Tipuri de hemocite la greieri

Figura 1A prezintă o imagine de microscopie cu contrast de interferență diferențială (DIC) a hemocitelor de greieri, care arată celule de diferite dimensiuni și forme. Pentru o identificare precisă a acestor hemococite, aproximativ 1.000 de celule au fost clasificate după mărimea și morfologia lor (datele nu sunt prezentate) în șase tipuri (Fig. 1B~G). După cum se arată în Fig. 1B, în hemolimfă s-a observat granulocitul tipic. Granulocitele au avut, de obicei, o formă rotundă sau ovală, iar în citoplasmă s-au observat mulți granule polimorfe. Pe membrana plasmatică a granulocitelor au fost observate pseudopode sau filopode mici (Fig. 1B, indicate prin săgeți albe). Celula prezentată în Fig. 1C a fost considerată a fi plasmocite datorită formei lor fusiforme tipice și a structurilor lungi, asemănătoare unor fire de păr, observate la ambele capete ale membranei plasmatice (indicate prin săgeți albe). Figura 1D prezintă un prohemocit, care sunt cele mai mici celule rotunde observate în hemolimfa insectelor. Nucleii erau mari în raport cu dimensiunea celulei și erau localizați în mijlocul celulei (Fig. 1D). Astfel, citoplasma și nucleul prohemocitelor erau adesea imposibil de distins. Figura 1E descrie un coagulocit care conține diverși granule citoplasmatice. Membranele plasmatice ale coagulocitelor erau netede, fără nicio structură, iar nucleele lor erau mari și ușor de observat. Oenocitoidele au fost cel mai mare tip de hemocit observat și erau rare în hemolimfă (figura 1F). Oenocitoizii aveau, de obicei, o formă rotundă de ou prăjit, cu numeroși granule citoplasmatice. Figura 1G prezintă un sferulocit, care erau rotunde și de mărime medie, cu numeroase granule mici de culoare închisă sau strălucitoare în citoplasmă. După cum se arată în fig. 1D~G, nu erau vizibile structuri pe membranele plasmatice ale prohemococitelor, coagulocitelor, oenocitocitelor sau sferulocitelor, care erau optic foarte netede.

Cele șase tipuri de hemocite observate în sângele greierilor. Forma generală și dimensiunea relativă a hemocitelor din hemolimfă (A). Cele șase tipuri de hemococite găsite la G. bimaculatus au fost clasificate ca granulocite (B ; GR), plasmocite (C ; PL), prohemococite (D ; PR), coagulocite (E ; CO), oenocitoide (F ; OE) și sferulocite (G ; AD) pe baza dimensiunii și morfologiei. Structurile în formă de evantai sau de amoeba de pe membrana plasmatică a granulocitelor și plasmocitelor sunt indicate prin săgeți albe (B și C). Bară de scară = 25 µm (A) sau 10 µm (B~G).

Nodularea și încapsularea de către hemocite

La insecte, răspunsurile imune celulare, cum ar fi nodularea, încapsularea și fagocitoza, sunt efectuate de către hemocite imune, cum ar fi granulocitele și plasmocitele. După expunerea la agenți patogeni, aceste hemocite își schimbă forma și dezvoltă structuri mari asemănătoare cu amibele sau în formă de evantai în membranele lor plasmatice. Pentru a observa aceste modificări morfologice rapide în timp real, am dezvoltat o tehnică care ne permite să cultivăm hemocite de insecte timp de 7 zile, păstrând în același timp activitatea fiziologică (descrisă în Materiale și metode). Deși nu am putut stabili linii stabile de hemocite care să poată fi trecute timp de mai mulți ani, am reușit să observăm morfologia hemocitelor ca răspuns la agenții patogeni in vitro. Filmul suplimentar C prezintă doar hemococitele după 12 h de incubare. Majoritatea celulelor cultivate se mișcau în mod activ. Unele celule prezentau plase în jurul membranei celulare în timpul cultivării și s-a constatat că erau atașate de lamelele de cultură. Hemocitele rareori s-au agregat sau au format grupuri mari.

