Fusão de Junto
Como um primeiro passo para avaliar a aplicabilidade do modelo 3SPN.2 para predizer as propriedades termodinâmicas do nó de Holliday, nós avaliamos as propriedades de fusão de junção a partir de simulações do modelo 3SPN.2 e comparamos com nossos experimentos de absorção. Simulamos o derretimento da junção através da dinâmica molecular de troca de réplicas (REMD, ver métodos) para melhorar a amostragem dos estados parcialmente derretidos. A amostragem precisa da fração relativa das configurações de junção intacta, derretida e parcialmente derretida não é atualmente possível usando uma representação de todas asatomes.
Figure 2 mostra a fração de uma só coluna α como uma função de T sobre uma faixa de concentrações de sal para o modelo 3SPN.2 e medidas de absorvância. Veja os métodos para a definição de α em simulações. A semelhança entre as simulações e os experimentos é surpreendente. Tanto as simulações como os experimentos mostram que a temperatura de fusão aumenta com o aumento da concentração de sal e que a transição se torna cada vez mais acentuada, ou “cooperativa”. Os dados podem ser bem descritos pela lei de ação de massa, ou van’t Hoff relation46,
Propriedades de fusão da junção J34.
Comparação da fração de uma só linha α a partir de (a) simulações e (b) experimentos. Nós ajustamos os dados usando a equação de van’t Hoff (equação 1), indicada pelas linhas sólidas. Seguindo a convenção, definimos TM como a temperatura em que α = 0.5.
onde K é a constante de equilíbrio para a fusão da junção, ΔH e ΔS são a diferença de entalpia e entropia entre a junção fundida e a intacta, que são assumidas como constantes nesta faixa de temperatura e C é a concentração total dos fios (a concentração de cada fio é C/4). Observe que ΔS controla a nitidez da transição derretida. Discutiremos o comportamento de ΔH e ΔS abaixo, que são determinados a partir de dados de encaixe na faixa 0,1<α<0,9,
A temperatura de fusão TM é uma métrica termodinâmica útil da estabilidade da junção e é comumente definida como a temperatura na qual α = 1/2. A Figura 3 mostra os valores experimentais e simulados da TM em função da concentração de sal. Como antecipado a partir das curvas de fusão, as simulações espelham de perto a dependência experimental da TM. A semelhança quantitativa também é notável. Os resultados das simulações são mudados consistentemente para T mais alto em 5 a 8 K, uma diferença de menos de 3%. Para ambos os experimentos e simulações, a temperatura de fusão é quase independente da concentração de sal para ≥ 200 mM. Esta independência está relacionada com a peneiração das interações eletrostáticas em altas concentrações de sal; assim, a Fig. 3 também mostra o comprimento de peneiração Debye usado no modelo 3SPN.2 para a aproximação Debye-Hückel das interações eletrostáticas. O comprimento de peneiramento é <6 Å em altas concentrações de sal, tornando a repulsão eletrostática insignificante. A correspondência entre os valores de TM do experimento e da simulação valida o tratamento aproximado da eletrostática no modelo 3SPN.2. Dado que o modelo 3SPN.2 foi parametrizado apenas para imitar a fusão do B-DNA duplex, os dados de fusão da junção sugerem que o modelo 3SPN.2 é transferível para a termodinâmica de estruturas de DNA mais complexas. Ao mesmo tempo, esta descoberta não é totalmente imprevisível, uma vez que a fusão de cada braço deve ser muito semelhante à do DNA duplex comum.
Dependência da concentração de sal da temperatura de fusão da junção TM.
Em todas as concentrações, a TM difere em <3% entre 3SPN.2 simulações (círculos verdes) e experiências de absorção (diamantes vermelhos). As linhas servem apenas como um guia para o olho. A figura também mostra o comprimento de triagem Debye utilizado pelo modelo 3SPN.2 na aproximação Debye-Hückel às interações eletrostáticas. O platô da temperatura de fusão coincide com uma forte peneiração das interações eletrostáticas.
