- IFN-γ Optimização do ensaio ELISpot após estimulação PBMC com antigénios T-activated® IE-1 e pp65 CMV
- Linearidade e precisão do ensaio ELISpot otimizado de CMV
- Validação do ensaio técnico: definição de um corte de positividade
- Validação do ensaio funcional: Os antígenos ativados em T estimulam um amplo espectro de células efetoras do VMC clinicamente relevantes
IFN-γ Optimização do ensaio ELISpot após estimulação PBMC com antigénios T-activated® IE-1 e pp65 CMV
PBMC isolados a fresco foram usados para o ensaio ELISpot. Para evitar perdas na funcionalidade das células T, por exemplo devido aos granulócitos activados, foram processadas amostras de sangue heparinizado sem mais aditivos dentro de 8 h. Foi escolhido um número total de 2 × 105 PBMC por poço para o desenvolvimento do protocolo do ensaio ELISpot, uma vez que esta contagem de células está abaixo da confluência e pode normalmente ser obtida a partir de amostras de menos de 15 ml de sangue total. A proteína CMV IE-1 imediata e a proteína tegumentar tardia pp65 representam antígenos de células T imunodominantes bem caracterizados. O IE-1 completo e um fragmento terminal de 181 aminoácidos C-terminal de pp65 foram produzidos e formulados na presença de ureia (T-activation®) para aumentar a sua capacidade de estimulação para diferentes tipos de células CMV-reactivas ou células da imunidade mediada por células. A concentração ótima do antígeno T-activated® foi primeiramente determinada pela realização de experimentos dose-resposta. PBMC recém isolado de um doador seropositivo do CMV saudável foi estimulado com 31,6 fg/ml a 31,6 μg/ml T-activated® pp65 ou com 0,01 a 31,6 μg/ml T-activated® IE-1, e o número de células secretoras de IFN-γ foi determinado pelo IFN-γ ELISpot. O T-activated® pp65 revelou uma capacidade muito mais forte para estimular as células secretoras de IFN-γ do que o T-activated® IE-1, atingindo um planalto de resposta entre 0,316 e 3,16 ng/ml pp65 vs. aproximadamente 31,6 μg/ml para o IE-1 (Fig. 1). Assim, as concentrações de antígeno T-activated® de 3 μg/ml pp65 e 15 μg/ml IE-1 foram selecionadas para estimulações adicionais de PBMC e ensaios ELISpot.
Asensibilidade e especificidade do ensaio foram determinadas pela estimulação de PBMC isolados a partir de 10 doadores saudáveis seropositivos e seronegativos CMV com as concentrações definidas de antígeno pp65 e IE-1 T-activated®. O número de células efetoras reativas foi quantificado por IFN-γ ELISpot. A estimulação significativa foi definida usando um teste Mann-Whitney U-Test como uma diferença estatisticamente significativa entre os valores de SFC de condições não estimuladas e CMV estimuladas por antígenos (cada um em quadruplicado). O T-activated® pp65 e o IE-1 induziram uma ativação significativa de células efetoras responsivas em 10 de 10 e 9 de 10 preparações PBMC de doadores individuais seropositivos para CMV, respectivamente (Fig. 2). Neste coletivo, o T-activated® pp65 mostrou uma capacidade global maior para ativar células responsivas com uma mediana de 399 SFC/200.000 PBMC (faixa de 12-864 SFC/200.000 PBMC), comparado ao T-activated® IE-1 com uma mediana de 26 SFC/200.000 PBMC (faixa de 1,3-96 SFC/200.000 PBMC). No entanto, uma resposta substancial de até 96 SFC/200.000 PBMC foi detectada em resposta ao T-activated® IE-1 em amostras individuais de doadores seropositivos CMV (Fig. 2). Todas as 10 amostras de PBMC (100%) de diferentes doadores de VMC-seropositivos apresentaram resultados negativos após estimulação com pp65 (mediana 0,3 SFC/200.000 PBMC; intervalo 0-2,8), enquanto 9 em cada 10 (90%) amostras de PBMC de indivíduos com VMC-seropositivos foram negativas após estimulação com IE-1 (mediana 2,9 SFC/200.000 PBMC; intervalo 0,3-6,8). A contagem de pontos dentro da PBMC estimulada com VMC-seronega IE-1 foi maior que na PBMC estimulada com VMC-seronega pp65, mas não excedeu 7 SFC/200.000 PBMC (Fig. 2).
