Informação de fundo
Transfecção de ADN por electroporação é uma técnica estabelecida que é aplicável talvez a todos os tipos de células. Ela produz uma alta frequência de transformadores estáveis e tem uma alta eficiência de expressão de genes transitórios. A electroporação tem agora demonstrado ser eficaz no fornecimento de ADN plasmídeo in vivo a uma variedade de tipos de tecidos. A eletroporação faz uso do fato de que a membrana celular atua como um capacitor elétrico que é incapaz de passar corrente (exceto através de canais de íons). A sujeição das membranas a um campo elétrico de alta tensão resulta em sua ruptura temporária e na formação de poros suficientemente grandes para permitir a entrada ou saída de macromoléculas (assim como de moléculas menores como ATP) da célula. O fechamento dos poros da membrana é um processo natural de decaimento que é retardado a 0°C.
Durante o tempo em que os poros estão abertos, o ácido nucléico pode entrar na célula e finalmente no núcleo. O DNA linear com extremidades livres é mais recombinogênico e com maior probabilidade de ser integrado ao cromossomo hospedeiro para produzir transformadores estáveis. O ADN super-recozido é mais facilmente embalado em cromatina e é geralmente mais eficaz para expressão de genes transitórios.
O uso de choques eléctricos de alta voltagem para introduzir ADN nas células foi realizado pela primeira vez por Wong e Neumann usando fibroblastos (Wong e Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). A técnica foi então generalizada (Potter et al., 1984) para todos os tipos celulares – mesmo aqueles como linfócitos que, ao contrário dos fibroblastos, não podem ser transfectados com outros procedimentos (por exemplo fosfato de cálcio ou coprecipitados de DNA DEAE-dextran).
Oliver Smithies e colegas usaram então a electroporação para introduzir DNA em células estaminais embrionárias (ES) e desenharam vectores-alvo que permitiram que o DNA introduzido recombinasse com regiões homólogas no genoma e introduzisse um gene alterado ou uma sequência disruptiva para gerar células ES com um gene específico ‘knocked in’ ou ‘knocked out’. As células ES alteradas foram então utilizadas para gerar os ratos knockin ou knock-out correspondentes. A eletroporação foi necessária para essas aplicações de transferência de genes porque introduz o DNA em células de forma nua que podem facilmente participar da recombinação homóloga. Esta extensão da electroporação levou o Dr. Smithies a partilhar o Prémio Nobel da Medicina ou Fisiologia de 2007. A metodologia para a electroporação de células ES é essencialmente a mesma que para outras células de mamíferos. Se a substituição de genes homólogos for desejada, então vetores que permitem o rastreamento “positivo negativo” devem ser projetados (Bronson e Smithies, 1994; Joyner 2000) de forma que uma seleção recupere todas as células nas quais o DNA eletroproduzido tenha inserido no genoma, e a segunda seleção seja contra clones de ES nos quais o DNA tenha inserido aleatoriamente. Ratos knockin/out podem então ser gerados fundindo as células ES clonadas selecionadas com embriões, reimplantando para permitir o desenvolvimento e reproduzindo as quimeras resultantes para gerar ratos nos quais todas as células carregam o gene alterado.
Embora plantas inteiras ou tecido foliar tenham sido relatados como transfectáveis por eletroporação, as células vegetais devem geralmente ser transformadas em protoplastos antes que o DNA possa ser facilmente introduzido neles (protocolo alternativo; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Como as células de mamíferos, os protoplastos de plantas podem ser electroporados sob uma variedade de condições eléctricas (parâmetros críticos). Tanto a alta tensão com baixa capacitância (curta duração de pulso) como a baixa tensão com alta capacitância (longa duração de pulso) têm sido usadas para obter sucesso na transferência de genes (Chu et al., 1991). A EP in vivo foi originalmente utilizada para administrar agentes quimioterápicos a tumores sólidos e progrediu de estudos pré-clínicos para ensaios clínicos (Gothelf, et al., 2003). A entrega in vivo de DNA plasmídeo usando eletroporação foi relatada pela primeira vez no início a meados dos anos 90 (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996) e foi um avanço lógico baseado no sucesso de transfecções in vitro com eletroporação e na demonstração de que o procedimento poderia ser realizado com segurança in vivo ao entregar pequenas moléculas, como agentes quimioterápicos. O uso da eletroporação in vivo para a entrega de DNA plasmídeo tem visto um tremendo crescimento no número de estudos pré-clínicos sendo realizados e foi recentemente traduzido para a clínica (Heller, et al., 2006a e Bodles-Brakhop, et al.,2009).
