DDRGK1 é necessário para a homeostase das ER

Para entender a função celular do DDRGK1, nós examinamos os efeitos do DDRGK1 knockdown usando uma mistura de dois siRNAs como descrito anteriormente21. Encontramos que a derrubada do DDRGK1 induziu a morte apoptótica das células MCF7 e HepG2, caracterizada pela coloração de Annexin V/PI (Fig. 1a), ativação da caspase-3 e clivagem PARP (Fig. 1b). Deve-se observar que podemos detectar a clivagem capspase-3 em células HepG2 induzida por batida de DDRGK1 mas não em células MCF7, pois as células MCF7 são deficientes em caspase-322. A análise quantitativa por PCR em tempo real (Q-PCR) mostrou que o knockdown do DDRGK1 aumentou a expressão dos genes pró-apoptóticos BAX, BAK, NOXA, DR5 e Bid, enquanto a expressão do gene anti-apoptótico Bcl-2 foi diminuída (Fig. 1c,d). É importante notar que a derrubada do DDRGK1 nas células MCF7 e HepG2 induziu respostas de estresse ER, com aumento da expressão do gene ER específico de BiP, HSPA8 e CHOP (Fig. 1e,f).

(a) As células MCF7 e HepG2 foram transfectadas com SiRNA de controle ou SiRNA visando DDRGK1 durante 72 h. As células foram posteriormente coradas com Annexin V e PI e submetidas à análise citométrica de fluxo seguida pela quantificação de células apoptóticas (Annexin V+). (b) Análise de Western blot analysis of PARP and cleaved caspase-3 in control and DDRGK1-knockdown MCF7 and HepG2 cells described in a. (c,d) Análise Q-PCR dos níveis relativos de expressão do mRNA de BAX, BAK, NOXA, Bid, DR-5 and Bcl-2 in control and DDRGK1-knockdown MCF7 and HepG2 cells. (e,f) Análise Q-PCR dos níveis relativos de expressão de mRNA de BiP, HSPA8 e CHOP nas células controle e DDRGK1-knockdown MCF7 e HepG2. Todos os dados são apresentados como média±s.d. de três experimentos. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001 pelo teste t de Student.

Para confirmar ainda mais que o DDRGK1 está envolvido na resposta de estresse do ER, determinamos o efeito do DDRGK1 na sobrevivência celular após o tratamento com os indutores de estresse do ER thapsigargin (Tg) e tunicamicina (Tm). Derrubando a apoptose induzida pelo DDRGK1 pelo tratamento com Tg em células HepG2 e MCF7, como avaliado pela coloração e clivagem da caspase-3 e PARP do Anexo V/PI (Fig. 2a-c e Suplemento Fig. 1A-C). Em contraste, a superexpressão de DDRGK1 reduziu a morte celular induzida por estresse ER nas células HepG2 (Fig. 2d-f). Além disso, a viabilidade das células MCF7 foi avaliada pelo ensaio MTT, e os resultados mostraram que a derrubada do DDRGK1 tornou as células mais sensíveis ao tratamento com Tg ou Tm, com viabilidade celular reduzida (Suplemento Fig. 1D), enquanto que a superexpressão do DDRGK1 promoveu a sobrevivência celular após o tratamento com Tg ou Tm (Suplemento Fig. 1E). Em conjunto, nossos resultados sugerem que o DDRGK1 tem um papel vital na regulação da homoostase das ER.

(a). As células HepG2 foram transfectadas com siRNA de controle ou com siRNA contra DDRGK1 durante 72 h, e depois as células foram tratadas com DMSO (controle veicular) ou Tg (2,5 μM) durante 24 h antes da colheita. As células foram coradas com Annexin V e PI, seguidas de análise citométrica de fluxo. (b). Quantificação das células apoptóticas (Annexin V+) em a. (c) Análise de Western blot de PARP e caspase-3 clivada nas células HepG2 descritas em a. (d) As células HepG2 foram transfectadas com vetor controle ou DDRGK1 durante 36 h, e as células foram tratadas com DMSO ou Tg (2,5 μM) durante 24 h antes da colheita. As células foram coradas com Annexin V e PI, seguidas por análise citométrica de fluxo. (e) Quantificação das células apoptóticas (Annexin V+) em d. (f) Análise de Western blot analysis of PARP e caspase-3 clivada nas células HepG2 descritas em d. Todos os dados são apresentados como média±s.d. de três experimentos. **P<0,01 e ***P<0,001 pelo teste t de Student.

