decât clozapina (Bonaventura et al., 2018). Pentru a minimiza capcanele acestei abordări puternice, indiferent de cheia aleasă, trebuie luate măsuri de precauție critice (Fig. 1).

În primul rând, înainte de orice experiment comportamental, trebuie testate condițiile experimentale pentru a găsi cel mai bun ligand și doza sau dozele optime, în funcție de abordarea experimentală. DREADD-urile nu trebuie să fie considerate ca un instrument la cheie; experimentele celulare, neurochimice sau electrofiziologice trebuie efectuate înainte de studiul comportamental (Mahler et al., 2014; Beloate et al., 2016; Boekhoudt et al., 2016) pentru a confirma eficacitatea ligandului la doza aleasă în sistemul de interes. În plus, trebuie incluse și animale de control care nu au DREADD pentru a verifica absența efectelor neurobiologice aspecifice ale ligandului sau ale receptorului în sine care poate fi activat de un neurotransmițător sau care are o activitate constitutivă (Saloman et al., 2016).

În al doilea rând, atunci când este posibil, trebuie testați doi liganzi DREADD diferiți pentru a confirma că efectele comportamentale observate sunt mediate în mod specific de DREADD. Acțiunile farmacologice specifice asupra DREADD ar fi similare, dar efectele în afara țintei pot fi diferite.

În al treilea rând, și cel mai critic punct, trebuie să se utilizeze controale farmacologice convenționale. Trebuie aplicată aceeași filozofie ca în farmacologie și, la fel ca în cazul experimentelor neurobiologice, trebuie integrate grupuri de animale transgenice fără exprimarea DREADD-urilor (de exemplu, vectori virali goi de DREADD-uri) pentru a verifica efectele selective ale ligandului și ale dozei alese (Smith et al., 2016, Campbell și Marchant, 2018; Mahler și Aston-Jones, 2018; pentru un exemplu de studii experimentale care urmează acest design, a se vedea, de asemenea, Xia et al., 2017; Cope et al., 2019). Această afirmație poate părea banală, dar urmărirea unui ligand selectiv absolut și atractivitatea acestei abordări au dus deja la unele studii comportamentale prea încrezătoare, uneori efectuate în absența completă a acestui control.

În concluzie, DREADD-urile oferă o modalitate precisă de manipulare a circuitelor neuronale și a comportamentului și oferă o alternativă excelentă la optogenetică pentru a manipula tonic o subpopulație celulară specifică, deschizând astfel noi și interesante căi de cercetare. Cu toate acestea, la fel cum proprietățile termice ale luminii în optogenetică pot duce la efecte aspecifice (a se vedea, de asemenea, Owen et al., 2019), este necesară o mai mare precauție în cazul chimiogeneticii, iar controalele standard trebuie să fie obligatorii. Trebuie recunoscute limitările DREADD și trebuie să se ia timp pentru a evita sau pentru a controla posibilele efecte în afara țintei și pentru a verifica dacă această abordare nu induce distorsiuni în sine. Utilizarea punctelor forte ale geneticii, acordând în același timp atenție punctelor slabe ale farmacologiei, va maximiza potențialul acestei abordări.

.