Isolamento bacteriano e identificação RdFucI

Uma colónia que se sobrepunha no meio contendo l-fucoidan proveniente da Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) como única fonte de carbono foi isolada de um intestino abalone colhido na Coreia do Sul (Ficha adicional 1: Fig. S1). A comparação da identidade da sequência baseada em 16S ribosomal RNA com a base de dados NCBI revelou que o isolado estava filogenéticamente próximo dos membros do género Raoultella (Ficheiro adicional 1: Fig. S1). Assim, a estirpe isolada foi identificada como Raoultella sp. KDH14. Após realizar o sequenciamento genético completo, RdFucI foi identificado a partir de Raoultella sp. KDH14 com base na identidade da sequência genética.

RdFucI é composto de 595 aminoácidos com uma massa molecular de 65,5 kDa e um ponto isoelétrico de 5,5. A ferramenta básica de busca de alinhamento local (BLAST) indicou a alta identidade da seqüência de RdFucI (> 90%) com outras l-FucIs de várias bactérias pertencentes às famílias Raoultella, Klebsiella e Citrobacter.

O RdFucI identificado foi produzido em excesso em E. coli BL21(DE3) com o tag N-terminal hexa-histidina e purificado pela sua cromatografia de afinidade. Quando analisado por eletroforese em gel de dodecyl sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), a banda única apareceu em torno de 65 kDa, consistente com a massa molecular calculada da subunidade monômero.

Reação catalizada por RdFucI favorece a formação de l-fucose

Para examinar a atividade isomerase do RdFucI, a reação enzimática foi realizada com l-fucose ou l-fuculose como substrato (Fig. 2). Foram determinadas as atividades enzimáticas para as reações frente (l-fuculose a l-fuculose) e reversa (l-fuculose a l-fuculose). A produção de l-fuculose a partir da l-fuculose foi confirmada por cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia gasosa/espectrometria de massa (GC/MS) (arquivo adicional 2: Fig. S2). Na interconversão entre l-fucose e l-fuculose, não foi observado nenhum produto lateral, o que significa que um substrato produz um produto (Ficheiro adicional 2: Fig. S2). Assim, consideramos razoável utilizar a quantidade calculada de concentração de l-fuculose medindo experimentalmente a quantidade de l-fucose.

Conversão enzimática de uma l-fucose em l-fuculose (reação direta) e b l-fuculose em l-fucose (reação reversa) por RdFucI. A reação enzimática foi realizada por 3 µg de RdFucI com a l-fucose ou b l-fuculose a 10 mM como substrato inicial a 30 °C durante 10 min em 20 mM de fosfato de sódio (pH 7,0) na presença de 1 mM de Mn2+. l-Fucose foi medida experimentalmente e a concentração de l-fuculose foi calculada subtraindo a concentração de l-fuculose determinada experimentalmente da concentração de açúcar total (10 mM). Os dados experimentais representam médias ± desvios padrão de três réplicas

A reação inversa foi 6,6 vezes mais rápida que a reação dianteira, e a atividade específica para l-fuculose (63,9 U/mg) foi maior que a para l-fuculose (9,6 U/mg). Em ambas as reacções, a razão de equilíbrio entre l-fucose e l-fuculose, que foi determinada experimentalmente, foi aproximadamente 9:1, produzindo assim a constante de equilíbrio (Keq) de 0,11. O valor de Keq também foi teoricamente determinado como 0,23, baseado na relação termodinâmica da mudança de energia livre padrão de Gibbs da reação e Keq em equilíbrio, G^{r} G^{r} = – RT\\n K_{eq}}, onde R e T representam a constante de gás (8,314 J/mol K) e a temperatura (K), respectivamente. \G^{r} G^{circ ^) representa a mudança de energia padrão livre de Gibbs para a reação de l-fucose a l-fuculose (0,859993 kcal/mol), que está listada na base de dados BioCyc (https://biocyc.org). Houve alguma discrepância entre os valores experimentais e teóricos de Keq. Um Keq < 1 indica que a reação inversa é favorecida. A isomerização catalizada por RdFucI favoreceu a reação reversa, produzindo l-fucose a partir de l-fuculose com aproximadamente 90% de rendimento a 30 °C e pH 7,