O ajuste dos dados usando a relação van’t Hoff (equação 1) fornece uma estimativa da entalpia e entropia da fusão. Os valores de ΔH e ΔS deste ajuste são da ordem correta de grandeza que seria esperada com base nos parâmetros termodinâmicos determinados por SantaLucia e colegas de trabalho47,48. A inserção da figura 4 mostra que as simulações superestimam modestamente os valores de ΔH e ΔS, em relação aos experimentos e que ΔH varia quase linearmente com ΔS. Esta relação linear é por vezes referida como uma relação de “compensação”. Na verdade, a equação de van’t Hoff implica uma relação específica entre ΔH e ΔS
Termodinâmica da fusão da junção.
A entropia ΔS e entalpia ΔH de fusão obtida através da adaptação das experiências (diamantes vermelhos) e simulações (círculos verdes) à equação de Van’t Hoff (equação 1). O inset mostra uma relação aproximada de compensação linear de entropia e entalpia. Tanto os dados experimentais quanto os simulados mostram uma melhor concordância com a equação de van’t Hoff avaliada na TM (eq. 2, linha azul).
o que se segue da eq. 1, definindo α = 1/2 na TM. A figura 4 demonstra consistência com essa relação e esclarece que a compensação linear entre ΔH e ΔS é apenas aproximada; se os valores da TM variassem mais significativamente com a concentração, os desvios de linearidade entre ΔH e ΔS seriam mais aparentes, enquanto que a eq. 2 deveria permanecer válida. Mais importante do ponto de vista prático é que esses resultados demonstram a eficácia do modelo 3SPN.2 em reproduzir características energéticas e termodinâmicas das junções que estão de acordo com os dados experimentais.
Abundâncias e Estrutura Conformacional
Para aprofundar a capacidade do modelo 3SPN.2 em predizer as propriedades de junção experimental, examinamos a população relativa de conformações de junções. Experimentalmente, sabe-se que a forma plana aberta é predominante em baixa concentração de sal, e, em maior concentração de sal, as junções adotam conformações empilhadas (Fig. 1). A uma concentração relativamente alta = 50 mM e T = 298 K, as experiências indicam uma abundância relativa de isoformas empilhadas I/II de 23/77%, respectivamente15. Aqui, usamos o modelo 3SPN.2 para examinar uma ampla gama de concentrações de sal em T = 300 K para validar o modelo e fornecer uma previsão para a dependência global da concentração de sal das populações de junção. Note que examinamos o efeito do Na+, ao invés do Mg2+, que produz resultados semelhantes16,45.
Como Thirumalai e colegas de trabalho enfatizaram26, a correspondência entre uma média temporal e a média do conjunto (ergodicidade) para junções de quatro vias pode ser quebrada em escalas temporais observacionais bastante grandes, devido à taxa de conversão entre conformações de junções. Assim, para estimar as populações relativas dos conformadores empilhados, precisamos de um conjunto significativo de simulações. Assim, para cada concentração de sal, realizamos 100 simulações independentes, cada uma a partir da configuração aberta, já que esta conformação se converte rápida e aleatoriamente em iso-I ou iso-II. Cada simulação é executada para 2 μs, produzindo 200 μs de dados totais de trajetória para cada concentração de sal, divididos entre 100 amostras independentes. Isto fornece uma estimativa inicial para a população relativa de cada conformação. Com base nessa estimativa, realizamos mais 100 simulações usando uma proporção de configurações iniciais abertas, iso-I ou iso-II que estão de acordo com a estimativa preliminar da população, para ver se nossos resultados são sensíveis a partir do estado aberto. Descobrimos que as estimativas da população permanecem estáveis dentro da nossa incerteza estatística, de modo que não encontramos nenhum efeito significativo devido a iniciarmos no estado aberto. Nossos resultados são afetados se usarmos todas as configurações iniciais iso-I ou iso-II, devido à inter-conversão relativamente lenta desses estados.