Figura 2A prezintă hemocite cultivate cu E. coli (a se vedea, de asemenea, filmul suplimentar 1). Unele hemocite au fost observate ca fiind mai agregate și în mișcare. Pe măsură ce timpul de incubare a crescut, s-au produs plase (fire de păr asemănătoare cu amibele sau capcane extracelulare) de către hemocite specifice, iar diverse hemocite au fost adunate de aceste plase pentru a forma grupuri mari (Fig. 2A-1~A-6; fire de păr asemănătoare cu amibele sau capcane extracelulare indicate prin săgeți negre). Așa cum se arată în Fig. 2A-1, trei grupuri de hemocite (indicate prin cercuri negre) au fost în cele din urmă adunate într-un singur grup de către plase (Fig. 2A-5 și A-6).

Imagini cu celule vii ale hemocitelor de greieri infectate cu E. coli sau cu bile de Sephadex. (A) Imagini la microscopul optic care prezintă hemocite cultivate cu E. coli. Pe măsură ce timpul de incubare a crescut, au fost produse plase (fire de păr asemănătoare cu amibele sau capcane extracelulare; indicate prin săgeți negre) de către hemocite specifice. Toate cele șase tipuri de hemocite au fost agregate în grupuri mari de aceste plase (A-1~A-6; indicate prin casete negre). Film disponibil ca film 1 (timp în minute după inoculare). (B) Imagini la microscopul optic care arată hemocitele cultivate cu bile de Sephadex. Sferele Sephadex din jurul hemocitelor au fost etichetate aleatoriu SP1, SP2, SP3, SP4 și SP5. În timp, bilele de Sephadex (SP1, SP2, SP3 și SP4) au fost înconjurate de hemocite și încapsulate de diferite tipuri de plase (B-1~B-9; indicate prin săgeți negre). Film disponibil ca film 2 (timp în minute după inoculare). Bară de scară = 25 µm (A și B). Filmul C prezintă hemocite cultivate singure, fără microsfere Sephadex. Majoritatea hemocitelor se mișcau în mod activ. Câteva celule erau atașate de lamelele de cultură prin rețele de membrană plasmatică. Cu toate acestea, nu au fost observate grupuri mari de hemocite.

Cu toate acestea, nu a fost posibil să se determine dacă adunarea hemocitelor descrisă mai sus a fost declanșată de E. coli. Pentru a răspunde la această întrebare, hemocitele au fost activate cu bile de Sephadex (cu un diametru de 120 μm), care pot fi observate cu ușurință cu un microscop DIC (Fig. 2B, Filmul suplimentar 2). După cum se arată în Fig. 2A, bilele de Sephadex au fost capturate de rețelele generate de hemococitele specifice (Fig. 2B; rețelele indicate prin săgeți negre în casetele galbene). Bilele de Sephadex din jurul hemocitelor au fost etichetate aleatoriu SP1, SP2, SP3, SP4 și SP5. După cum se poate observa prin compararea Fig. 2B-2 și B-3, SP1, SP2 și SP3 au fost trase împreună și în zona indicată de caseta galbenă. În plus, SP1 a ajuns în cele din urmă să fie complet înconjurată de diverse hemocite (Fig. 2B-9). Bila etichetată SP4 a fost, de asemenea, încorporată în grupul cu SP1, SP2 și SP3 (Fig. 2B-4~B-9; indicată de caseta galbenă). În timp, toate bilele de Sephadex (SP1, SP2, SP3 și SP4) au devenit înconjurate de multe hemocite. În schimb, s-a observat că hemococite individuale au fost în contact cu SP5, dar aceasta nu a fost atrasă în zona indicată de caseta galbenă, chiar dacă se afla într-o poziție similară cu SP1. Prin urmare, nodularea de către hemocite părea să se producă la întâmplare.

