Descoperirea triterpenoidelor din Ganoderma lucidum ca potențiali inhibitori împotriva proteazei NS2B-NS3 a virusului Dengue

NS2B-NS3 protează
Screening virtual și analiză de simulare a simulării de docking
Analiză de interacțiune moleculară și MM/GBSA
Analiză de dinamică moleculară (MD)

NS2B-NS3 protează

Datele privind structura tridimensională (3D) a proteinei țintă au fost stabilite ca fiind o cerință primară pentru descoperirea medicamentelor. Atât structurile cristalografice cu raze X, cât și modelele de homologie generate pentru proteinele țintă au fost utilizate pentru a identifica potențiali liganzi din bazele de date chimice, dar structurile cristalografice 3D au fost documentate ca fiind mai eficiente decât modelele de homologie generate in silico. Prin urmare, structura 3D a proteazei DENV NS2B-NS3, care a fost propusă ca o țintă terapeutică majoră împotriva infecției cu DENV, a fost preluată din banca de date a proteinelor (PDB) cu ID PDB:2FOM40. Structura cristalină a NS2B-NS3pro a fost rezolvată la o rezoluție de 1,5 Å și a prezentat două lanțuri proteice, și anume lanțul A pliat pentru a forma cofactorul NS2B și lanțul B care cuprinde domeniul NS3pro (Fig. 2a). În acest caz, domeniul proteazei (NS3pro) din lanțul B (Fig. 2b) a fost selectat pentru un screening virtual bazat pe structură cu triterpenoizi selectați din G. lucidum.

Screening virtual și analiză de simulare a simulării de docking

În ultima vreme, screeningul virtual bazat pe structură a câștigat popularitate pentru descoperirea de noi compuși principali din biblioteci chimice bioactive mari împotriva unor ținte selectate. Această abordare include simularea de andocare a liganzilor în regiunea situsului activ al receptorului selectat, urmată de clasificarea și scorarea inhibitorilor23. În această lucrare, am efectuat un screening virtual bazat pe structură a 22 de triterpenoizi antivirali cunoscuți din G. lucidum împotriva NS3pro, utilizând modulul Glide al suitei Schrodinger (tabelul S1). Acești inhibitori au fost analizați în continuare prin protocolul de andocare XP al modulului Glide pentru a colecta informații privind energia de legare, precum și modele suplimentare de legare cu reziduurile situsului activ. S-a observat că toți triterpenoizii selectați au prezentat afinități de legare semnificative față de NS2B-NS3pro, cu excepția acidului Ganoderic G (tabelul S1). De asemenea, docking-ul molecular al inhibitorului de referință 1,8-Dihidroxi-4,5-dinitroantrachinonă față de același situs activ a produs un scor de docking de -5,377 kcal/mol. Prin urmare, triterpenoizii cu scoruri de docking mai bune decât un prag de -5 kcal/mol au fost selectați pentru analiza interacțiunii moleculare. Am selectat un total de patru triterpenoizi, și anume Ganodermanontriol (-6,291 kcal/mol), Lucidumol A (-5,993 kcal/mol), acidul Ganoderic C2 (-5,948 kcal/mol) și acidul Ganosporeric A (-5,830 kcal/mol) ca posibili inhibitori pentru domeniul NS3pro al proteazei DENV. Aceste scoruri de andocare au fost considerate semnificative în comparație cu inhibitorul cunoscut 1,8-Dihidroxi-4,5-dinitroantrachinonă (-5,377 kcal/mol) și cu moleculele bioactive raportate Nimbin (-5,56 kcal/mol), Desacetylnimbin (-5,24 kcal/mol) și Desacetylsalannin (-3,43 kcal/mol) din Azadirachta indica cu DENV NS3pro41. Aceste rezultate indică potențialul triterpenoizilor bioactivi din G. lucidum ca inhibitori ai proteazei DENV și sugerează că aceștia ar putea fi utilizați în dezvoltarea de medicamente antivirale pentru infecția cu DENV.