DDRGK1 modula o UPR

Para entender como o DDRGK1 regula a homeostase de ER, primeiro analisamos as mudanças nos níveis de proteína de três sensores UPR e seus alvos a jusante em células DDRGK1. Os resultados mostraram que a derrubada de DDRGK1 nas células de MCF7 e HepG2 reduziu significativamente os níveis do total IRE1α, mas diminuiu fracamente a fosforilação IRE1α (p-IRE1α), o que pode ser devido aos níveis reduzidos do total IRE1α (Fig. 3a). Os níveis de ATF6 e ATF6 clivado não foram afetados (Fig. 3a). Curiosamente, a derrubada de DDRGK1 não afetou os níveis de PERK total, mas os níveis de PERK fosforilado (p-PERK) e BiP foram significativamente aumentados (Fig. 3a). Examinamos então os efeitos do esgotamento do DDRGK1 sobre o substrato IRE1α XBP1. Os resultados mostraram que a XBP1, uma forma emendada de XBP1, foi significativamente diminuída nas células DDRGK1-knockdown MCF7 de forma dependente do tempo (Fig. 3b), o que foi correlacionado com mudanças nos níveis de proteína de IRE1α (Suplemento Fig. 2A). Além disso, o esgotamento do DDRGK1 aumentou os níveis de eIF2α fosforilação (p-eIF2α) e expressão CHOP tanto nas células MCF7 quanto nas células HepG2 (Suplemento Fig. 2B). Esses resultados indicam que o esgotamento do DDRGK1 reprime a sinalização UPR-IRE1α e ativa a via apoptótica UPR-PERK, o que consequentemente desencadeia a apoptose, como observado nas Figuras 1 e 2. Entretanto, o nível de IRE1α foi aumentado no DDRGK1 sobreexpressor de células de forma dose-dependente (Fig. 3c), enquanto os níveis de p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP e a forma emendada de XBP1 não foram significativamente alterados (Fig. 3c; Suplementar Fig. 2C e D). Para explorar a relação funcional entre DDRGK1 e a UPR, avaliamos as mudanças dinâmicas de IRE1α e PERK em células DDRGK1-knockdown MCF7 e em células de controle após o tratamento com Tg em diferentes pontos de tempo. O tratamento com Tg aumentou os níveis de IRE1α e p-IRE1α, p-PERK e BiP em células de controle, como esperado. Entretanto, os níveis totais de IRE1α diminuíram significativamente (0-24 h), enquanto que os níveis de p-IRE1α diminuíram modestamente (4-24 h) nas células DDRGK1 em comparação com as células de controle (Fig. 3d). Concomitantemente o nível de XBP1s foi diminuído em células DDRGK1 em comparação com células de controle (4-12 h) (Fig. 3e). Os níveis do PERK total não foram alterados, mas o p-PERK foi significativamente aumentado nas células DDRGK1 (0-12 h) (Fig. 3d). Resultados semelhantes foram obtidos nas células HepG2 (Fig. 2E e F suplementares). Em conjunto, nossos resultados sugerem que o esgotamento do DDRGK1 causa IRE1α degradação e ativação do PERK.