Activarea granulocitelor prin bile de latex de polistiren modificat cu carboxilat

În continuare, am investigat care hemocite au produs plasele și au participat la diferitele etape ale răspunsului imun, inclusiv încapsularea și nodularea. În acest scop, în locul agenților patogeni au fost folosite bile de latex de polistiren modificat cu carboxilat, care pot fi observate cu ușurință cu un microscop DIC, și au fost colectate imagini în timp real ale hemocitelor. Figura 3A prezintă hemocite stimulate cu bile de latex de polistiren modificat cu carboxilat timp de 12 h (film suplimentar 3). Plasele produse de hemocite (indicate prin săgeți negre) s-au deplasat în mod activ în jurul bilelor de latex (indicate prin săgeți roșii) (Fig. 3A-1). În timp, mărgelele au fost înghițite de plase și, în cele din urmă, au putut fi observate în citoplasma hemocitelor (Fig. 3A-2~A-4). Cu toate acestea, nu toate bilele de latex de polistiren modificat cu carboxilat care au întâlnit o plasă au fost fagocitate. Astfel, mișcarea hemocitelor activate nu pare să corespundă exact cu mișcarea bilelor.

Imagini cu celule vii ale granulocitelor stimulate cu bile de latex de polistiren modificat cu carboxilat. (A) Imagini la microscopul optic care prezintă hemocite cultivate cu bile de latex de polistiren modificat cu carboxilat timp de 12 h. A-1~A-4, hemocite cultivate după 12~18 min. Rețelele produse de hemocite (săgeți negre) au putut fi văzute formându-se în jurul bilelor de latex (indicate prin săgeți roșii). Bilele de latex au fost înghițite de plase și, în cele din urmă, au fost capturate în citoplasma hemocitelor (A-4). Film disponibil ca film 3 (timp în minute după stimulare). Bară de scară = 40 µm. (B) Imagini mărite. (B-1) După 4 h, multe bile de latex de polistiren modificat cu carboxilat au fost capturate de hemocite (bile de latex, săgeți roșii; și hemocite specifice, cercuri albe). (B-2~B-6) Granulocite cultivate la 0, 2, 4, 12 și 48 de ore după stimulare. (B-2) Granulocite în repaus, care au o formă rotundă sau ovală. (B-3) La 2 h după stimulare, granulocitele au început să prezinte modificări morfologice și pot fi observate structuri ale membranei plasmatice în formă de evantai sau de amoebe (săgeți albe). (B-4 și -5) Un număr mare de bile de latex s-au acumulat în citoplasma granulocitelor la 4 și 12 h post-infecție. (B-6) La 48 h postinfecție, multe bile de latex s-au acumulat în citoplasma granulocitelor, dar nu s-au mai observat plase, iar multe granulocite păreau inerte. Bară de scară = 15 µm (B-1) sau 10 µm (B-2~B-6).

Observațiile detaliate au fost realizate cu ajutorul unui microscop confocal cu mare putere de mărire (Fig. 3B). La 4 h postinfecție, bilele de latex de polistiren modificat cu carboxilat au putut fi observate în interiorul anumitor hemocite (Fig. 3B-1; bilele indicate prin săgeți roșii, iar hemocitele specifice indicate prin cercuri albe). În continuare, am observat mai detaliat ce celule specifice au înghițit bilele de latex (Fig. 3B-2~B-6). Figura 3B-2 prezintă granulocite în repaus, care erau de obicei de formă rotundă sau ovală, cu mulți granule întunecate polimorfe în citoplasmă. La 2 h după stimularea cu bile de latex de polistiren modificat cu carboxilat, granulocitele au început să prezinte modificări morfologice, inclusiv proeminențe în formă de evantai sau de amoeba ale membranei plasmatice (Fig. 3B-3; indicate prin săgeți albe). Sferele de latex de polistiren modificat cu carboxilat au fost observate în citoplasma granulocitelor la 4 h după stimulare, iar un număr mare de perle de latex s-au acumulat în citoplasma multor granulocite până la 12 h după stimulare (Fig. 3B-4 și B-5; margele indicate cu săgeți roșii, iar rețelele indicate cu săgeți albe). În plus, s-a observat că plasele au devenit mai mari și mai late în timp (Fig. 3B-4 și B-5). La 48 de ore după stimulare, multe mărgele de latex se acumulaseră în citoplasma granulocitelor, dar rețelele nu mai puteau fi observate, iar multe granulocite păreau inerte (Fig. 3B-6; mărgele indicate prin săgeți roșii).

