Abstract

Contexto e objetivo. Uma ferramenta de previsão não invasiva confiável para a triagem, diagnóstico e/ou estadiamento do câncer colorretal (CRC) antes da cirurgia é fundamental para a escolha do tratamento e prognóstico. Métodos. Os pacientes admitidos para tratamento inicial de CRC entre 1 de janeiro de 2015 e 31 de dezembro de 2018, foram recuperados e revisados. Registros de células CD16+CD56+ natural killer (NK) foram analisados de acordo com os estágios do CRC. Resultados. O número de participantes qualificados nos CRC saudáveis, estágio I, estágio II, estágio III e estágio IV foi de 60, 66, 60, 70 e 68, respectivamente. Houve diferença significativa nas células CD16+CD56+ NK circulantes entre o grupo saudável e o grupo CRC (), assim como entre o grupo saudável e o grupo CRC estágio III ou IV ( e 0,001, respectivamente). A percentagem de células CD16+CD56+ NK circulantes em linfócitos foi negativamente correlacionada com a ocorrência do CRC. Ao comparar o pool de casos CRC dos estágios I e II com o pool de casos CRC dos estágios III e IV usando células CD16+CD56+ NK circulantes, a área sob a curva da Característica Operacional do Receptor foi de 0,878. Utilizando um valor de corte ótimo de 15,6%, o OR foi de 0,06 (0,03, 0,11), a sensibilidade foi de 86,5%, a especificidade foi de 72,5%, o valor preditivo positivo foi de 74,2%, e o valor preditivo negativo foi de 85,5%. Conclusões. As células CD16+CD56+ NK circulantes podem ser usadas como uma ferramenta de triagem e diagnóstico/estadiamento para CRC.

1. Introdução

Câncer colorretal (CRC) tem uma incidência de cerca de um milhão por ano e causa a morte de quase 700.000 pessoas a cada ano, classificando-o como o quarto câncer mais mortal do mundo. A presente estratégia de rastreio do CRC enfrenta baixa sensibilidade e/ou especificidade nos testes baseados em fezes, etapas tediosas de preparação intestinal antes dos exames radiográficos e alto risco de perfuração nos exames endoscópicos. De fato, o melhor teste de triagem e acompanhamento com alta complacência para CRC deve ser facilmente completado e repetido, especialmente considerando os casos de até 25% de não-conformidade no momento do diagnóstico e 50% de recorrência nos casos em estágio inicial após a cirurgia .

O estadiamento e o prognóstico da CRC dependem principalmente da patologia após os procedimentos cirúrgicos . Um imunoscore consensual em seções de parafina para a classificação e prognóstico da CRC foi um exemplo prático . Embora vários estudos tenham empregado biomarcadores complementares e não invasivos no diagnóstico de CRC , ainda falta uma ferramenta de previsão confiável com alta sensibilidade, bem como especificidade para o diagnóstico e/ou estadiamento da CRC antes da cirurgia.

Sabe-se que o sistema imunológico está envolvido no desenvolvimento e progressão da CRC . A infiltração imunitária de diferentes células imunitárias no CRC tem demonstrado estar relacionada com metástases e prognóstico . Além disso, as células imunes circulantes podem refletir a resposta imunológica local no microambiente do tumor , fornecendo assim informações potencialmente importantes sobre a progressão da doença na CDC . As células naturais assassinas (NK), como um subconjunto importante das células imunes, cuja atividade é desencadeada por um equilíbrio delicado e evolutivo entre os sinais ativadores e inibidores recebidos pelos receptores de superfície celular, são considerados alvos interessantes para estudos translacionais e clínicos.

Neste estudo, analisamos as células CD16 e CD56 duplamente positivas NK nos estágios saudáveis e diferentes dos pacientes com CRC antes do tratamento inicial, tentando descobrir o valor das células CD16+CD56+ NK na previsão e estadiamento pré-tratamento do CRC.

2. Métodos

Este foi um estudo de coorte retrospectivo realizado no 2º Hospital Afiliado da Universidade Médica de Harbin, um hospital terciário no Nordeste da China. A aprovação do Comitê de Ética Institucional foi obtida antes da coleta de dados e o consentimento livre e esclarecido foi obtido dos pacientes na admissão.

Registros clínicos de pacientes que foram admitidos para tratamento inicial de CRC entre 1 de janeiro de 2015 e 31 de dezembro de 2018, no Departamento de Oncologia foram recuperados e revisados. Os pacientes incluídos deveriam ter dados de células NK pré-tratamento disponíveis (o mais recente antes da primeira cirurgia), bem como CRC primário confirmado histologicamente. O estadiamento foi baseado na terminologia do Tumor Node Metastasis (TNM). Pacientes com diagnóstico pouco claro, complicado com outros cânceres, foram admitidos após tratamentos prévios para CRC, com outras doenças crônicas (como doenças cardiovasculares e endócrinas), ou com infecções virais ou bacterianas foram excluídos. Os participantes saudáveis com idade e IMC (sem queixas clínicas que apenas completaram o exame físico anual no momento da inscrição) foram inscritos no grupo controle.