Determinação da sensibilidade e especificidade do ensaio. PBMC a partir de 10 cada doador de sangue saudável seropositivo e VMC negativo foram deixados sem estímulo (neg.) ou foram estimulados com os ensaios ELISpot T-activated® pp65 ou IE-1 e IFN-γ foram realizados como antes. Os valores médios de SFC por 200.000 PBMC de 4 réplicas são mostrados como gráficos de caixa. Os valores medianos (linhas pretas horizontais) são indicados entre parênteses. As escalas do eixo Y foram ajustadas em cada gráfico para melhor resolução das contagens de SFC. A mediana da idade e faixa de idade dos sujeitos seronegativos CMV e seropositivos CMV foi de 28 (24-53) e 31 (23-56) anos. A distribuição de gênero nos grupos VMC-seronegativo (30% masculino e 70% feminino) e VMC-seropositivo (25% masculino e 75% feminino) foi comparável. As diferenças entre as condições não estimuladas e estimuladas foram testadas usando o teste não paramétrico de duas faces Mann-Whitney U (MWU). Os valores de P< 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
IFN-γ mostrou ser secretado continuamente durante a estimulação antigênica. Assim, a intensidade do sinal no ELISpot IFN-γ depende da duração da estimulação. A duração da estimulação antigênica no ELISpot IFN-γ relatada na literatura geralmente varia de 16 a 24 h . Para abordar a influência do tempo de incubação nos resultados dos testes, ELISpot IFN-γ foram realizados em PBMC a partir de 3 doadores saudáveis independentes de VMC após estimulação com antígenos T-activated® pp65 e IE-1 para 17, 19 e 21 h. Não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas nos números de SFC entre as 3 condições (Fig. 3), demonstrando a estabilidade do sinal neste intervalo de tempo. Assim, foi escolhido um tempo de incubação de 19 h para o ensaio ELISpot otimizado.
Efeito da duração da estimulação antigênica nos resultados do teste ELISpot IFN-γ. A contagem de SFC (média de quatro réplicas) no ELISpot IFN-γ após a estimulação de amostras PBMC de três doadores saudáveis seropositivos de VMC (d120, 32 anos de idade, homem; d254, 62 anos de idade, mulher; d270, 22 anos de idade, mulher) com T-activated® IE-1 ou pp65 para 17, 19 e 21 h. PBMC não estimulado (neg.) foram usados como controle negativo. As diferenças entre as durações de estimulação foram testadas usando o teste ANOVA Kruskal-Wallis não paramétrico de duas faces (*P < 0,05). Valores de P< 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Numeras variáveis de protocolo podem afetar os resultados do teste ELISpot. Por exemplo, o meio usado para cultura primária de células frequentemente inclui soro que contém várias moléculas bioactivas não caracterizadas dependentes de lote em diferentes concentrações . A fim de definir condições padronizadas de cultura de células, foi investigado o impacto no desempenho do ensaio de diferentes meios contendo soro (RPMI 1640 suplementado com 5% de FCS, AB humano, NTA sintético ou NTS sintético) e de meios livres de soro (AIM-V®, UltraCulture). Os meios livres de soro produziram as melhores respostas celulares efetoras, comparáveis às do RPMI 1640 suplementado com 5% de FCS (Fig. 4a). Além disso, o AIM-V® exibiu os menores sinais de fundo em condições não estimuladas (Fig. 4b), maximizando assim a relação sinal/ruído. Consequentemente, o protocolo ELISpot foi estabelecido usando o meio livre de soro AIM-V®.