După cum se arată în Fig. 2, granulocitele păreau să se atașeze nu numai la alte granulocite, ci și la diferite tipuri de hemocite folosind aceste rețele. Nu am observat fagocitoza în niciun alt tip de celule, cu excepția unui număr mic de plasmocite (date neevidențiate). În plus, nu am observat nicio activitate imunologică sau modificări morfologice în niciun alt tip de celule în afară de granulocite și un număr mic de plasmocite.

Lizozomii granulocitelor au fost activați prin injectarea de E. particule de E. coli

Pentru a investiga dacă vacuolele observate în interiorul granulocitelor erau fagosomi legați de agenți patogeni, greierii au fost injectați cu particule de E. coli, care sunt utilizate în principal ca markeri ai fagocitozei și care prezintă fluorescență verde atunci când ajung la organite acidificate, cum ar fi lizozomii intracelulari. În același timp, hemococitele totale au fost colorate cu LysoTracker Red, care marchează lizozomii. După cum se arată în Fig. 4A-1, în citoplasma granulocitelor s-a observat un semnal fluorescent verde (particule de E. coli fagocitate) imediat după injectarea particulelor. În același timp, s-a observat, de asemenea, un semnal fluorescent roșu, care indică formarea activată a lizozomilor (Fig. 4A-2). La 4 h după injectare, în multe granulocite au putut fi observate vacuole foarte polimorfe (Fig. 4A-4 și A-5). Sunt prezentate imagini fuzionate ale semnalului fluorescent verde (particule de E. coli fagocitate) și ale semnalului fluorescent roșu (lizozomi activați) (Fig. 4A-6). La 12 h după injectare, semnalul fluorescent verde a început să se estompeze, în timp ce semnalul fluorescent roșu a rămas (Fig. 4A-7~A-9). La 24 h post-injecție, ambele semnale fluorescente s-au atenuat (Fig. 4A-10~A-12). Cu toate acestea, semnalul fluorescent roșu din granulocite a fost observat din nou la 48 h după injectare (Fig. 4A-13~A-15). Figura 4Aa~Ao prezintă inserțiile din panourile A-1~A-15 (indicate prin casete albe) la o mărire mai mare. Greierii care au fost injectați doar cu soluție tampon PBS au fost negativi pentru fluorescența roșie și verde la toate momentele post-injecție (Fig. 4B).