Amostras de sangue venoso periférico de jejum foram coletadas de todos os participantes antes do tratamento (para o grupo CRC) ou no dia do exame anual (para controles saudáveis) em um tubo revestido de heparina e mantido a 2-8°C. 100 μl de sangue recém-colhido foi transferido para um tubo específico de fluxo. 20 μl de um reagente BD Multitest TBNK de 6 cores (Ref # 644611, BD, EUA, incluindo CD3 FITC, CD16 PE+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC, e CD8 APC-Cy7) foi adicionado para estudo de citometria de fluxo de acordo com o manual de fabricação, dentro do painel do qual CD16+CD56+ células NK especificamente quantificadas dentro da população linfocitária. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos no escuro e tratada com 2,5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos (Sigma-Aldrich) durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. A mistura foi lavada duas vezes com tampão PBS, ressuspendida e fixada em 0,5 ml de PBS contendo 0,9% de formaldeído (Sigma-Aldrich), e analisada usando um sistema de citômetro de fluxo FACSCanto II (BD Biosciences) pelo software FACSDiva™ versão 8.0 (BD Biosciences). Pelo menos 20.000 células foram analisadas na porta P1 de cada amostra.

2,1. Análise estatística

Dados discretos foram expressos como o número de casos (porcentagens) e analisados usando teste ou teste exato de Fisher, juntamente com odds ratio (OR) e intervalo de confiança de 95% (IC 95%), o que for aplicável. Os dados contínuos foram mostrados como o e foram analisados usando o -teste. Área sob a curva Receiver Operating Characteristic (ROC) foi usada para mostrar o valor da previsão. SPSS 24.0 (IBM Corp., Armonk, NY) foi utilizado para a análise estatística. Uma bifacetada é considerada significativamente diferente.

3. Resultados

Durante o período de estudo pré-definido, 2.714 pacientes com CRC foram admitidos em nosso hospital. De acordo com os critérios de inclusão pré-definidos, 66 pacientes do estágio I, 60 do estágio II, 70 do estágio III e 68 do estágio IV foram incluídos em nosso estudo. Outros 60 participantes saudáveis, com idade e IMC compatíveis, foram incluídos no grupo controle. Não houve diferenças significativas em idade, sexo, peso corporal, altura ou IMC entre os controles saudáveis e os casos de CRC ou entre diferentes grupos (, Tabela 1).

3.1. O valor preditivo das células CD16+CD56+ NK circulantes no CRC

Existiu uma diferença significativa nas células CD16+CD56+ NK circulantes entre o grupo saudável e os casos CRC (, Tabela 1). A percentagem de células CD16+CD56+ NK circulantes em linfócitos foi negativamente correlacionada com a ocorrência de CRC.

A curva Receiver Operating Characteristic (ROC) foi utilizada para mostrar o papel das células CD16+CD56+ NK na predição de CRC. Ao comparar controles saudáveis com casos de CRC como um todo (Figura 1), a área sob a curva (AUC) foi de 0,725 (Tabela 2). Utilizando um valor de corte ótimo de 19,7%, o OR foi de 0,08 (0,04, 0,15), a sensibilidade foi de 80,0%, a especificidade foi de 76,9%, o valor preditivo positivo (VPP) foi de 44,0% e o valor preditivo negativo (VPL) foi de 94.4%.

Figura 1

Curva de Característica Operacional (ROC) do receptor de células NK na predição de casos de CRC (saudável vs. casos).

3.2. Células CD16+CD56+ NK circulantes em diferentes estágios do CRC

Não houve diferenças nas células CD16+CD56+ NK circulantes entre o grupo saudável e o grupo CRC dos estágios I ou II ( e , respectivamente), mas existem diferenças significativas entre o grupo saudável e o grupo CRC dos estágios III ou IV (, , e , respectivamente, Tabela 1). Como não houve diferenças nas células CD16+CD56+ NK entre o grupo sadio e o grupo CRC de estágio I ou II, ao comparar o pool de casos CRC de controle sadio+CRC de estágio I+II com o pool de casos CRC de estágio III+IV (Figura 2), a CDC foi de 0,892 (Tabela 2). Utilizando um valor de corte ótimo de 15,6%, o OR foi de 0,07 (0,04, 0,12), a sensibilidade foi de 84,4%, a especificidade foi de 72,5%, o VPP foi de 80,5% e o VPL foi de 77,5%.