Efeito da temperatura e pH na atividade de RdFucI e equilíbrio

Reações enzimáticas foram realizadas a várias temperaturas variando de 10 a 80 °C e pHs variando de 4 a 11 utilizando l-fuculose como substrato (Fig. 3). A isomerização da l-fuculose com l-fucose pelo RdFucI foi altamente dependente da temperatura, e as atividades máximas ou quase máximas (> 80% do máximo) foram exibidas a temperaturas que variaram de 30 a 50 °C (Fig. 3a). Para investigar o efeito da temperatura sobre o equilíbrio para isomerização l-fucose a l-fuculose, a razão de equilíbrio foi investigada a 30, 40 e 50 °C, onde as atividades máximas ou quase-máximas (> 80% do máximo) foram mostradas. Como resultado, não houve diferença significativa na razão de equilíbrio entre as três temperaturas (l-fucose/l-fuculose = 9:1; p > 0,05). Em outras palavras, a l-fucose foi sintetizada a partir da l-fuculose com um rendimento de aproximadamente 90% em todas as temperaturas testadas (arquivo adicional 3: Fig. S3a).

Efeito de uma temperatura e b pH sobre a atividade relativa do RdFucI contra a l-fuculose. Reações enzimáticas foram realizadas a em várias temperaturas variando de 10 a 80 °C e b em vários pHs variando de 4 a 11. Os tampões utilizados foram 50 mM de acetato de sódio (pH 4, 5 e 6), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6, 7 e 8), 50 mM de Tris-HCl (pH 7, 8 e 9) e 50 mM de glicina-NaOH (9, 10 e 11). Os dados experimentais representam médias ± desvios padrão de três réplicas

O efeito do pH foi investigado. Atividades altas de RdFucI (> 70% do máximo) foram observadas em pHs alcalinos e quase neutros (pHs 9, 10 e 11 e pHs 6, 7 e 8). Abaixo do pH 6, a atividade enzimática diminuiu acentuadamente, com pouca atividade observada no pH 4. Apesar das altas atividades específicas em condições alcalinas, a produção de l-fucose em equilíbrio (60 min de incubação) foi muito menor no pH 10 (54%) do que no pH 7 (88%) (arquivo adicional 3: Fig. S3b). As atividades relativas a pH 7, 8 e 9 foram muito mais baixas em tampão Tris-HCl do que as atividades em acetato de sódio ou tampão glicina-NaOH, implicando que o Tris inibiu fortemente a atividade enzimática do RdFucI. As experiências enzimáticas precedentes neste estudo foram realizadas em misturas de reação contendo Tris a 1 mM, que foi da etapa de mudança de tampão após a purificação enzimática. Para examinar se a Tris na mistura de reação poderia inibir a RdFucI, foram comparadas as atividades de isomerização das reações ocorridas na ausência e presença de Tris a 1 mM (arquivo adicional 4: Fig. S4). Nenhuma diferença significativa foi evidente nas atividades enzimáticas das duas reações, indicando que 1 mM Tris não inibiu a atividade de RdFucI.

Efeito dos íons metálicos na atividade de RdFucI

Isomerases de açúcar, incluindo as isomerases l-fucose, requerem cátions divalentes, como Mn2+ e Co2+, como co-fatores para suas atividades de isomerização . Para estudar o efeito dos cátions divalentes na atividade catalítica do RdFucI sobre a l-fuculose, a atividade enzimática foi testada na ausência e presença de 1 mM de vários íons metálicos ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (Tabela 1). A enzima nativa RdFucI não exposta a íons metálicos ou EDTA apresentou baixa atividade, e a quelação do metal por EDTA reduziu a atividade da enzima. Entre os íons metálicos testados, Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ e Zn2+ resultaram em um aumento pronunciado na atividade enzimática. Em particular, a adição de Mn2+ aumentou a atividade máxima de RdFucI em aproximadamente 7,4 vezes. Em contraste, Ca2+, Cu2+ e Fe3+ inibiram bastante a atividade de RdFucI.