Avaliação de diferentes meios de cultura celular sobre o desempenho do IFN-γ ELISpot. Um diagrama de Boxplot mostrando os resultados do ELISpot na estimulação de PBMC de 10 doadores de sangue saudáveis seropositivos (mediana de idade e faixa de 31 (26-54) anos; 40% homens e 60% mulheres) com T-activated® pp65 em vários meios de cultura celular. Os valores medianos (linhas pretas horizontais) estão indicados entre parênteses. As diferenças entre as condições médias entre as condições estimuladas foram testadas usando o teste ANOVA Kruskal-Wallis não paramétrico de duas faces (p = 0,613). b Os resultados do ELISpot das células não estimuladas incubadas em AIM-V ou em meios livres de soro UltraCulture (UC) são mostrados separadamente com uma escala expandida do eixo Y. As diferenças entre ambas as condições foram testadas utilizando o teste não paramétrico de dois lados MWU (p = 0,074). Valores de P< 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os meios contendo soro foram compostos de RPMI 1640 suplementados com soro a 5% (R5): FCS, NTA, NTS ou AB humano (hAB)
Os ensaios de ELISpot podem ser realizados com vários materiais de membrana, incluindo nitrocelulose (NC), éster de celulose misturada (MCE) e fluoreto de polivinilideno (PVDF). Comparamos os resultados do IFN-γ ELISpot de amostras de PBMC de seis indivíduos saudáveis (quatro réplicas cada, duas preparações por doador) empregando as placas MCE, placas PVDF e tiras PVDF mais comumente usadas da Millipore (Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). As membranas PVDF requerem uma etapa de ativação com etanol antes da ligação do anticorpo de captura. Além disso, etapas de lavagem mais rigorosas antes do desenvolvimento do ponto foram necessárias utilizando placas baseadas em PVDF em comparação com placas MCE, para evitar a indesejável coloração do fundo das membranas. Entretanto, a resolução das manchas detectadas em termos de nitidez e homogeneidade foi melhorada nas membranas PVDF (não mostradas), resultando em maior contagem de manchas em comparação com as membranas MCE (até 10 vezes mais no caso de estimulações IE-1, com um SFC mediano de 155 vs. 13/200.000 PBMC, respectivamente; Fig. 5). Como as tiras de poços PVDF 8 foram mais performantes e porque seu uso poderia permitir custos reduzidos, em particular quando amostras de um único paciente são testadas na rotina clínica, o formato de tiras PVDF 8 foi escolhido para o desenvolvimento otimizado do ensaio.
Comparação do desempenho do ELISpot IFN-γ usando diferentes placas de microtitulação. Os ELISpot foram realizados usando PBMC de três doadores saudáveis seropositivos CMV (duas preparações cada, ELISpot em quadruplicado, executado duas vezes) em vários materiais de placas de microtitulação (placa MCE, placa PVDF, tiras PVDF). A idade (sexo) dos doadores foi de 32 (masculino), 33 (masculino) e 51 (feminino). Os valores de SFC por 200.000 PBMC são mostrados como gráficos de caixa para PBMC não estimulado (neg.), e para PBMC estimulado com T-activated® IE-1- e pp65. Os valores medianos (linhas pretas horizontais) são indicados entre parênteses. As diferenças entre os materiais das placas de microtitulação foram testadas usando o teste ANOVA Kruskal-Wallis não paramétrico de duas faces (**P < 0,01; ***P < 0,001)
O revestimento otimizado das placas de microtitulação com anticorpos de captura é crucial para um desempenho robusto do ensaio. A densidade do anticorpo de captura IFN-γ ligado à membrana PVDF não deve ser limitativa e, em particular, deve permitir a detecção confiável de altas contagens de pontos. As tiras de PVDF foram revestidas com concentrações crescentes (2,5 a 7,5 μg/ml) de anticorpo anti-IFN-γ. PBMC de cinco doadores seropositivos CMV foram semeados nos poços revestidos e deixados sem estímulo ou estimulados com T-activated® IE-1 ou pp65. Na faixa de 2,5 a 7,5 μg/ml, o aumento da concentração de anticorpos não teve efeito na coloração de fundo em PBMC não estimulado (SFC mediana de 0 a 0,5/200,000 PBMC independentemente da concentração de anticorpos capturados por IFN-γ; Figs. 6a-b). Da mesma forma, os níveis de SFC baixos a moderados específicos do IE-1 (mediana de 19 a 26 de SFC/200.000 PBMC) foram comparáveis em todas as condições de anticorpos de revestimento (Fig. 6a). O mesmo foi verdadeiro para as respostas específicas de pp65 até ~300 SFC/200.000 PBMC (doadores d032, d120 e d241; Fig. 6c). Em contraste, em doadores individuais com maior contagem de pontos (por exemplo, d172, d202; Fig. 6c), a detecção de células reativas pp65 aumentou de forma dose-dependente com a concentração de anticorpos de captura IFN-γ usados para revestimento, especialmente entre 2,5 e 5 μg/ml de anticorpos. Em concentrações de anticorpos de 5 μg/ml e superiores, as contagens de manchas permaneceram estáveis (Figs. 6b-c). Baseado nestes resultados, uma concentração de 5 μg/ml de anticorpo de captura IFN-γ foi escolhida para revestimento no protocolo ELISpot otimizado.>