(a) As células MCF7 e HepG2 foram transfectadas com siRNA de controle ou siRNA visando DDRGK1 durante 72 h. Os níveis de proteína de p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK, ATF6 e BiP foram determinados pelo western blot. (b) As células MCF7 foram transfectadas com siRNA ou siRNA de controle contra DDRGK1, e as células foram colhidas nos momentos indicados para análise RT-PCR da emenda de XBP-1. (c) As células MCF7 e HepG2 foram transfectadas com vetores controle ou DDRGK1 em várias doses durante 36 h. Os níveis de proteína de p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK e ATF6 foram determinados pelo western blot. (d) As células de MCF7 foram transfectadas com controle de siRNA ou SiRNA visando DDRGK1 durante 72 h. As células foram coletadas para o western blot após o tratamento com 2,5 μM Tg nos horários indicados. (e) Análise RT-PCR da emenda de XBP-1 em d. *Representa banda não específica.

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DDRGK1 regula a UPR através do alvo IRE1α

A UPR é acionada por sensores de estresse ER sobre estresse ER para regular a homoostasia ER8. Tem sido relatado que a eliminação específica de hepatócitos de IRE1α em ratos resultou na ativação da via UPR-PERK23. Para tratar se a indução de p-PERK observada nas células DDRGK1 foi mediada pela diminuição dos níveis de IRE1α, examinamos os níveis de p-PERK, PERK e os seus alvos a jusante nas células destruídas de IRE1α. Os resultados mostraram que a queda de IRE1α aumentou significativamente os níveis de proteína de p-PERK e p-eIF2α nas células MCF7 e HepG2 (Fig. 4a), semelhante aos observados nas células DDRGK1 (Fig. 3a; Suplemento Fig. 2B). Estes resultados indicam que o DDRGK1 regula a UPR, visando IRE1α. Em seguida, investigamos como o DDRGK1 regula IRE1α. Nossos resultados mostraram que os níveis de proteína IRE1α, mas não os níveis de mRNA (Suplemento Fig. 3A), foram drasticamente diminuídos nas células DDRGK1-knockdown (Fig. 3a). O tratamento das células com o inibidor proteasômico MG132 bloqueou a redução mediada por DDRGK1 da proteína IRE1α (Fig. 4b; Suplemento Fig. 3B). Além disso, observamos que o esgotamento do DDRGK1 reduziu drasticamente a meia-vida da IRE1α em um ensaio de ciclo-heximida (Fig. 4c). De acordo com essas observações, observamos que a expressão ectópica de IRE1α melhorou a sobrevivência celular tanto em células DDRGK1 quanto em células MCF7 e HepG2, em comparação com as células controle, caracterizadas pela coloração Anexo em V/PI e ativação da caspase-3 (Fig. 4d,e; Suplemento Fig. 3C e D). No total, estes resultados sugerem que o DDRGK1 regula a estabilidade de IRE1α e assim regula a UPR.

(a). As células MCF7 e HepG2 foram transfectadas com siRNA de controle ou siRNA visando IRE1α durante 72 h. Os níveis de proteína de p-PERK, PERK, p-eIF2α e eIF2α foram determinados pelo western blot. (b). Análise de Western blot de IRE1α em células controle e DDRGK1-knockdown MCF7 tratadas com ou sem MG132 (20 μM, 8 h). (c). Análise de Western blot de IRE1α em controle e células DDRGK1-knockdown MCF7 após tratamento com 100 μg ml-1 ciclo-heximida para os tempos indicados. O gráfico representa a quantificação dos níveis de proteína de IRE1α. (d) As células MCF7 foram transfectadas com siRNA controle ou siRNA visando DDRGK1 durante 72 h. Antes da colheita, as células DDRGK1-knockdown foram transfectadas com vetores controle ou IRE1α durante 36 h. As células foram posteriormente coradas com Annexin V e PI e submetidas à análise citométrica de fluxo, seguida pela quantificação das células apoptóticas (Annexin V+). Todos os dados são apresentados como média±s.d. de três experimentos. *P<0,05 pelo teste t de Student. (e) Análise Western blot de IRE1α em células MCF7 em d.