Substrate specificity and kinetic parameters of RdFucI

In general, sugar and sugar phosphate isomerases display a broad specificity toward various substrates . Para avaliar se a atividade cetose-favorecedora de RdFucI mostrada com l-fuculose também era evidente com outros substratos, a especificidade do substrato de RdFucI foi investigada contra vários açúcares aldoses (l-fucose, d-arabinose, d-altrose, d-galactose, d-manose e d-glucose) e seus correspondentes açúcares cetose (l-fuculose, d-ribulose, d-psicose, d-tagatose e d-frutose) (Fig. 4). Entre todos esses substratos, incluindo açúcares aldose e cetose, as atividades mais elevadas foram observadas com a l-fuculose (115,3 U/mg) e d-ribulose (127,3 U/mg), que são ambos açúcares cetose. As atividades da RdFucI para l-fuculose e d-ribulose foram muito mais altas do que as dos outros substratos. Entre os açúcares aldoses, a atividade para a l-fucose foi a mais alta (21,0 U/mg), com os outros substratos produzindo atividades específicas variando de 4,7 a 7,9 U/mg. Os açúcares cetose que não a l-fuculose e a d-ribulose apresentaram atividades específicas de 0,0 a 10,8 U/mg. Assim, a l-fuculose e a d-ribulose foram os substratos preferidos para o RdFucI e a atividade cetosefavorecida do RdFucI foi mostrada apenas com l-fuculose e d-ribulose.

Especificidade de substrato do RdFucI. Reações enzimáticas foram realizadas contra 10 mM de vários substratos de aldose e cetose a 40 °C e pH 10. Para substratos de aldose, foram utilizados l-fucose, d-arabinose, d-altrose, d-galactose, d-manose e d-glucose. Para os substratos de cetose, foram utilizadas l-fuculose, d-ribulose, d-psicose, d-tagatose e d-frutose. Os dados experimentais representam médias ± desvios padrão de três réplicas

Parâmetros cinéticos foram determinados usando l-fuculose e d-ribulose como substratos (arquivo adicional 5: Tabela S1). Os valores de Km (constante de Michaelis) e kcat (número de rotação do substrato) para a l-fuculose foram 1,9 e 1,2 vezes mais baixos, respectivamente, que os valores para a d-ribulose. A eficiência catalítica do RdFucI, representada como kcat/Km, para l-fuculose, foi 1,5 vezes maior que a da d-ribulose, indicando que a l-fuculose é preferida como substrato de RdFucI.

Estrutura cristalina global de RdFucI

Para melhor compreender a função molecular, determinamos a estrutura cristalina do RdFucI (arquivo adicional 6: Tabela S2). O mapa de densidade de elétrons do RdFucI foi bem definido a partir dos resíduos Ser5-Arg591 para seis subunidades na unidade assimétrica. O monômero RdFucI é composto por 19 α-helices e 23 β-tensões que compreendem os domínios N1, N2 e C (Fig. 5a). O domínio N1 (Ser5-Met172) adota uma dobra em α/β e está envolvido no reconhecimento do substrato da formação hexamericana do RdFucI. Os domínios N2 (Lys173-Leu352) e C (Thr353-Arg591) contêm os resíduos de ligação metálica envolvidos na atividade catalítica (Fig. 5a). Na unidade assimétrica, as subunidades de RdFucI formam a formação hexamericana disposta como um dímero de trimers com pseudosimetria D3h (Fig. 5b). Isto é consistente com o resultado da cromatografia de exclusão de tamanho analítico em que RdFucI foi revelado como um homohexamer em solução (arquivo adicional 7: Fig. S5).

