Infecção com Giardia lamblia é uma das causas mais comuns de doença diarréica em todo o mundo (22). Este protozoário patogénico coloniza o intestino delgado e pode ligar-se ao epitélio mas não invade a mucosa. As infecções são normalmente auto-limitadas, uma vez que os hospedeiros imunocompetentes podem controlar e normalmente erradicar a G. lamblia, um processo que envolve as células T CD4 e a geração de imunoglobulina secretora A (IgA) e outros efetores mal compreendidos (6, 8, 9, 18). Apesar dos sintomas clínicos frequentemente graves, diarréia, dor abdominal, má absorção e perda de peso, a infecção não é acompanhada de inflamação significativa da mucosa (12). Estas observações sugerem que os mediadores inflamatórios podem não ser importantes para a diarréia induzida por parasitas, embora os mecanismos que regem a diarréia na giardíase sejam mal compreendidos. Não foi demonstrado que a Giardia liberte enterotoxinas que possam ser responsáveis pelo distúrbio da absorção ou secreção do líquido intestinal. Uma redução na superfície absorvente devido a uma perda de microfilos epiteliais ocorre na infecção por Giardia em ratos (16), o que poderia levar a diarréia osmoticamente impulsionada associada à má absorção, mas a redução absoluta da superfície é modesta em comparação com a reserva anatômica prevista para o intestino delgado. Humanos infectados com G. lamblia apresentam sinais de hipermotilidade intestinal ao exame radiológico (15), um fenômeno também observado em gerbos mongóis infectados experimentalmente (5). Os mecanismos subjacentes e o significado funcional destes achados não são atualmente claros. Portanto, o objetivo do presente estudo foi testar a hipótese de que a hipermotilidade intestinal representa um mecanismo de defesa do hospedeiro contra Giardia, usando modelos murinos de giardíase.

Adult C57BL/6, SCID, e ratos deficientes em óxido nítrico neuronal (nNOS) foram obtidos do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Para infecções com Giardia muris, os cistos foram purificados por flutuação da sacarose, contados em hemocitômetro sob um microscópio de contraste de fase, e dados por gavagem oral em água a 104 cistos/mouse em 0,2 ml (9). Para infecções por G. lamblia, os trofozoítos da linhagem GS/M (ATCC 50580) (11) foram cultivados em meio TYIS-33 e administrados por gavagem oral a 107/rato em 0,2 ml do mesmo meio (9). A motilidade pequeno-intestinal foi determinada por um método de refeição de teste modificado. Os ratos foram jejuados durante a noite e receberam 0,2 ml de uma suspensão de 106 esferas de poliestireno fluorescentes (10-μm-diâmetro Fluoresbrite YG carboxiato microesferas; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) e 6% de corante carmim em 5% de goma arábica em tampão fosfato salino (PBS). Após 20 min, o intestino delgado foi removido rapidamente, e a posição do corante carmim frontal e todo o comprimento do intestino delgado foram registrados. O intestino foi então dividido em oito pedaços de igual tamanho, cada um deles aberto longitudinalmente, colocado em 2 ml de PBS, e resfriado em gelo por 10 min. As misturas foram agitadas vigorosamente para destacar os trofozoítos e os grânulos, que foram então contados separadamente, usando microscópios de contraste de fase e fluorescência, respectivamente. A distância percorrida pela frente do corante carmim foi expressa como uma percentagem de todo o comprimento do intestino delgado. O número de contas por segmento foi expresso como uma percentagem do número total de contas no intestino delgado. Para avaliar as consequências da inibição do pequeno movimento intestinal na depuração giardial, os ratos foram primeiro infectados oralmente com G. muris ou G. lamblia GS/M e tratados por gavagem oral dia sim dia não, começando no dia 7 ou dia 4, respectivamente, com 30 mg/kg de loperamida ou com PBS como controle. Os números de trofócitos pequenos e intestinais foram determinados no dia 21 para G. muris e no dia 9 para G. lamblia.