Analiză de interacțiune moleculară și MM/GBSA

Pentru că contactele moleculare în complexele docked proteină-ligand pot duce la o mai bună înțelegere a mecanismelor moleculare în sistemele biologice42, profilarea contactelor moleculare a fost, de asemenea, studiată pentru triterpenoizii selectați și inhibitorul de referință cu proteaza DENV. Complexul NS3pro-Ganodermanontriol a prezentat o interacțiune prin legături de hidrogen simple și duble moderate în regiunea activă cu reziduurile Lys73 (3 Å), Thr120 (2,94 Å) și, respectiv, Asn167 (3,26 Å, 2,86 Å). Atracții hidrofobe suplimentare au fost, de asemenea, înregistrate în cadrul complexului NS3pro-Ganodermanontriol la reziduurile Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 și Ala164. De asemenea, reziduurile His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167 și Gly153 au prezentat interacțiuni polare și, respectiv, glicinice cu Ganodermanontriol. Între timp, interacțiuni de sarcină pozitivă (Lys73 și Lys74) și negativă (Asp75) cu reziduuri au fost, de asemenea, înregistrate în complexul NS3pro-Ganodermanontriol andocat (Fig. 3a,b).

Profilele de interacțiune ale NS3pro-Lucidumol A au reflectat două legături de hidrogen simple formate cu reziduurile Asp75 (3,31 Å) și Asn152 (2,48 Å) și formarea de legături de hidrogen duble la Gly153 (2,11 Å, 2,84 Å), care contribuie, de asemenea, la o interacțiune glicinică cu reziduul Gly151. Mai mult, interacțiuni hidrofobe (Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 și Tyr161) și polare (His51, Ser135 și Asn152) au fost, de asemenea, înregistrate în complexul andocat. Asp75 prezintă interacțiuni de sarcină negativă la nivelul buzunarului activ al proteazei cu Lucidumol A (Fig. 3c,d). De asemenea, acidul ganoderic C2 andocat în complex cu NS3pro a prezentat formarea moderată de legături duble de hidrogen cu Gly151 (2,73 Å, 3,12 Å), în timp ce formarea de legături simple de hidrogen a fost observată la reziduurile Trp50 (2,66 Å) și Arg54 (1,93 Å). În plus, în acest complex a fost înregistrată și formarea unei punți de sare între gruparea hidroxil a acidului Ganoderic C2 și reziduul Arg54 al proteazei. În plus, interacțiuni polare (reziduurile His51 și Asn152), negative (reziduul Asp75) și pozitive (reziduul Arg54) au fost, de asemenea, înregistrate în NS3pro-Acidul Ganoderic C2 andocat (Fig. 3e,f). Complexul NS3pro-acidul gasoporic A andocat a arătat trei legături simple de hidrogen formate la reziduurile Thr120, Asn152 și Asn167, în timp ce Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 și Ala164 au fost marcate ca prezentând interacțiuni hidrofobe (Fig. 3g,h). Mai mult, NS3pro andocat cu acidul ganosporic A a prezentat interacțiuni polare (reziduurile Thr118,Asn119,Thr120, Asn152 și Asn167), pozitive (Lys73 și Lys74) și cu sarcină negativă (Asp75).

În plus, un inhibitor de referință, 1,8-Dihidroxi-4,5-dinitroantrachinona, a fost, de asemenea, andocat la situsul activ al proteazei NS3pro și au fost înregistrate interacțiuni semnificative. Acest complex prezintă formarea unei singure legături de hidrogen la reziduul Phe130, în timp ce His51 a fost observat pentru puntea de sare și interacțiunea pi-pi cu inhibitorul. În plus, în complexul andocat au fost marcate, de asemenea, interacțiuni hidrofobe (Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 și Tyr151), polare (His51, Ser131 și Ser135) și glicinice (Gly151 și Gly153).