DDRGK1 interage com IRE1α

Para entender como o DDRGK1 regula a estabilidade de IRE1α, testamos se o DDRGK1 interage com IRE1α através de um ensaio de imunoprecipitação recíproca (IP) em células HEK293T. Os resultados mostraram que o Flag-IRE1α expresso exogenamente interagia especificamente com o DDRGK1 e BiP endógeno (Fig. 5a). De forma consistente, o Flag-DDRGK1 expresso exogenamente interagiu especificamente com o endógeno IRE1α e com a conhecida proteína C53 associada ao DDRGK1 (ref. 14). No entanto, não fomos capazes de detectar BiP nos imunoprecipitados do Flag-DDRGK1 (Fig. 5b), o que sugere que o DDRGK1 pode não interagir diretamente com a BiP. IRE1α, como um substrato endógeno de degradação associada à ER (ERAD), é degradado através da associação entre IRE1α e o complexo Sel1L-Hrd1 ERAD de uma forma dependente da BiP24. Portanto, examinamos se a BiP está envolvida na interação entre o DDRGK1 e IRE1α. Os resultados mostraram que a interação entre o DDRGK1 e IRE1α não foi afetada pela derrubada da BiP (Fig. 4 Suplementar). Para confirmar ainda mais a interação do DDRGK1 com IRE1α, realizamos experimentos de coloração por imunofluorescência. Os resultados mostraram que estas duas proteínas co-localizaram-se nas Urgências (Fig. 5c). Para mapear a região envolvida na interação do IRE1α com o DDRGK1, nós co-transferimos mutantes tipo Flag-IRE1α e truncamento do tipo selvagem juntamente com o DDRGK1 em células HEK293T, e os resultados da IP mostraram que o domínio citoplasmático cinase do IRE1α foi necessário para sua interação com o DDRGK1 (Fig. 5d). Para entender as mudanças dinâmicas na interação entre DDRGK1 e IRE1α sob condições de estresse ER, células HEK293T foram transfectadas com Flag-DDRGK1 e tratadas com Tg em diferentes pontos de tempo. Como esperado, observamos que no total IRE1α, p-IRE1α e BiP foram significativamente aumentadas sob estresse de ER. Curiosamente, observamos que o DDRGK1 interagiu especificamente com o não fosforilado IRE1α, mas não com p-IRE1α, nos imunoprecipitados (Fig. 5e). Estes resultados sugerem que o DDRGK1 interage e mantém a estabilidade dos não-fosforados IRE1α.

(a). Análise Western blot de imunoprecipitados de gel de afinidade Flag M2 em células HEK293T transfectadas com vectores Flag-Vector ou Flag-IRE1α durante 36 h. (b). Análise Western blot de imunoprecipitados de gel de afinidade Flag M2 em células HEK293T transfectadas com Flag-Vector ou Flag-DDRGK1 durante 36 h. (c). As células MCF7 foram imunodeprimidas duplamente com anticorpo anti-DDRGK1 (verde) e anticorpo anti-IRE1α (vermelho). Os núcleos celulares foram contra-manchados com DAPI (azul). A co-localização entre as duas proteínas endógenas DDRGK1 e IRE1α é mostrada no painel de fusão. Barra de escalas, 20 μm. (d) Esquemas de IRE1α construções do tipo selvagem e truncado e análise de manchas ocidentais dos imunoprecipitados em gel de afinidade Flag M2 em células HEK293T transfectadas com Flag-Vector ou Flag-IRE1α do tipo selvagem e truncados. (e) Análise Western blot analysis of Flag M2 affinity gel immunoprecipitates in mock-or Tg-treated (2.5 μM) Células HEK293T expressando Flag-Vector ou Flag-DDRGK1.