Para avaliar as populações de junção, precisamos identificar uma métrica que distinga com precisão entre as três conformações de junção primária. Experimentalmente, os estudos da FRET normalmente usam a distância entre as extremidades de braços selecionados (que define o ângulo inter-duplex) para distinguir os estados conformacionais. Inicialmente examinamos o ângulo inter-duplex, mas descobrimos (como será discutido mais adiante) que o IDA flutua substancialmente em cada isoforma, tornando difícil distinguir conformações sem ambigüidade. Em vez disso, descobrimos que as separações entre bases perto do coração da junção fornecem um indicador mais confiável da conformação da junção. Essas distâncias também devem ser acessíveis experimentalmente usando um par de análogos de base de nucleotídeos fluorescentes, tais como 6-metil isoxantopterina (6-MI) ou 2-aminopurina, colocados judiciosamente perto do centro da junção. Os painéis inferiores da Fig. 1 mostram as oito bases no centro da junção nos conformadores iso-I e iso-II, assim como a forma aberta. No conformador iso-I, a separação dTT das bases T (nos fios X e H) e a separação dCC das bases C (também nos fios X e H) são muito menores do que as separações dAG das bases A e G (nos fios B e R); no conformador iso-II, o empilhamento inverso leva ao comportamento oposto das distâncias relativas. Na forma aberta, todas estas distâncias são semelhantes, mas maiores que as distâncias dos conformadores iso-I e II empilhados.
Por isso, devemos ser capazes de distinguir entre iso-I e II simplesmente com base nestas separações inter-bases. Para confirmar isto, na Fig. 5 plotamos a distribuição de frequência normalizada das distâncias entre bases P(dTT ∪ dCC) e P(dAG), o que demonstra a presença de dois picos distintos para todas as concentrações ≥50 mM. Para P(dAG) (Fig. 5a), o pico na separação pequena indica os estados de conformação iso-II e o pico na separação maior é devido a conformações iso-I ou abertas. Para P(dTT ∪ dCC) (Fig. 5b), o pico em pequenas distâncias indica os estados iso-I e o pico em distâncias maiores é devido a conformações iso-II ou a conformações abertas. Adotamos um recorte de 12 Å de separação, a localização aproximada do mínimo das distribuições, para distinguir as junções como o conformador empilhado iso-I ou iso-II. As configurações que não são identificadas como iso-I ou II são classificadas como conformantes abertos. Consistente com a expectativa de que a conformação aberta domina em baixa concentração de sal, nenhuma das distribuições tem um pico para pequena separação e assim quase todas as configurações em baixa sal são identificadas com a conformação aberta.
Critério para distinguir conformações de junções.
Distribuição da separação entre bases no meio da junção para (a) as bases AG, onde uma pequena separação identifica o conformador iso-II e (b) os pares TT ou CC, onde uma pequena separação identifica o conformador iso-I. O pico de maior distância em baixa concentração de sal deve-se a conformações abertas; em sal mais alto, surge principalmente a partir da forma complementar empilhada. A linha pontilhada vertical indica o critério de corte que usamos para posteriormente identificar estados conformacionais de configurações individuais.
Usando estes critérios para distinguir conformadores, identificamos configurações individuais com um dos três isômeros e mostramos séries temporais representativas de conformações de junção para cinco simulações a = 300 mM na Fig. 6a. A Figura 7a mostra as configurações representativas destes conformadores. Os dados das séries temporais mostram qualitativamente que a conformação aberta é extremamente curta e atua como um estado de transição entre os conformadores iso-I e iso-II de longa duração. Isto foi previamente inferido a partir de experimentos com uma única molécula8,15,16,50 e, neste estudo, observamos e confirmamos explicitamente o mecanismo de transição entre os estados conformadores de equilíbrio. Demonstramos quantitativamente o papel da conformação aberta como um intermediário, avaliando as nove probabilidades de transição (incluindo transições para a mesma conformação) entre os três conformadores. A Figura 6b mostra que as probabilidades de transição para a Iso I→II e II→I são muito pequenas na escala destas parcelas (zero, dentro da incerteza do nosso cálculo). Conseqüentemente, o único caminho entre os conformadores empilhados é através do conformador aberto, estabelecendo-o como o estado de transição. A Figura 6c mostra como as probabilidades de transição entre as conformações empilhadas e abertas variam com a concentração de sal, com transições para o estado aberto dominando em baixas concentrações de sal. As cinco séries temporais da Figura 6a também demonstram que a média temporal dos dados varia de amostra para amostra. Claramente 2 μs é inadequado para uma amostragem ergódica de abundância conformacional e necessita de nossa abordagem de usar um conjunto de simulações. Esta abordagem é possível para o modelo de granulação grosseira, mas está além dos recursos computacionais presentes para um modelo de todo oatom. Esta “ergodicidade quebrada” é semelhante à descoberta experimental de que a amostragem conformacional é não-ergodica em grandes escalas de tempo26. Contudo, devemos ter o cuidado de salientar que a ergodicidade quebrada aqui é inteiramente devida à natureza estocástica da amostragem conformacional, enquanto nos experimentos da ref. 26, variações na ligação de íons a junções individuais também desempenham um papel.