S-a concluzionat că toate triterpenoidele analizate au prezentat legături de hidrogen cu NS3pro la nivelul triadei catalitice (His51, Asp75 și reziduul Ser135), împreună cu alte câteva reziduuri conservate (Phe130, Tyr150, Asn152 și Gly153) care au fost raportate ca având un rol semnificativ în legarea substratului pentru proteaza DENV43,44. În plus, unele reziduuri suplimentare au fost, de asemenea, înregistrate pentru partajarea legăturilor de hidrogen cu diferiți liganzi. Aceste observații sugerează că legăturile de hidrogen dintre un ligand și unul dintre reziduurile triadei catalitice a NS3pro pot perturba transferul de electroni între grupările carboxil și imidazol ale reziduurilor Asp75 și, respectiv, His51. S-a raportat că o astfel de perturbare duce la un atac nucleofilic nereușit al grupului hidroxil (ß-OH) al reziduului Ser135, care este esențial pentru inițierea activității proteolitice43,44. Prin urmare, s-a concluzionat că triterpenoizii analizați pot prezenta o afinitate puternică față de domeniul NS3pro al DENV prin diverse interacțiuni intermoleculare și s-a sugerat că aceștia ar putea acționa ca medicamente împotriva infecției cu DENV prin inhibarea NS2B-NS3pro.

În plus, complexele andocate ale tuturor celor patru triterpenoizi, Ganodermanontriol, Lucidumol A, acidul Ganoderic C2 și acidul Ganosporeric A cu DENV NS3pro au fost, de asemenea, analizate cu ajutorul calculelor MM/GBSA pentru a calcula afinitățile de legare ale liganzilor respectivi la nivelul situsului activ. Aceste calcule au arătat valori MM/GBSA relativ negative pentru toți cei patru complecși andocați, și anume NS3pro-Ganodermanontriol (-24,465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19,735 kcal/mol), NS3pro-Acidul Ganoderic C2 (-19.039 kcal/mol) și acidul NS3pro-Ganosporic A (-11,449 kcal/mol), în timp ce complexul inhibitor de referință NS3pro-1,8-Dihidroxi-4,5-dinitroantrachinonă a produs o valoare mai mare (-38,934 kcal/mol). Aceste observații sugerează că activitatea de inhibiție a triterpenoidelor selectate împotriva NS3pro ar putea fi mai slabă decât cea a inhibitorului de referință, dar a sugerat, de asemenea, că afinitatea de legare mai puternică a Ganodermanontriolului cu NS3pro în comparație cu celelalte triterpenoide a fost susținută de scorurile de andocare preconizate. În plus, valorile ΔG prezise și componentele fizico-chimice, adică ΔGBind Coulomb, ΔGBind covalent, ΔGBind vdW (forțele van der Waals), ΔGBind Solv SA (suprafața accesibilă a solventului) și analiza ΔGBind Solv GB (energia de solvatare generalizată Born) pentru triterpenoizii selectați și controlul pozitiv complexat cu proteina DENV NS3pro indică faptul că, în funcție de ligand, ΔGBind Coulomb și/sau ΔGBind vdW au contribuit cel mai mult la stabilitatea complexelor triterpenoidelor și a inhibitorului de referință cu proteina DENV NS3pro. (Fig. 4, S2, tabelul S2). Prin urmare, s-a concluzionat că Ganodermanontriolul este cel mai promițător triterpenoid funcțional pentru proteina DENV NS3pro și a fost analizat în continuare împreună cu ceilalți triterpenoizi folosind dinamica moleculară și analiza in vitro.

Analiză de dinamică moleculară (MD)

Informațiile de interacțiune prezise de pe ligandul-țintă calculate cu ajutorul abordării de docking molecular pot fi validate în continuare prin simulare de dinamică moleculară și studii cristalografice38,41. În acest caz, stabilitatea complecșilor selectați din domeniul triterpenoid-NS3pro a fost evaluată cu ajutorul simulării MD de 10 ns în ceea ce privește deviația medie pătratică (RMSD), fluctuația medie pătratică (RMSF) și analiza hărții de contact proteină-ligand.