Ufm1 é necessário para a interação do DDRGK1 e IRE1α

Um estudo recente demonstrou que o DDRGK1 é um substrato de ufmilação e é necessário para a ufmilação ASC115,20. Para investigar se a ufmilação está envolvida na regulação da estabilidade de IRE1α pelo DDRGK1, examinamos se o esgotamento da ufmilação afeta a expressão da proteína IRE1α. Semelhante ao esgotamento do DDRGK1, observamos que a derrubada da expressão Ufm1 reduziu drasticamente os níveis da proteína IRE1α (Fig. 6a), indicando que o DDRGK1 regula IRE1α através da ufmilação. Consistentemente, observamos que a superexpressão do DDRGK1 não estabilizou a proteína IRE1α nas células Ufm1-knockdown MCF7 em comparação com as células de controle (Fig. 6b). Além disso, os níveis da proteína IRE1α foram drasticamente reduzidos nas células Ufm1-knockdown MCF7 tanto na ausência como na presença de Tg (Fig. 6c), o que sugere que a ufmilação é necessária para a regulação da estabilidade da proteína IRE1α pelo DDRGK1. Nós então nos perguntamos se IRE1α está sujeito à modificação da ufmilação. Para abordar esta questão, detectamos a ufmylação de IRE1α em células que expressam DDRGK1 e Ufm1 bem como UBA5 (E1), UFC1 (E2) e UFL1 (E3), como descrito anteriormente20. Entretanto, não conseguimos detectar nenhuma ufmilação da proteína IRE1α, embora a ufilação da proteína DDRGK1 fosse facilmente detectável, como descrito anteriormente (dados não mostrados)15,20,25, sugerindo que IRE1α pode não ser um alvo de ufmilação. Curiosamente, descobrimos que a associação entre DDRGK1 e IRE1α foi significativamente reduzida nas células Ufm1-knockdown HEK293T em comparação com as células de controle (Fig. 6d). Em consonância com esta observação, verificamos que a interação do DDRGK1 K267R (um DDRGK1 mutante deficiente em ufmilação, no qual o resíduo de lisina 267 foi substituído por um resíduo de arginina)15 com IRE1α foi drasticamente reduzida em comparação com o DDRGK1 do tipo selvagem (Fig. 6e), indicando que a ufmilação do DDRGK1 é necessária para a associação entre DDRGK1 e IRE1α. Além disso, o DDRGK1 K267R não estabilizou a proteína IRE1α em comparação com o DDRGK1 do tipo selvagem (Fig. 6f). Em conjunto, estes resultados sugerem que a ufmilação do DDRGK1 em K267 é necessária para sua interação com IRE1α e a regulação da estabilidade protéica de IRE1α.

(a) As células MCF7 foram transfectadas com siRNA de controle ou siRNA visando Ufm1 por 72 h. Os níveis de proteína de IRE1α foram determinados pelo western blot. (b) Análise de Western blot de IRE1α em células MCF7 controle e Ufm1-knockdown, expressando vetores ou DDRGK1. (c) O nível proteico de IRE1α foi determinado por Western blot em células controle e Ufm1-knockdown MCF7 após tratamento com 2,5 μM Tg para os tempos indicados. (d) A análise Western blot analysis of Flag M2 affinity gel immunoprecipitates in HEK293T control and Ufm1-knockdown cells express Flag-Vector or Flag-DDRGK1. (e) Análise Western blot de imunoprecipitados em gel de afinidade Flag M2 em células HEK293T transfectadas com Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT ou K267R mutante. (f) Análise Western blot de IRE1α em células MCF7 transfectadas com Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT ou K267R mutante.

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DDRGK1 é necessário para a capacidade de reconstituição HSC em ratos