O amplo uso da eletroporação tem sido possível em grande parte pela disponibilidade de aparelhos comerciais que são seguros e fáceis de usar e que dão resultados extremamente reprodutíveis. Os desenhos destas máquinas variam substancialmente, mas enquadram-se em duas categorias básicas que utilizam meios diferentes de controlo da duração e tensão dos impulsos (os dois parâmetros eléctricos que regem a formação dos poros). Um tipo utiliza um sistema de descarga de capacitores para gerar um pulso de corrente exponencialmente decadente, e o outro gera uma verdadeira onda quadrada (ou uma aproximação da mesma). Os instrumentos de descarga de condensadores carregam o seu condensador interno a uma determinada tensão e depois descarregam-no através da suspensão do ADN da célula. Tanto o tamanho do condensador como a tensão podem ser variados. Como o pulso de corrente é uma função de decaimento exponencial de (1) a tensão inicial, (2) o ajuste da capacitância do instrumento, e (3) a resistência do circuito (incluindo a amostra), mudar o tamanho do capacitor para permitir que mais (ou menos) carga seja armazenada na tensão resultará em tempos de decaimento mais longos (ou mais curtos) e, portanto, uma duração de pulso efetiva diferente. Em contraste, os geradores de onda quadrada controlam tanto a tensão como a duração do pulso com dispositivos de comutação de estado sólido. Eles também podem produzir pulsos que se repetem rapidamente. Para aplicações in vivo, os geradores de onda quadrada são preferidos. Além da duração e amplitude do pulso, o número do pulso e a configuração do eletrodo também influenciam a eficiência da entrega.
A maior parte dos nossos experimentos de eletroporação in vitro utilizaram o Bio-Rad Gene Pulser, um dispositivo de descarga de capacitores, mas são diretamente aplicáveis a outros dispositivos de descarga de capacitores, e com algum ajuste nos geradores de onda quadrada. Os dispositivos de descarga de condensadores também estão disponíveis na GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific e International Biotechnologies (consulte o APPENDIX 4 para obter os endereços dos fornecedores). Estas máquinas, quer numa única unidade ou através de componentes adicionais, podem fornecer uma variedade de condições de electroporação adequadas para a maioria das aplicações. Os geradores de onda quadrada estão disponíveis em BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan e IGEA e oferecem grande controle sobre a largura de pulso, permitem pulsos múltiplos e rápidos, e podem ser mais eficazes para células muito sensíveis ou difíceis de serem transfectadas. O uso da electroporação para realizar a terapia genética em animais vivos ou humanos também requer um bom controlo sobre os parâmetros de electroporação para assegurar uma transferência eficiente de ADN com o mínimo de danos nos tecidos, o que geralmente requer geradores de ondas quadradas. Os geradores estão disponíveis para administrar pulsos como voltagem constante ou corrente constante. Além de fornecer geradores de onda quadrada, eletrodos adequados para eletroporação in vivo também estão disponíveis através destes fornecedores. Estas máquinas são geralmente mais caras. Tornou-se evidente que pulsos de corrente alternada a ~100 kHz podem ser a forma de onda mais eficaz para eletroporação e possivelmente eletrofusão (Chang, 1989).
A maioria dos nossos experimentos in vivo utilizaram geradores de onda quadrada BTX T820 ou T830. Estes experimentos utilizaram eletrodos disponíveis comercialmente, como uma matriz de 2 agulhas, eletrodos de calibre e eletrodos de fórceps, bem como eletrodos projetados sob medida. Como mencionado acima, os principais fornecedores de equipamentos de eletroporação têm uma variedade de eletrodos penetrantes e não penetrantes disponíveis. Os geradores de onda quadrada permitem um melhor controle dos parâmetros de pulso, o que é particularmente importante quando se realiza a entrega in vivo. O crescimento do uso da electroporação in vivo está directamente relacionado com a sua entrega eficaz em músculo . A aplicação da entrega intramuscular de genes usando eletroporação tem sido particularmente importante para fins de vacinação (Abdulhagg, et al., 2008). O músculo também tem demonstrado ser um excelente depósito para aplicações de substituição protéica baseada em genes (Trollet, et al., 2006). A entrega ao músculo também pode ser usada para a entrega de vacinas anticancerígenas (Bodles-Brakhop, et al., 2009). A entrega à pele também tem ganho aceitação como um alvo versátil. A entrega à pele pode ser usada para o tratamento directo de doenças cutâneas, fornecendo proteínas à circulação para terapia sistémica, terapia do cancro e para a entrega de vacinas de ADN (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
Electroporação pode ser mais fácil de realizar do que técnicas alternativas, razão pela qual está a ser cada vez mais utilizada. Seu inconveniente para uso com análise transiente é que quase cinco vezes mais células e DNA são necessários do que com transfecção de fosfato de cálcio ou DEAE-dextran-mediada (UNIDADES 9.1, 9.2 & 16.12). A principal diferença entre os procedimentos de electroporação e coprecipitação de fosfato de cálcio é o estado do ADN integrado após a selecção em meios antibióticos apropriados. No caso do fosfato de cálcio, a quantidade de DNA captada e integrada no genoma de cada célula transfectada está na faixa de 3 × 106 bp. Como resultado, o DNA transfectado muitas vezes se integra como grandes matrizes tandem contendo muitas cópias do DNA transfectado. Isto seria uma vantagem quando a transfecção de ADN genómico em células receptoras e a selecção para alguma mudança fenotípica, como a transformação maligna, é desejada; aqui é essencial uma grande quantidade de ADN integrado por célula receptora. Em contraste, a electroporação pode ser ajustada para resultar em uma a muitas cópias de ADN inserido por célula receptora. Isto seria uma vantagem para estudos de expressão gênica, já que a identidade da cópia particular responsável pela expressão gênica pode ser controlada, e, como discutido acima, é essencial para o direcionamento gênico das células ES para gerar ratos transgênicos.