Analiza RMSD a atomilor C-alfa și a atomilor din coloana vertebrală în DENV NS3pro complexat cu toți cei patru liganzi a arătat deviații stabile și acceptabile în timpul simulării MD de 10 ns (Fig. 5). Este interesant faptul că fluctuația finală pentru receptor a fost înregistrată ca <2 Å RMSD, în timp ce inhibitorul Ganodermanontriol a prezentat o variație stabilă și maximă de 6 Å în complex cu domeniul NS3pro la sfârșitul intervalului de simulare (Fig. 5a). De asemenea, RMSF calculată atât pentru reziduurile individuale ale receptorului, cât și pentru atomii ligandului au prezentat variații tolerabile (mai puțin de 2,8 Å) în timpul intervalului de simulare (Fig. S3a, S4a). Cu toate acestea, fluctuații RMSF nesemnificative au fost observate, de asemenea, pe parcursul unui interval de timp de 5 până la 7 ns în grupurile ceto și metil ale inelului ciclopenta-fenantren-7-one al ligandului (Fig. S3a).

În mod similar, analiza RMSD pentru complexul NS3pro-Lucidumol A a arătat că atât receptorul, cât și ligandul au prezentat variații mai mici de 3 Å în timpul intervalului de simulare de 10 ns (Fig. 5b). Între timp, analiza RMSF atât pentru NS3pro, cât și pentru Lucidumol A a prezis variații <3 Å, o deviație acceptabilă a fost, de asemenea, înregistrată în grupul metil și hidroxil din regiunea heptan a ligandului în timpul intervalului de simulare de 10 ns (Fig. S3b). În mod similar, ligandul din complexul NS3pro-acidanoderic C2 a prezentat abateri acceptabile în timpul perioadei inițiale de 2-5 ns, urmate de stabilitate, iar abaterea finală a fost înregistrată la mai puțin de 8 Å în timpul intervalului de simulare de 10 ns (Fig. S4b).

Complexul NS3pro-acidanoderic C2 a prezentat, de asemenea, abateri nesemnificative în receptor între 2-5 ns, urmate de stabilitate, cu o variație finală înregistrată la mai puțin de 1,75 Å în timpul intervalului de simulare (Fig. 5c). Aceste deviații acceptabile în ligand (mai puțin de 6 Å) și receptor (3 Å) au fost, de asemenea, susținute de RMSF calculat pentru complexul respectiv (Fig. S3c, S4c).

Mai mult, analiza de simulare a ligandului din complexul NS3pro-Acidul Ganosporic A andocat a prezentat inițial o deviație scăzută timp de 6 ns în grupul carboxilic situat la nivelul fracțiunii heptan a ligandului inițial, urmată de dobândirea unei stări stabile la 4,6 Å RMSD până la sfârșitul intervalului de 10 ns (Fig. 5d). Între timp, NS3pro a prezentat oscilații stabile în jurul valorii de 1,6 Å RMSD cu abateri nesemnificative în regiunea N-terminală inițială (Fig. 5d). Aceste observații au sugerat stabilitatea complexului andocat respectiv, așa cum susțin curbele RMSF pentru reziduurile individuale (mai puțin de 3,5 Å) și atomii (3 Å) din receptor și, respectiv, ligand (Fig. S3d, S4d).