Os ensaiosELISpot dependem da detecção de citocinas capturadas por anticorpos específicos da citocina, que podem ser directamente acoplados a uma enzima repórter (desenvolvimento do ensaio em uma etapa), como a fosfatase alcalina (AP), ou uma combinação de um anticorpo secundário biotinilado e uma enzima repórter conjugada com estreptavidina (desenvolvimento do ensaio em duas etapas). Um desenvolvimento de ensaio em uma etapa economiza tempo de manuseio e evita erros do operador. O mAb conjugado com AP (7-B6-1) (MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Alemanha) foi usado como conjugado de detecção para o protocolo padronizado ELISpot. Foram testados diferentes parâmetros de incubação (por exemplo, 0,5 – 3 h a 37 °C, 2 h à temperatura ambiente). As contagens de pontos foram comparáveis em todas as condições. No entanto, a morfologia das manchas e, portanto, a detecção adequada foi melhor na incubação com o conjugado AP durante 2 h à RT, em comparação com outras condições (não mostradas). O aumento na concentração do conjugado de detecção de 0,025 para 0,4 U/ml resultou em valores medianos de SFC ligeiramente elevados para pp65, e as contagens máximas de pontos excederam as geradas pelo desenvolvimento do ensaio em dois passos (não mostrado). Portanto, um desenvolvimento do ensaio em um passo por 2 h no RT com conjugado de detecção de 0,4 U/ml foi escolhido.
Finalmente, a padronização da reação de coloração do SFC foi direcionada para a otimização completa do ensaio. A duração da incubação com o substrato AP afeta o tamanho da mancha e/ou o nível de fundo, sendo assim crítica para uma contagem confiável da mancha. Um substrato de fosfatase alcalina cromogênica NBT/BCIP (Thermo Fischer Scientific, Waltham, EUA) foi utilizado como solução de coloração, e tempos de incubação variando de 2 a 13 min no escuro foram avaliados. As contagens de SFC foram comparáveis em todas as condições. Entretanto, tempos de incubação mais curtos resultaram em menor diâmetro da mancha, enquanto que tempos de incubação mais longos produziram níveis de fundo melhorados (dados não mostrados). Portanto, uma duração de coloração de seis minutos no escuro foi definida para o protocolo ELISpot otimizado.
Linearidade e precisão do ensaio ELISpot otimizado de CMV
O protocolo ELISpot otimizado foi usado para determinar a faixa de trabalho do PBMC que assegura a linearidade do ensaio. PBMC de um doador seropositivo CMV saudável foram semeadas a uma densidade que varia de 2 × 104 a 2,5 × 105 PBMC por poço. Para números de células entre 6 × 104 e 2 × 105 PBMC por poço, as contagens ELISpot foram diretamente proporcionais ao número de PBMC semeados, após estimulação com IE-1 (análise de regressão linear; R2 = 0,97) ou pp65 (R2 = 0,99) (Fig. 7a). Devido à contagem de pontos geralmente mais baixa resultante da estimulação IE-1, o uso de 2 × 105 PBMC por poço foi escolhido para o ensaio ELISpot padronizado, para garantir valores SFC suficientes.
IFN-γ Linearidade do ensaio ELISpot. um intervalo de trabalho de PBMC por ensaio ELISpot. Um número crescente de PBMC a partir de um doador seropositivo CMV saudável foi semeado por poço e os ensaios ELISpot foram realizados como descrito, após estimulação com T-activated® IE-1 ou pp65. Os valores médios de SFC e o desvio padrão obtido para 60.000-200.000 PBMC por poço são retratados. A escala dos eixos Y foi ajustada para pp65 (esquerda) e IE-1 (direita) para uma melhor resolução dos dados. b Linearidade entre o número de PBMC reativos CMV e o SFC enumerado. Os números indicados de PBMC de um doador saudável seropositivo CMV foram misturados com PBMC de um doador seronegativo CMV (até 200.000 PBMC totais) e estimulados com antígeno T-activated® pp65 de acordo com o protocolo optimizado. Os valores médios de SFC e o desvio padrão das medidas quadruplicadas são mostrados para dois pares de doadores (d034 + d219, d204 + d067). Em ambos os painéis, foram geradas linhas de regressão e correspondente coeficiente de determinação R2 usando a ferramenta de linha de regressão do Prisma GraphPad 5.04
Para verificar ainda mais a linearidade entre o número de células efetoras reativas do VMC e o SFC enumerado, foram semeados números crescentes de PBMC de um doador soropositivo do VMC e o número total de PBMC foi ajustado para 2 x 105 por poço usando PBMC de um doador soropositivo do VMC. Dois pares de doadores (d034 + d219, d204 + d067) que não mostraram alo-reactividade numa co-cultura de 19-h foram escolhidos para estas experiências. Devido aos baixos números de SFC (abaixo de 20 SFC/200.000 PBMC), os resultados da estimulação IE-1 mostraram maior variabilidade em relação à pp65 e não permitiram um cálculo de linearidade confiável (valores de R2 abaixo de 0,96; dados não mostrados). Os resultados do ensaio ELISpot após estimulação pp65 mostraram uma boa correlação linear para ambos os pares de doadores, com valores de R2 de 0,99 (d034 + d219) e 0,98 (d204 + d067) na análise de regressão linear (Fig. 7b).