Variações de molécula a molécula na amostragem conformacional e probabilidades de transição conformacional.
(a) Exemplo de série temporal de conformações de junções para cinco dos 100 membros do conjunto a = 300 mM. A isoforma aberta é de curta duração e atua como um estado de transição entre iso-I e iso-II. (b) Matriz das probabilidades de transição de um dado estado inicial para o estado final a = 300 mM. As probabilidades de transição para o mesmo estado (elementos diagonais) não são mostradas, já que a tendência de permanecer no estado atual domina a escala de outras probabilidades de transição49. Note que as probabilidades de transição para iso I→II (e vice-versa) são quase nulas. (c) Dependência de concentração de sal das quatro probabilidades de transição chave.
Conformidades de funções, abundância e estrutura.
(a) Conformações representativas observadas em nossas simulações; apenas a espinha dorsal do DNA é mostrada, por simplicidade. (b) A abundância relativa das isoformas primárias em função da concentração de sal. As identidades das isoformas são definidas pelas separações de base no interior da junção, conforme descrito no texto. (c) Ângulo inter-duplex (IDA) para cada conformação. Note que a conformação em plano aberto só é predominante em sal baixo. Em sal mais alto, a pequena fração de conformações abertas amostradas adota (em média) uma conformação tetraédrica.
Com base nos dados das séries temporais para conformação de junção, avaliamos diretamente a fração de configurações nas conformações abertas, iso-I ou iso-II em função da concentração de sal (Fig. 7b). Como esperamos, para baixas concentrações de sal (= 10 mM), observamos essencialmente apenas o estado de plano aberto com geometria quadrada. Em todas as concentrações mais altas de sal, os conformadores empilhados são preferidos, com uma média de ≈58% em iso-II e 36% em iso-I (para ≥200 mM). Nossas simulações prevêem que, exceto por concentrações bastante baixas de sal, a fração relativa dos conformadores não depende significativamente do sal. A dominância das conformações empilhadas em alta concentração de sal pode ser esperada devido à forte peneiração das interações eletrostáticas, semelhante à dependência da concentração de sal da temperatura de fusão. No entanto, esta peneirada não é responsável pela tendência para a conformação iso-II empilhada. A diferença na população de isômeros deve surgir devido aos efeitos da seqüência de base próxima ao núcleo da junção, como observado experimentalmente16,17. O fato de o modelo reproduzir o viés experimentalmente conhecido em direção ao iso-II indica o grau de sucesso do modelo de granulação grosseira na captura da estrutura dependente da seqüência. Também encontramos uma pequena fração, 6%, de configurações de junção no estado aberto em sal alto. Como discutido acima, essas conformações são de curta duração e facilitam as transformações entre as conformações empilhadas. Em comparação com os experimentos de Ha e colegas15 em concentrações relativamente altas de sal, o modelo 3SPN.2 abaixo prevê o viés para iso-II em cerca de 15%. A diferença pode ser devida em parte à diferença nos critérios experimentais e computacionais usados para definir isoformas; especificamente, examinamos as separações de base no interior da junção, enquanto os experimentos da FRET usam etiquetas sensíveis à separação das extremidades dos braços R e X da junção (efetivamente o IDA). Para conformações do tipo H com um centro de junção aberto (observadas experimentalmente na presença de endonucleases12), essas abordagens alternativas seriam sistematicamente diferentes em sua classificação: (i) com base nas extremidades da junção, as conformações H seriam classificadas como iso-I ou II; (ii) inversamente, com base na separação no núcleo da junção, as conformações H seriam classificadas como abertas, de modo que nossos critérios sempre produzirão uma fração menor empilhada.