O hartă de interacțiune proteină-ligand care descrie contribuția reziduurilor individuale la legătura intermoleculară a fost, de asemenea, generată din curbele traiectoriilor de simulare (Fig. 6). Harta de interacțiune proteină-ligand pentru complexul NS3pro-Ganodermanontriol a evidențiat participarea reziduurilor Met49, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu76, Trp83, Glu88, Thr118, Thr120, Ile123, Val147, Leu149, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Ala164, Ile165, Ala166 și Asn167, formând legături de hidrogen, atracții hidrofobe, interacțiuni ionice și punți de apă (Fig. 6a). Reziduurile Leu149 și Asn152 au fost evidențiate pentru că au contribuit la punți de apă proeminente și atracții de legături de hidrogen în timpul intervalului de simulare de 10 ns (Fig. 6a). Reziduul Asn152 a fost, de asemenea, prezis să formeze legături de hidrogen în complexul de andocare (Fig. 3a,b), a sugerat importanța acestui reziduu în NS3pro pentru interacțiunea cu Ganodermanontriol.

Harta de interacțiune NS3pro-Lucidumol A a prezentat participarea lui His51, Arg54, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, reziduurile Val155, Tyr161 și Asn167 în legături de hidrogen, interacțiuni hidrofobe și punți de apă, cu reziduurile Asp75 și Gly153 pentru cele mai mari contribuții în formarea punților de apă și, respectiv, a legăturilor de hidrogen (Fig. 6b). Analiza de docking molecular a sugerat, de asemenea, rolul lui Gly153 în legătura de hidrogen cu ligandul (Fig. 3c,d), a indicat importanța acestui reziduu în stabilitatea proteină-ligand. În plus, reziduurile Tyr161, Asp75 și Leu128 au fost, de asemenea, indicate pentru contribuții majore în interacțiuni mediate de apă, legături de hidrogen și, respectiv, hidrofobe, cu acest ligand (Fig. 6b). Aceste rezultate au sugerat că Gly153, Tyr161, Asp75 și Leu128 au fost responsabili în mod proeminent pentru conformația stabilă a complexului NS3pro-Lucidumol A în timpul intervalului de simulare.

Între timp, complexul NS3pro-acid guanoderic C2 a prezentat contribuții ale reziduurilor Lys28, Ile36, Trp50, His51, Arg54, Val72, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Ser131, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val155 și Tyr161 în diferite interacțiuni moleculare în cartografierea proteină-ligand în timpul simulării (Fig. 6c). În mod interesant, interacțiunea intermoleculară majoră a fost contribuită de Arg54 prin formarea de legături de hidrogen, urmată de punți de apă și atracție ionică (Fig. 6c). Acest reziduu a fost, de asemenea, prezis în analiza de andocare moleculară pentru a forma două legături de hidrogen cu acidul ganoderic C2 (Fig. 3e,f), sugerând că este un factor cheie pentru menținerea stabilității ligandului-țintă în timpul simulării.

În mod similar, profilul de interacțiune NS3pro-acidul Ganoderic A a arătat că reziduurile Try50, His51, Arg54, Asp71, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Thr118, Asn119, Thr120, Gly121, Thr122, Ile123, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 și Asn167 au contribuit în mod activ la punți de apă, interacțiuni hidrofobe și ionice (Fig. 6d). Cu toate acestea, s-a prezis că reziduurile Lys73, Lys74, Val155 și Asn167 au avut cele mai mari contribuții la stabilitatea NS3pro complexat cu ligandul acid ganosporic A prin legături de hidrogen, urmate de punți de apă, interacțiuni hidrofobe și ionice (Fig. 6d). De asemenea, Asn167 a fost marcat pentru a prezenta formarea de legături de hidrogen cu acidul Ganosporeric A în complexul andocat, dezvăluind contribuția sa semnificativă la stabilitatea complexului. Aceste rezultate au validat și sugerat stabilitatea semnificativă a fiecărui triterpenoid cu domeniul NS3pro al proteazei DENV în complexele andocate. Prin urmare, s-a sugerat din nou că acești triterpenoizi ar putea fi utilizați în formularea medicamentelor împotriva infecției cu DENV.

Virtual world

NS2B-NS3 protează

Screening virtual și analiză de simulare a simulării de docking

Analiză de interacțiune moleculară și MM/GBSA

Analiză de dinamică moleculară (MD)

Lasă un răspuns Anulează răspunsul

Articole recente