Para determinar se ratos adultos normais são um modelo adequado para estudar o papel da motilidade intestinal no controle da infecção giardial, nós infectamos ratos C57BL/6 de 8 a 10 semanas com cistos do patógeno murino natural G. muris. A motilidade intestinal pequena foi determinada por um método de teste de refeição, usando corante carmim como marcador de fase líquida (14) e contas de poliestireno 10-μm como marcador de partículas de tamanho comparável aos trofozoítos Giardia (19). A infecção com G. muris acelerou o pequeno trânsito intestinal, pois as frentes do corante carmim (Fig. (Fig.1A)1A) e das esferas de poliestireno (Fig. (Fig.1B)1B) tinham viajado significativamente mais longe em ratos infectados do que em controles não-infectados. Uma análise temporal deste fenômeno revelou que a hipermotilidade ocorreu dentro de uma semana após a infecção, mas atingiu um pico de 2 a 3 semanas, em um momento em que os números de trofózitos foram reduzidos em comparação com os números no momento da infecção máxima de 1 semana (Fig. (Fig.1A).1A). Assim, as mudanças máximas na motilidade do pequeno intestino foram retardadas em relação ao pico da carga trophozoite, sugerindo que essas mudanças podem ser causadas por um mecanismo diferente da estimulação giardial direta.

Este achado lembra relatos de perda de microorganismos epiteliais intestinais induzidos pela Giardia, nos quais a resposta imune adaptativa do hospedeiro foi encontrada como responsável (16, 17). Para avaliar se mecanismos similares podem estar envolvidos na causa de uma pequena hipermotilidade intestinal, avaliamos ratos com imunodeficiência combinada grave (ratos SCID). Esses camundongos não possuem células T e B funcionais devido a um defeito na subunidade catalítica da proteína quinase dependente de DNA, PRKDC, que é necessária para recombinação V(D)J normal, e não pode erradicar a Giardia (9, 18). G. infecção por muris de ratos SCID não alterou o trânsito intestinal pequeno, que contrastou acentuadamente com as observações nos controles imunocompetentes (Fig. (Fig.2).2). Estes resultados indicam que a pequena hipermotilidade intestinal associada à giardíase foi dependente da indução de uma resposta imune adaptativa normal ao patógeno.

Para testar se a pequena hipermotilidade intestinal observada contribuiu para a depuração de Giardia, tratamos ratos com loperamida, uma droga que inibe o trânsito intestinal ativando receptores μ-opioides no trato gastrointestinal (2, 13, 21). O tratamento medicamentoso foi iniciado no momento do pico da infecção por G. muris (dia 7) para garantir que as alterações farmacologicamente induzidas na motilidade não interferissem com o estabelecimento inicial da infecção. A inibição da pequena motilidade intestinal pela loperamida comprometeu marcadamente a depuração giardial, com números de trofozoite 25 vezes maiores em ratos tratados com loperamida do que nos controles tratados com PBS aos 21 dias (Fig. (Fig.3).3). O tratamento com loperamida não teve efeito no desenvolvimento da imunidade adaptativa, já que os títulos de IgA antigiardial nas secreções da mucosa intestinal não foram afetados pelo tratamento (dados não mostrados). Além disso, esta estratégia experimental revelou um efeito inibitório similar na infecção murina com G. lamblia GS/M, um patógeno giardial humano que pode infectar ratos adultos normais (3, 9). Os camundongos tratados com PBS tinham em grande parte eliminado a infecção em 9 dias, enquanto os camundongos tratados com loperamida a partir do quarto dia continuaram a ter um número significativo de trofozoítos de G. lamblia no intestino delgado (Fig. (Fig.3).3). Assim, a inibição da pequena motilidade intestinal comprometeu a depuração de Giardia no hospedeiro murino, independentemente da espécie giardial. Como uma abordagem adicional para determinar a importância da motilidade intestinal na defesa do hospedeiro antigiardial, usamos uma abordagem genética na qual a interrupção do gene para nNOS interfere na propulsão efetiva no intestino em camundongos (20). A análise da motilidade confirmou que os ratos deficientes em nNOS apresentaram um atraso constitutivo no trânsito gastrointestinal em comparação com os seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (Fig. (Fig.4A).4A). Em paralelo, os ratos nocturnos não conseguiram eliminar a infecção por G. lamblia normalmente (Fig. (Fig.4B).4B). Assim, utilizando abordagens farmacológicas e genéticas, verificamos que a diminuição da motilidade intestinal estava associada ao comprometimento da defesa do hospedeiro contra Giardia.