Um estudo recente sugeriu que as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) são extremamente sensíveis ao stress das ER26. Isto levou-nos a especular que o DDRGK1 pode ser crítico na função HSC. Nós primeiro determinamos o nível de expressão do DDRGK1 em várias linhagens hematopoiéticas de camundongos de 2 meses de idade do tipo selvagem. Q-PCR revelou um nível significativamente maior de expressão do DDRGK1 em HSCs, incluindo HSCs de longo prazo (LT-HSCs), HSCs de curto prazo (ST-HSCs) e progenitores multipotentes (MPPs) (Fig. 7a). Além disso, o nível proteico do DDRGK1 foi altamente expresso em células Lineage-c-Kit+ medula óssea (BM) enriquecidas com células Lineage+c-Kit- BM (Fig. 7b). Estas observações sugerem um papel importante do DDRGK1 nas células-tronco. Para examinar o papel do DDRGK1 na função HSC, experimentos competitivos de transplante foram realizados com HSCs após a derrubada lentiviral do DDRGK1 (Fig. 7c). As células Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) de ratos CD45.1 doadores foram transduzidas com o lentivírus controle ou DDRGK1-knockdown e transplantadas em ratos CD45.2 receptores letais irradiados. A análise citométrica de fluxo mostrou que a porcentagem de células derivadas do sangue periférico (PB) doador foi significativamente reduzida no grupo DDRGK1-knockdown comparado com o controle, indicando que o knockdown do DDRGK1 prejudicou significativamente a capacidade de reconstituição competitiva dos HSCs (Fig. 7d). Enquanto em um experimento de transplante não competitivo, os camundongos receptores transplantados com DDRGK1-knockdown HSC ainda estavam vivos 3 meses após o transplante, isto sugere que o knockdown do DDRGK1 estava apenas comprometendo a capacidade de reconstituição competitiva das HSCs. Para excluir efeitos fora do alvo, desenhamos outro shRNA visando o DDRGK1 e observamos resultados semelhantes (Fig. 5A Suplementar). Três meses após o transplante, os camundongos receptores foram eutanizados para análise de BM e ensaios in vitro de formação de colônias. A análise citométrica de fluxo mostrou que a derrubada do DDRGK1 prejudicou drasticamente a manutenção das HSCs transduzidas sem afetar seu potencial de linhagem (ou seja, mielóide, células B e linhagens de células T), como indicado por uma diminuição da freqüência de células hematopoiéticas derivadas do doador e células progenitoras, bem como células hematopoiéticas diferenciadas na BM e PB (Fig. 7e). Um resultado semelhante foi observado em um experimento independente usando outro shRNA visando o DDRGK1 (Suplemento Fig. 5B). Além disso, isolamos células CD34-Flt3-LSK derivadas do doador (LT-HSCs) dos ratos receptores e realizamos um ensaio de formação de colônias de células únicas. Os resultados mostraram que a derrubada do DDRGK1 prejudicou a capacidade das HSCs de formar colônias intermediárias e grandes (Fig. 7f). No total, estes dados sugerem que o DDRGK1 é necessário para a manutenção da função HSC.

(a) Análise Q-PCR dos níveis relativos de expressão de mRNA do DDRGK1 nas subpopulações indicadas de Ratos jovens do tipo selvagem (2 meses de idade, n=3). A expressão relativa do DDRGK1 foi normalizada para GAPDH. Os dados são apresentados como média±s.d. (b) Análise de Western blot do DDRGK1 em células enriquecidas de Lineage+ c-Kit- e Lineage- c-Kit+ de camundongos jovens do tipo selvagem (2 meses de idade). (c) Esquema experimental para o ensaio de reconstituição. (d) Padrão representativo FACS mostrando a porcentagem de células GFP-positivas em células PB (Painel esquerdo). Os valores representam as porcentagens normalizadas de células GFP+ derivadas do doador no total de células de controle (painel direito, n=3). Os dados são apresentados como média±s.d. **P<0,01 e ***P<0,001 pelo teste t de Student. (e) Os valores representam as percentagens de células GFP+ derivadas de doadores em LT-HSC (CD34-Flt3- LSK), ST-HSC (CD34+Flt3- LSK), MPP (CD34+Flt3+ LSK), CMP (CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B, T e populações de células da linhagem mielóide na BM de ratos receptores primários 12 semanas após o transplante (n=3). Os dados são apresentados como média±s.d. ***P<0,001 pelo teste t de Student. (f) GFP+ LT-HSCs derivadas de um doador único de camundongos receptores foram classificadas em placas de 96 poços e cultivadas por 14 dias in vitro. A percentagem de colónias foi calculada dividindo o número de colónias pelo número original de células únicas que foram semeadas. Os dados são apresentados como média±s.d. **P<0,01 pelo teste t de Student.