Precisão e repetibilidade do ensaio otimizado foram avaliados através do cálculo da variabilidade intra-ensaio, inter-ensaio, inter-operador e inter-site. Em cada caso, PBMC de três doadores soropositivos em VMC foram testados em quadruplicata, e a variabilidade foi avaliada através do cálculo do coeficiente de variação (CV), definido como a razão entre o desvio padrão e a média. O CV para valores ELISpot < 10 SFC/200.000 PBMC não foram calculados (veja o cálculo do corte de positividade abaixo). O CV intra-ensaio atingiu 14% para estimulação IE-1 e 6% para estimulação pp65 (arquivo adicional 1: Tabela S1). O CV intra-ensaio não excedeu 17% para o IE-1 e 22% para a estimulação pp65 (Arquivo Adicional 1: Tabela S2). O CV inter-operador estava abaixo de 13% e 18% para o IE-1 e pp65 respectivamente (Arquivo Adicional 1: Tabela S3). Finalmente, a variação entre locais, que é essencial para a validação do ensaio para fins de diagnóstico, foi avaliada. Amostras de sangue total foram coletadas simultaneamente de três doadores saudáveis de VMC e enviadas (sob condições constantes na RT) para quatro laboratórios diferentes na Alemanha. Os PBMC foram isolados recentemente e os ensaios ELISpot foram realizados de acordo com o protocolo optimizado por um total de 7 operadores. O CV inter-site atingiu um máximo de 39% para IE-1 e de 28% para pp65 (Ficheiro adicional 1: Tabela S4).
Avaliação de pelo menos quatro medições independentes foi recomendada para alcançar resultados estatisticamente significativos no ELISpot . Para abordar a influência das variações intra-replicadas no resultado do ensaio, nós comparamos os resultados do ELISpot de medições em quintuplicado e quadruplicado de cada controle e estimulação antigênica. Não foi encontrada variação significativa dos resultados dos testes (dados não mostrados). Portanto, as medidas quadruplicadas de condições não estimuladas e ativadas em T® IE-1- e pp65 estimuladas permitem confiabilidade do ensaio, bem como praticabilidade em combinação com o uso de tiras de 8 poços.
A enterotoxina estafilocócica B (SEB) é um potente superantigênio, e a fitohemaglutinina (PHA) um potente mitógeno, ambos induzindo a secreção maciça de IFN-γ pelas células T . Assim, a SEB e a PHA são controles positivos adequados para a viabilidade celular, estimulação bem sucedida da secreção de citocinas e funcionalidade geral das células T. Isto é particularmente importante para a interpretação de resultados quando se espera uma baixa frequência de células T, por exemplo, em receptores de transplantes alogénicos de células estaminais. No ensaio ELISpot optimizado, a estimulação das amostras de teste com SEB ou PHA é realizada em duplicado.
Além disso, foi estabelecido um controlo do operador independente das células effector para validar o desempenho adequado do ensaio. Este controle de operador é baseado na detecção de IFN-γ recombinante na incubação direta com o anticorpo de captura imobilizado anti-humano IFN-γ mAb (1-D1K). Este controlo, também realizado em duplicado, deve produzir uma coloração escura homogénea da membrana PVDF.