Etichetarea cu LysoTracker Red a lizozomilor din granulocite în greieri injectați cu particule fluorescente verzi de E. coli. (A) Dezvoltarea lizozomilor din granulocite la 0 h, 4 h, 12 h, 24 h și 48 h după injectarea particulelor E. coli. (A-1, A-4, A-7, A-10 și A-13) Particulele de E. coli, care sunt utilizate ca markeri de fagocitoză, devin fluorescente în verde atunci când ajung la organite acidificate, cum ar fi lizozomii intracelulari. (A-2, A-5, A-8, A-11 și A-14) Imagini la microscopul confocal fluorescent ale granulocitelor colorate cu LysoTracker Red (un marker lizozomal). (A-1 și A-2) Semnalele fluorescente verzi și roșii au putut fi observate în citoplasma granulocitelor începând cu 1 h după injectare. (A-4 și A-5) Multe granulocite au prezentat fluorescență verde și roșie în vacuolele foarte polimorfe ale granulocitelor la 4 h post-injecție. (A-7 și -8) La 12 h post-injecție, semnalul fluorescent verde s-a diminuat, dar semnalul fluorescent roșu a rămas. (A-10 și A-11) La 24 de ore după injectare, semnalele fluorescente verde și roșu aproape dispăruseră amândouă. (A-13 și A-14) La 48 de ore după injectare, semnalul fluorescent verde a dispărut complet, dar s-a observat din nou semnalul fluorescent roșu. Sunt prezentate imagini fuzionate ale semnalelor fluorescente verzi și roșii (A-3, A-6, A-9, A-12 și A-15). (a~o) Inserțiile din panourile A-1 ~A-15 (indicate prin casete albe) la o mărire mai mare. (B) Semnalul fluorescent roșu în granulocite de la greieri care au fost injectați cu PBS (control negativ). (C) Analiza citometrică de flux la 1 h ~ 48 h după injectare. (C-1 și C-2) Semnalul fluorescent verde a fost de 2,08% la 1 h post-injecție și a crescut la 24,6% la 4 h post-injecție. (C-3~C-5) Semnalul fluorescent verde a scăzut treptat, la 10,87% la 12 ore, 3,98% la 24 de ore și 1,74% la 48 de ore. (C-1-1~C-4-1) Semnalul fluorescent roșu a crescut la 69,54% la 12 ore după injectare și a scăzut la 5,78% la 24 de ore după infectare. (C-5-1) Semnalul fluorescent roșu a crescut din nou, la 30,25%, la 48 de ore după injectare. (C-1-2~C-5-2) Semnalul fluorescent roșu în granulocite de la greieri care au fost injectați doar cu tampon PBS. (D) Analizele de citometrie în flux au fost repetate de trei ori.

Pentru a cuantifica semnalele fluorescente verzi și roșii în greieri provocați cu PBS sau cu E. coli, hemocitele au fost analizate prin citometrie în flux la 0~48 h după injectare (Fig. 4C). La 0 h post-injecție, 2,08% din hemococite au fost pozitive pentru fluorescența verde, iar acest procent a crescut la 24,36% la 4 h post-injecție (Fig. 4C-1 și C-2). Semnalul de fluorescență verde a scăzut treptat până la 10,87 % din hemocite la 12 h, 3,98 % la 24 h și 1,74 % la 48 h (Fig. 4C-3~C-5). Aceste rezultate indică faptul că particulele de E. coli au fost înghițite și digerate în mod activ de către granulocite și au fost complet eliminate până la 48 h post-injecție. La 12 h post-injecție, 69,54% au fost pozitive pentru fluorescența roșie, iar semnalul a scăzut la 5,78% din hemocite la 24 h post-injecție (Fig. 4C-1-1~C-4-1). În concordanță cu observațiile noastre microscopice, semnalul de fluorescență roșie a crescut la 30,25% din hemocite la 48 h post-injecție. În schimb, greierii care au fost injectați cu PBS au fost negativi pentru fluorescența verde și roșie la toate punctele de timp (Fig. 4C-1-2~C-5-2). Analiza prin citometrie de flux a fost repetată de trei ori (Fig. 4D).