Estrutura geral de RdFucI. a Cartoon representation of the RdFucI monomer. O monômero RdFucI é composto de domínios N1- (amarelo), N2- (rosa) e C-(verde). b Representação superficial do hexamer RdFucI. As subunidades A, B, C, D, E, e F são coloridas por amarelo, rosa, ciano, roxo, verde e laranja, respectivamente. Um local de encadernação metálica num local de encadernação do substrato é indicado por um ponto vermelho

Na formação hexamericana, subunidade A (área total da superfície: 23011.7 Å2) interage com quatro subunidades diferentes B (resíduos na interface: 47/área de superfície enterrada: 1909.6 Å2), C (58/1837.6 Å2), D (42/1482.9 Å2), e E (34/1086.2 Å2). A subunidade A não interage com a subunidade F restante (Fig. 5b). A subunidade A do RdFucI tem uma superfície total enterrada de 2569,1 Å2, representando 27,45% da superfície total. Esta interface enterrada é estabilizada pela interação envolvendo 59 ligações de hidrogênio e 26 pontes de sal de outras subunidades (arquivo adicional 8: Tabela S3, arquivo adicional 9: Tabela S4, arquivo adicional 10: Tabela S5, arquivo adicional 11: Tabela S6).

Site de ligação do substrato e site ativo do RdFucI

A bolsa de ligação do substrato é formada pelos domínios N2 e C da subunidade A e o domínio N1 da subunidade B (Fig. 6a-c) e tem um total de seis sites de ligação do substrato no homohexamericano RdFucI. A entrada da bolsa de ligação do substrato, onde o substrato se aproxima, é de aproximadamente 11 × 12,5 Å (Fig. 6a). A bolsa de ligação do substrato, onde o local de ligação do metal é formado, tem uma superfície de carga negativa de aproximadamente 4 × 5 Å (Fig. 6b). A distância entre o local de ligação metálica e a superfície da bolsa de ligação do substrato é de aproximadamente 16,7 Å (Fig. 6d), o que implica que o centro ativo está localizado no fundo de uma bolsa. Isto indica que tanto a corrente aberta como a forma de anel do substrato são acessíveis ao centro do local ativo e que, inversamente, um sacarídeo a granel não seria acessível ao local ativo existente no interior da bolsa de ligação do substrato.

Bolso de encadernação do substrato e local ativo do RdFucI. a O bolso de encadernação do substrato é formado pela montagem por subunidades A e C. b Superfície eletrostática do bolso de encadernação do substrato. c Apresentação do fator B da superfície de ligação do substrato. d Vista seccional da superfície da bolsa de ligação do substrato. e O mapa de densidade de elétrons 2Fo-F (malha cinza, contornada em 1.0 σ) nos locais de ligação metálica do RdFucI embebido em solução contendo o Mn2+ de 10 mM. f Análise geométrica dos sítios de ligação Mn2+ de RdFucI