Validação do ensaio técnico: definição de um corte de positividade
Para facilitar a interpretação dos resultados do ensaio ELISpot IFN-γ e para maximizar a especificidade (isto é, evitar falsos positivos em condições não estimuladas e em condições estimuladas em indivíduos com VMC-seronegativos), foi definido um corte técnico. Os ensaios ELISpot IFN-γ foram realizados de acordo com o protocolo otimizado sobre PBMC de 45 doadores saudáveis, dos quais 32 eram seropositivos a IgG para CMV (Tabela 1).
Median and range of SFC values from unstimulated PBMC of CMV-seronegative and CMV-seropositive individuals were comparable . As contagens pontuais em PBMC estimulado por IE-1 e pp65 de indivíduos seropositivos ao VMC foram baixas . Em indivíduos seropositivos ao VMC, os níveis de SFC em PBMC estimulado por IE-1 e pp65 atingiram 1114 e 954 contagens pontuais/200.000 PBMC (mediana de 22 e 265 respectivamente; Fig. 8). Para a determinação de um corte técnico, foram levadas em consideração as contagens pontuais no controle não estimulado, bem como nas condições estimuladas pelo T-activated® pp65- e IE-1 de indivíduos seropositivos CMV-seronegativos e CMV-seropositivos. O limiar de positividade foi determinado usando-se a estatística z (nível α = 0,05) nos valores médios geométricos log10-transformados. Valores = 0 foram substituídos por valores próximos ao limite de detecção, que foi assumido como sendo 0,5. O desvio padrão (SD) das medidas do ELISpot para o controle não estimulado, estimulação IE-1 e estimulação pp65 foi respectivamente 0,234, 0,192 e 0,136. Considerando um DP de 0,2 e assumindo que 4 réplicas são medidas para cada controle negativo e amostras de teste, foi calculado um critério de que a razão entre a média geométrica dos valores estimulados e não estimulados é de pelo menos 2,5. Por outro lado, foram gerados perfis de precisão a partir dos resultados dos testes específicos IE-1 e pp65, sendo que um coeficiente de variação (CV) não superior a 40% foi utilizado como limite de aceitação da validade do ensaio para determinar o respectivo limite de quantificação (LoQ). Perfis de precisão para resultados ELISpot específicos do IE-1- e pp65 dos 45 doadores saudáveis produziram valores de LoQ de 8,6 e 7,1 respectivamente (Arquivo adicional 2). De notar que uma análise semelhante realizada numa coorte de 124 pacientes em hemodiálise forneceu valores de DP comparáveis dentro de condições não estimuladas e estimuladas por antigénios (intervalo 0,199-0,240) e produziu valores de LoQ de 7,8 (IE-1) e 8,3 (pp65) . Com base nessas análises, um corte de 10 SFC/200.000 PBMC foi escolhido para definir resultados positivos de testes.
Validação do ensaio em doadores imunocompetentes. PBMC isolados de sangue total de 45 doadores saudáveis (Tabela 1) foram testados usando o ELISpot otimizado IFN-γ. Um corte de positividade de 10 SFC/200.000 PBMC (linha a tracejado horizontal cinza) foi definido (ver texto e arquivo adicional 2). Considerando um resultado de teste como positivo quando a média geométrica para pelo menos uma das abordagens estimuladas pelo IE-1 ou pp65 é ≥ 10 SFC/200.000 PBMC e quando a relação entre a média geométrica das condições estimuladas e não estimuladas é ≥ 2.5, concordância positiva (sensibilidade) e concordância negativa (especificidade) dos resultados otimizados do teste ELISpot IFN-γ com a sorologia CMV dentro deste coletivo de doadores saudáveis foi de 97% e 85% respectivamente
Junto, usando antigénios T-activated® pp65 e IE-1 e o ensaio ELISpot optimizado IFN-γ, os resultados dos testes são considerados positivos se a média geométrica das manchas resultantes das estimulações pp65 ou IE1 for ≥ 10 SFC/200,000 PBMC e se a razão entre a média geométrica das condições estimuladas e não estimuladas for ≥ 2.5. De acordo com estas definições, o coletivo de 45 doadores saudáveis (32 CMV IgG-seropositivos, 13 CMV IgG-seronegativos) revelou uma sensibilidade (definida como a concordância positiva com a imunosserologia CMV IgG, usada como procedimento primário de medida de referência) de 97% e uma especificidade (concordância negativa com a imunosserologia CMV IgG) de 85% (Fig. 8).