Reactivarea lizozomilor din granulocite la 48 h postinfecție

Reactivarea lizozomilor din granulocite la 48 h postinfecție a fost investigată în continuare prin observare microscopică (Fig. 5A și B). Așa cum se arată în Fig. 4A, semnalul fluorescent verde (particule de E. coli fagocitate) și semnalul fluorescent roșu (lizozomi activați) au fost observate la 4 h post-injecție (Fig. 5A-1~A-3). Semnalele fluorescente s-au diminuat până la 24 h post-infecție (Fig. 5A-4~A-6). La 24 h postinfecție, am observat că se puteau vedea celule în citoplasma granulocitelor (Fig. 5A-4~A-6; indicate prin săgeți albe). Acest fenomen a fost mai evident la 48 h postinfecție (Fig. 5A-7~A-9; indicat prin săgeți albe). În plus, lizozomii din jurul acestor celule înghițite la 48 h postinfecție au fost activați (Fig. 5A-8). După cum se arată în Fig. 4A-14, 4C-5-1, aceste observații microscopice par să explice creșterea semnalului fluorescent roșu la 48 h postinfecție. Pentru a confirma acest lucru, nucleele granulocitelor au fost colorate cu 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) la 48 h postinfecție. După cum se arată în Fig. 5B-1, s-au observat frecvent granulocite cu două nuclee. Ocazional, au fost observate, de asemenea, granulocite care conțineau mai mult de două nuclee sau nuclee deformate (Fig. 5B-2 și B-3; indicate prin săgeți albe).

Reactivarea lizozomilor granulocitelor la 48 h post-injecție. (A) Imagini la microscopul cu fluorescență ale granulocitelor la 4 h, 24 h și 48 h post-injecție. (A-1 și A-2) Granulocitele au prezentat semnale fluorescente verzi și roșii în vacuolele foarte polimorfe la 4 h post-injecție. (A-4 și A-5) La 12 h post-injecție, semnalul fluorescent verde s-a diminuat, dar semnalul fluorescent roșu a rămas. În plus, au fost observate câteva celule în citoplasma granulocitelor (săgeți albe). (A-7 și A-8) Acest fenomen a fost observat mai frecvent la 48 h post-injecție. În plus, lizozomii din jurul acestor celule înghițite au fost activați (A-8). Sunt prezentate imagini fuzionate ale semnalelor fluorescente verzi și roșii (A-3, A-6 și A-9). (B) Granulocite colorate cu DAPI la 48 h post-injecție. (B-1) Au fost observate două nuclee în citoplasma granulocitelor. (B-2 și B-3) Ocazional, au fost observate două sau mai multe nuclee, sau nuclee deformate, în citoplasma granulocitelor (indicate prin săgeți albe). Bară de scară = 10 µm (A) sau 20 µm (B).

Moartea celulară a granulocitelor legată de necroză la 48 h postinfecție

Așa cum se arată în figurile 3B-6 și 5A-8, acumularea de fagosomi în granulocite a modificat forma acestora și a indus moartea celulară. La 48 h postinfecție, hemocitele au fost colorate cu anexină V conjugată cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) și iodură de propidiu (PI) pentru a confirma moartea celulară apoptotică sau necrotică (Fig. 6A). Semnalul fluorescent verde (anexină V) a crescut doar ușor între 12 h și 48 h (Fig. A-10, A-7 și A-10), dar semnalul fluorescent roșu (PI) a prezentat o colorare puternică la 12 h postinfecție (Fig. 6A-5). La 24 și 48 h postinfecție, semnalul fluorescent roșu a persistat (Fig. 6A-8 și A-11). Sunt prezentate imagini fuzionate ale semnalului fluorescent roșu (PI) și ale imaginilor DIC (Fig. 6A-3, A-6, A-9 și A-12). Figura 6Aa~Ad prezintă inserțiile din panourile A-3, A-6, A-9 și A-12 indicate prin casete la o mărire mai mare. Aceste rezultate indică faptul că acumularea de fagosomi în granulocite nu a indus o moarte celulară apoptotică tipică, ci o moarte celulară legată de necroză. Pentru a cuantifica colorarea PI, hemocitele au fost colorate și examinate prin citometrie în flux la 0 h, 12 h, 24 h și 48 h post-infecție. La 12 h postinfecție, 71,29% din granulocite au fost colorate cu PI, comparativ cu 13,52% la 0 h (Fig. 6B-1 și B-2). La 24 h postinfecție, colorarea cu PI a scăzut ușor, la 45,97 %, dar a crescut din nou la 76,24 % la 48 h (Fig. 6B-3 și B-4). Analiza prin citometrie în flux a fost repetată de trei ori (Fig. 6C).

.