RdFucI requer íons metálicos divalentes para sua atividade catalítica para reação de isomerização usando o mecanismo de ene-diol . O local de ligação de metais do RdFucI deve ser coordenado com o Mn2+ por resíduos conservados Glu337, Asp359, e His528 (arquivo adicional 12: Fig. S6). Entretanto, não existe um mapa de densidade de elétrons Fo-Fc (contado em > 5σ) que se suspeita estar ligado ao Mn2+ como um metal essencial para a ligação do substrato (Arquivo adicional 13: Fig. S7a). A análise do fator B revelou que o fator de temperatura do Mn2+ (70,53 Å2) é maior do que o fator de temperatura média da proteína (36.22 Å2), indicando que o Mn2+ está presente no RdFucI com uma ocupação baixa. O achado foi consistente com o resultado da análise bioquímica na qual a enzima nativa apresentou um baixo nível de atividade. Por outro lado, a adição de Mn2+ aumentou substancialmente a atividade catalítica do RdFucI (Tabela 1). Assim, especulamos que a adição de Mn2+ ao cristal RdFucI aumentaria a ocupação de ligação do Mn2+. Após a imersão dos cristais de RdFucI em uma solução de 10 mM Mn2+, foi observada uma densidade de elétrons Fo-Fc confiável (> 6σ) no local de ligação do metal, onde a posição do Mn2+ foi esclarecida em todas as subunidades (Fig. 6e e arquivo adicional 13: Fig. S7b). Entretanto, o fator B de temperatura do Mn2+ (76,56 Å2) foi maior que o da proteína total (60,69 Å2), implicando que o íon Mn2+ ainda não está totalmente ocupado no local de ligação do metal. O Mn2+ foi coordenado pelo OE1 (distância média: 2,62 Å) e OE2 (2,65 Å) átomos de Glu337, OD1 (2,72 Å) e OD2 (2,72 Å) átomos de Asp361, NE2 (2,52 Å) átomo de His528, e a molécula de água (2,79 Å) (Fig. 6e). Os ângulos médios de ligação de Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2), e Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) foram 127,32°, 86,25°, e 73,96°, respectivamente. O ângulo de ligação entre ligandos e Mn2+ mostrou uma coordenação octaédrica distorcida.

Comparação estrutural com outros l-FucIs

O servidor DALI foi usado para procurar por homólogos estruturais. Esta pesquisa revelou que RdFucI é similar a l-FucIs de E. coli (EcFucI, código PDB 1FUI, escore Z: 60.6, rmsd: 0.3 para 587 átomos Cαs), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, escore Z: 56.6, rmsd: 0,7 para 580 átomos Cαs), e Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, escore Z: 55,9, rmsd: 0,7 para 585 átomos Cαs). A sobreposição da bolsa de ligação do substrato mostrou que os resíduos de ligação metálica Glu337, Asp361 e His528 (numerados em RdFucI) são posicionalmente idênticos às outras proteínas, enquanto os resíduos de reconhecimento do substrato (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496 e Asn524) têm uma leve diferença conformacional em suas cadeias laterais (Fig. 7a). Em particular, o laço α7-α8 de cada l-FucI, que se encontra na superfície da bolsa de ligação do substrato, tem uma conformação diferente. O alinhamento sequencial dos l-FucIs mostrou uma elevada semelhança, mas a sequência para α7-α8 loop de cada l-FucI foi altamente variável (Fig. 7b). Como o laço α7-α8 está envolvido na formação da arquitetura da bolsa de ligação do substrato, cada l-FucI forma uma bolsa de ligação do substrato única (Fig. 7c). l-FucIs geralmente têm uma superfície com carga negativa em torno do local de ligação do metal, mas a superfície da bolsa de ligação do substrato apresenta diferentes estados de carga (Fig. 7c). Como resultado, as diferenças estruturais do laço α7-α8 causarão diferenças na especificidade do substrato de l-FucIs.

Comparação estrutural de RdFucI com outros l-FucIs. Superposição de um local ativo e superfície de ligação do substrato b do RdFucI com EcFucI (código PDB: 1FUI), ApFucI (3A9R) e SpFucI (4C20). Vista de perto da grande diferença conformacional dos laços α8-α9 de l-FucIs (esquerda). c Alinhamento parcial da sequência da região dos laços α8-α9 para o RdFucI e EcFucI, ApFucI e SpFucI. d Representação eletrostática da superfície do RdFucI, EcFucI, ApFucI e SpFucI. A bolsa de ligação do substrato profundo e as regiões do laço α8-α9 são indicadas pelas linhas laranja e preta, respectivamente. Um local de ligação de metal é indicado por um asterisco amarelo