Validação do ensaio funcional: Os antígenos ativados em T estimulam um amplo espectro de células efetoras do VMC clinicamente relevantes
As proteínas recombinantes (T-activated®) são processadas tanto pelas vias de processamento e apresentação de antígenos exógenos (MHC classe II) quanto endógenos (MHC classe I). A estimulação da PBMC pelas proteínas T-activated® reproduz assim mais de perto uma infecção natural, resultando potencialmente na activação de um largo espectro de células reactivas clinicamente relevantes ao CMV (por exemplo, células Th, CTL, NK, NKT; ), o que pode contribuir para a alta sensibilidade do ensaio ELISpot IFN-γ. Para caracterizar melhor as células visadas pelos antígenos T-activated® IE-1 e pp65 e para investigar a possível variabilidade interindividual na resposta das células efetoras, foram realizadas análises de coloração intracelular IFN-γ e citometria de fluxo paralelamente aos ensaios ELISpot IFN-γ. PBMC recém isolados de seis doadores saudáveis seropositivos de VMC foram estimulados com proteínas T-activated® IE-1 e pp65 para células produtoras de 19 h e células produtoras de IFN-γ enumeradas de acordo com o ensaio ELISpot optimizado. As mesmas preparações PBMC (4 réplicas cada uma) foram estimuladas durante 6 h com o mesmo lote de proteínas T-activated® IE-1 e pp65 na presença de anticorpos co-estimuladores anti-CD28 e anti-CD49d. Os marcadores de superfície (CD3, CD4, CD8, CD56) e a coloração intracelular IFN-γ foram analisados por citometria de fluxo, conforme descrito na seção Métodos. Subpopulações de IFN-γ+ de CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3+CD56+ (tipo NKT) e CD3-CD56+ (NK) linfócitos foram numeradas seguindo a estratégia de datação ilustrada no arquivo adicional 3. Todos os seis doadores diferiram na sua capacidade de obter uma resposta IE-1- e/ou pp65-dependente no ensaio ELISpot IFN-γ. A intensidade da resposta também foi heterogênea entre os seis doadores, com valores variando de 7 a 1.054 SFC (estimulação IE-1) e de 28 a 780 SFC (estimulação pp65) por 200.000 PBMC (Fig. 9a). Da mesma forma, os doadores individuais diferiram na freqüência e relação das várias subpopulações celulares investigadas por citometria de fluxo (Fig. 9b). Curiosamente, indivíduos saudáveis seropositivos para VMC com menor contagem de pontos (d120, d300, d343; Fig. 9a) também mostraram frequências mais baixas de linfócitos IFN-γ+ por citometria de fluxo (Fig. 9b), destacando a capacidade do ensaio ELISpot de distinguir entre os linfócitos de baixa e alta resposta. A ativação de cada subpopulação linfocitária investigada foi detectada em alguns mas não em todos os doadores. Por exemplo, a ativação de células T CD4+ fracas a fortes foi detectada em 4 dos 6 doadores (d120, d172, d300, d343) em resposta ao IE-1, pp65, ou a ambos. Similarmente, 5 de 6 doadores (d172, d290, d300, d343, d361) mostraram ativação de células T CD8+ em uma ou ambas as condições de estimulação. O CD3-CD56+ (células NK) foi aparente em um doador (d120) em resposta a ambos os antígenos. As células CD3+CD56+ (tipo NKT) foram fracamente ativadas em 4 dos 6 indivíduos (d120, d172 d300, d361) em resposta a ambos IE-1 e pp65 (Fig. 9b). Notavelmente, uma forte activação CD4+ específica de pp65 em d172 correlacionada com uma forte resposta específica de pp65 no ELISpot, e uma forte activação CD8+ específica de pp65 (d290) e específica de IE-1 (d361) foi associada a uma alta contagem de pontos no ELISpot correspondente (Fig. 9a-b), sugerindo que estas células CMV-reactivas contribuem significativamente para os sinais detectados no ELISpot. No total, esses dados demonstram a capacidade das proteínas T-activated® IE-1 e pp65 de estimular uma ampla gama de células efetoras específicas do VMC. Estes experimentos também revelaram a alta heterogeneidade de respostas entre indivíduos saudáveis seropositivos ao CMV. Notavelmente, a observação de que alguns indivíduos respondem tanto ao IE-1 quanto ao pp65 enfatiza a importância de avaliar a resposta a ambos os antígenos. A monitorização das respostas específicas do IE-1 e pp65 no ensaio ELISpot optimizado IFN-γ pode melhorar a sensibilidade global do teste.