Nosso estudo mostra que a hipermotilidade intestinal é uma importante defesa do hospedeiro contra Giardia, conclusão também alcançada em outro relatório recente (10). Esta defesa parece depender do desenvolvimento de uma resposta imunológica adaptativa normal contra o parasita, já que não ocorreu em ratos sem células T e B, embora seja possível, em princípio, que as células T ou B contribuam para a hipermotilidade independentemente do seu papel na imunidade antigiardial adaptativa. A hipermotilidade imuno-dependente opera na defesa do hospedeiro contra outros parasitas entéricos, particularmente os helmintos. Por exemplo, a erradicação da Trichinella spiralis, que passa uma porção significativa do seu ciclo de vida no intestino delgado, está altamente correlacionada com o aumento da motilidade intestinal (4, 23). Da mesma forma, a expulsão do ancilóstomo Nippostrongylus brasiliensis em ratos é acompanhada por uma pequena hipermotilidade intestinal, sugerindo um papel na defesa do hospedeiro contra este helminto (7). Comum a todos estes patógenos entéricos é a sua localização primária, se não exclusiva, na luz intestinal. Visto anatomicamente, este local de infecção está localizado fora do corpo coberto por epitélio próprio e, portanto, não é facilmente acessível a muitas células e moléculas de efeito imunológico, tais como neutrófilos ou complemento, que operam efetivamente dentro do corpo. Na verdade, a defesa antimicrobiana eficaz na luz intestinal representa um desafio especial para o hospedeiro, que tem um repertório limitado de defesas neste local. Destes, a IgA secretora é comumente considerada como um mecanismo de defesa luminal primário, mas sua real importância na depuração giardial parece ser variável e pode depender de fatores hospedeiros e parasitas mal definidos (6, 9, 18). Nossos dados e trabalhos anteriores com helmintos (4, 23) indicam que a hipermotilidade intestinal é outro importante mecanismo de defesa contra a colonização da luz intestinal.

A hipermotilidade dependente de múmias pode fornecer uma explicação mecanicista para a diarréia associada à giardíase, como observado em relatórios anteriores (5, 15). Em princípio, a diarréia pode ser causada por diminuição da absorção de líquidos ou aumento da secreção ou por uma combinação desses dois mecanismos. Existem poucas evidências de aumento da secreção de íons e fluidos na giardiase, deixando como causa provável a diminuição da absorção de fluidos. O tempo reduzido de contacto com fluidos luminosos, que podem ser ingeridos ou derivados de secreções gástricas ou pancreáticas, comprometeria a eficácia do transporte de iões através do epitélio, particularmente quando a hipermotilidade é combinada com a perda relatada de superfícies epiteliais absorventes (16). Deve-se notar, entretanto, que os ratos não apresentam diarréia franca na infecção por Giardia. No entanto, é possível que ocorra um desequilíbrio de fluido intestinal tanto em hospedeiros humanos como em animais e que este permaneça compensado em ratos, mas não em humanos. Se a hipermotilidade de fato contribuir para a patogênese da diarréia, nossa descoberta de que os ratos SCID não demonstraram hipermotilidade induzida pela Giardia implicaria que pacientes com imunodeficiências celulares associadas ao aumento da suscetibilidade a infecções por Giardia (por exemplo, imunodeficiência variável crônica) podem ser menos propensos a desenvolver diarréia associada à infecção. Além disso, nossos resultados sugerem que é indicado cautela ao considerar o uso de inibidores da motilidade intestinal no tratamento da diarréia induzida pela Giardia (1), pois tal tratamento pode prolongar a infecção subjacente.