Posto que nossos critérios nos permitem categorizar as conformações das configurações individuais da junção, também podemos avaliar diretamente a estrutura média de cada uma dessas conformações. Caracterizamos a estrutura de junção pelo ângulo inter-duplex (IDA), que definimos pelo ângulo formado pelos braços XR e RH com o vértice de junção51. Assim, o IDA para iso-II deve ser substancialmente menor que o IDA para iso-I. A Figura 7c confirma esta expectativa, com a IDA do iso-II aproximando-se de 90° em alta concentração de sal e a IDA do iso-I perto de 140°. Um valor de 90° para o iso-II é grande comparado com as estimativas experimentais, que são da ordem de 40-60° com base nas medidas de equilíbrio FRET41,44,45, um ponto ao qual retornaremos. Também devemos ficar claros que 90° para o iso-II não implica uma configuração plana, que é visualmente aparente nas configurações representativas mostradas na Fig. 7a; devido à estrutura tridimensional, mesmo uma estrutura empilhada pode adotar um ângulo próximo a 90°. Nas concentrações mais baixas de sal, não podemos estimar o ângulo para as conformações empilhadas, uma vez que elas não são essencialmente amostradas. A = 10 mM, encontramos que o IDA da junção aberta é 95°, consistente com uma junção quase plana, o que também é visualmente visível na Fig. 7a. Em maiores concentrações de sal, a pequena fração de configurações abertas adota um ângulo um pouco maior de ≈105°. Este ângulo maior é consistente com uma configuração quase tetraédrica (Fig. 7a), que talvez deva ser considerada distinta da configuração aberta planar com baixa concentração de sal. Assim, nossos resultados sugerem que os estados de transição entre conformadores empilhados são predominantemente conformações tetraédricas abertas, em vez de planares. Esses intermediários do tipo tetraédrico já foram observados anteriormente em simulações23. De fato, a possibilidade de uma multiplicidade de conformações de junção foi inferida a partir da análise de dados de uma única molécula26,
Comparações de estrutura de função
Como ponto final de comparação, consideramos como o IDA avaliado a partir do modelo 3SPN.2 se compara com as medidas experimentais e o estimado a partir da nossa simulação de AMBER com tudo-atom. As medições FRET estimaram que o IDA do iso-II é de 43 ± 8° a T = 283 K e a concentração de sal = 200 mM45. Assim, simulamos ambos os modelos AMBER e 3SPN.2 em condições de correspondência, partindo de uma configuração inicial de iso-II com um IDA de 43° (ver Fig. 1b). Tanto para os modelos 3SPN.2 como AMBER, a junção se abre para um IDA maior e se fixa a um valor constante depois de ≈50 ns (inset Fig. 8). O painel principal da Fig. 8 mostra os valores de IDA amostrados por cada modelo no estado estacionário. O modelo 3SPN.2 exibe flutuações mais amplas do IDA do que o modelo AMBER, embora o IDA médio seja similar nos dois modelos. Quantitativamente, para AMBER, a IDA média é de 85,3° com desvio padrão de 12,3°; para 3SPN.2, o IDA médio é de 95,7° com desvio padrão 24,1°.
Comparação da estrutura da função entre os modelos de todos os átomos e granulado grosso.
O IDA para o modelo AMBER de todos os átomos (preto) e 3SPN.2 modelo de grão grosso (vermelho) a T= 283 K e = 200 mM. O painel principal mostra a distribuição dos valores de IDA amostrados; as linhas sólidas são a frequência calculada e as linhas pontilhadas são uma distribuição normal com a mesma média e desvio padrão que os dados. O inset mostra a série temporal original para cada modelo, a partir da qual as distribuições são determinadas. Note que para o modelo 3SPN.2, temos 2 μs de dados, nem todos são mostrados no inset.
As simulações ambas mostram um IDA substancialmente maior do que o previsto a partir das medições FRET e estudos cristalográficos45,52. Isto pode sugerir que nenhum dos modelos fornece uma estimativa precisa do IDA, ou que as aproximações que devem ser feitas para estimar o IDA a partir dos dados da FRET subestimam o IDA. Certamente, nos experimentos FRET a presença dos corantes externos, seus ligantes associados e sua orientação relativa podem introduzir erros consideráveis na determinação da distância. As diferenças entre as determinações atuais do IDA e aquelas medidas por cristalografia talvez possam surgir a partir de algumas restrições da malha de cristal. Comparando os modelos totalmente de átomo e granulado grosseiro, a quase duplicação do desvio padrão mostra claramente que os braços de junção são mais flexíveis no modelo granulado grosseiro. Isto pode ser devido em parte à ausência de solvente explícito, uma vez que a água solvente na representação de todas asatom dificulta necessariamente a flexibilidade dos braços de junção.