Para examinar se a função HSC prejudicada foi por causa da redução da eficiência de homing, rotulamos as células LSK de controle ou sh-DDRGK1 lentiviral transduzidas purificadas de camundongos de 2 meses com corante fluorescente (violeta), e as injetamos em recipientes letais irradiados. A percentagem de células LSK rotuladas presentes no receptor BM 18 h após o transplante foi analisada por citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a capacidade de homing das células DDRGK-knockdown LSK era comparável à das células controle (Suplemento Fig. 6A e B). Para determinar se o DDRGK1 teve efeito no estado do ciclo celular das células LSK, coramos células controle derivadas do doador e células DDRGK1-knockdown LSK com o marcador de proliferação Ki67 e DAPI e não encontramos diferença significativa no perfil do ciclo celular entre DDRGK1-knockdown HSCs e HSCs controle (Suplemento Fig. 7A). Examinamos então o efeito do DDRGK1-knockdown na apoptose de HSCs usando a coloração Annexin V e encontramos uma frequência significativamente maior de apoptose em células DDRGK1-knockdown LSK derivadas do doador em comparação com células LSK controle; este fenômeno foi observado com ambas as shRNAs visando DDRGK1 (Fig. 8a; Suplemento Fig. 7B). A seguir, examinamos os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas HSCs transduzidas. Os resultados mostraram que o nível de ROS era comparável entre os grupos controle e DDRGK1-knockdown (Suplemento Fig. 7C). Com base nas observações acima, concluímos que o knockdown do DDRGK1 nos HSCs induziu a morte apoptótica das células, prejudicando a função HSC.

(a) Padrão representativo FACS mostrando a porcentagem de células Anexo em V-positivas dentro do controle derivado do doador e células DDRGK1-knockdown LSK após o transplante (Painel esquerdo). O gráfico de barras mostra a percentagem de células Anexoin V-positivas dentro das células LSK (painel direito, n=3). Os dados são apresentados como média±s.d. *P<0,05 pelo teste t de Student. (b) Análise Q-PCR dos níveis relativos de expressão do mRNA do DDRGK1, BiP e CHOP no controle derivado de doadores e células DDRGK1-knockdown LSK após transplante (n=3). Os dados são apresentados como média±s.d. **P<0,01 e ***P<0,001 pelo teste t de Student. (c) Análise de Western blot analysis de p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK e ATF6 em células GFP+Lineage-c-Kit+ doadoras, enriquecidas a partir de ratos receptores de controle ou DDRGK1-knockdown. *Representa banda não específica. (d) Análise RT-PCR de emendas XBP-1 em células LSK derivadas de controle doador e células DDRGK1-knockdown LSK após transplante. Células MEF com tratamento Tg serviram como controle de emenda do XBP-1.

Para investigar se a função HSC prejudicada foi devido à ativação da resposta de estresse ER em HSCs DDRGK1-knockdown, analisamos os níveis de expressão de BiP e CHOP por Q-PCR no controle e DDRGK-knockdown gravados em HSCs, os resultados mostraram que os níveis de mRNA de BiP e CHOP foram significativamente aumentados em HSCs DDRGK1-knockdown (Fig. 8b). Além disso, examinamos os níveis de proteína dos sensores de estresse ER no controle e nas células DDRGK-knockdown Lineage-c-Kit+ BM. De acordo com a observação nas linhas celulares cancerígenas, o knockdown do DDRGK1 mostrou uma diminuição dos níveis proteicos de IRE1α e p-IRE1α e um aumento do nível de p-PERK, enquanto os níveis de ATF6 não diferiram nos grupos controle e DDRGK1-knockdown (Fig. 8c). Consistentemente, o nível de XBP1s foi reduzido em células DDRGK1-knockdown LSK derivadas de doadores (Fig. 8d). Em conjunto, estes resultados indicam que o DDRGK1 prejudicou a sinalização IRE1α, mas activou o caminho PERK e apoia ainda mais que o DDRGK1 é crítico para a manutenção adequada da homeostase das ER e, portanto, essencial para a sobrevivência e manutenção das HSCs.