Figura 2

Curva da Característica Operacional do Receptor (ROC) das células NK em diferentes estágios dos casos de CRC (saudáveis+estágios 1&2 vs. estágios 3&4).

Ao comparar o pool de casos CRC dos estágios I e II com o pool de casos CRC dos estágios III e IV (Figura 3), a AUC foi de 0,878 (Tabela 2). Utilizando um valor de corte ótimo de 15,6%, o OR foi de 0,06 (0,03, 0,11), a sensibilidade foi de 86,5%, a especificidade foi de 72,5%, o VPP foi de 74,2%, e o VPL foi de 85,5%.

Figura 3

Curva da Característica Operacional do Receptor (ROC) das células NK em diferentes estágios dos casos de CRC (estágios 1&2 vs. Discussão

Broadly falando, baseado na expressão CD56, as células NK podem ser subdivididas em CD56bright e CD56dim. As primeiras células estão associadas à imunorregulação e produção de citocinas pró-inflamatórias, enquanto as últimas células são citotóxicas. O CD16 (FcγRIII) em células NK mede a citotoxicidade mediada por células anti-corpo, e a presença de CD16 exclui assim o envolvimento de certas células NK correlacionadas com células T ou B .

Recentemente, dois estudos utilizaram o CD3-CD56+ como marcadores para células NK. Um estudo relatou a presença de subconjuntos de células NK em pacientes com CRC, com uma conclusão de que “a porcentagem de células CD16+ do tipo NKT foi independentemente associada com menor sobrevida livre de doença em pacientes com CRC” . Entretanto, os autores inscreveram apenas um número limitado de pacientes, e a estratificação por diferentes estágios, assim como uma divisão da população de células CD56bright e CD56dim NK, diluiu ainda mais o poder de seus dados. Além disso, alguns desses pacientes já receberam tratamento radiológico antes da coleta de células NK, o que pode introduzir heterogeneidade (uma mistura de pacientes inicialmente tratados e pós-tratamento) na população de pacientes agrupados. Outro estudo relatou uma correlação negativa entre as células NK periféricas e o estadiamento TNM do CRC, com uma diferença significativa nas células NK entre as saudáveis e os estágios I e II, e saudáveis e o estágio IV, mas não entre saudáveis e o estágio III. Esta tendência inconsistente pode ser devida ao pequeno número de pacientes inscritos em cada grupo. Em nosso estudo, coletamos mais pacientes, e apenas pacientes sem tratamento prévio foram inscritos para análise, o que poderia mostrar a condição corporal natural sob a carga da CRC. Assim, nossos dados, por serem homogêneos, são aplicáveis como um teste de triagem antes do tratamento inicial.

A outra potência do nosso estudo reside na exclusão de casos de infecção viral ou bacteriana. Existem receptores ativadores e receptores inibitórios na superfície das células NK . Os receptores ativadores das células NK, como foram exemplificados por Ly49H, KIR2DL3 ou KIR3DS1, são necessários para a eliminação de citomegalovírus, vírus da hepatite C ou infecções pelo vírus Epstein-Barr, respectivamente. Por outro lado, os receptores inibitórios de células NK, como foram exemplificados pelo CD94-NKG2A , ou KIRs , também estão envolvidos no caso de infecção viral. O equilíbrio entre os receptores ativadores e inibitórios é mantido por meio da ligação receptor-ligante. Os receptores tipo Toll-like (TLRs) podem ser ativados por lipopolissacarídeo, um componente de bactérias gram-negativas. A estimulação dos TLRs nas células NK também tem sido relatada como estando envolvida na ativação das células NK. Portanto, a exclusão de casos de infecção viral ou bacteriana reduzirá a heterogeneidade desses casos na análise de casos de CRC.

Há relatos do prognóstico de CRC baseado na coloração imunohistoquímica para detectar mutação ou polimorfismo genético, ou ativação, que só é viável após procedimentos cirúrgicos. Uma categoria de biomarcadores circulantes para CRC se enquadra no âmbito da regulação gênica (microRNA ou metilação). Outra categoria reside na análise metabólica do soro. Neste sentido, as células CD16+CD56+ NK circulantes têm um papel preditivo tanto no rastreamento quanto no estadiamento antes dos procedimentos cirúrgicos.

5. Conclusão

Em resumo, verificamos que a porcentagem de células CD16+CD56+ NK circulantes estava negativamente correlacionada com a ocorrência de CRC e o estadiamento de CRC. Utilizando um valor de corte de 19,7% e 15,6%, a porcentagem de células CD16+CD56+ NK circulantes foi capaz de diferenciar entre casos saudáveis e CRC ou casos de estágio I+II e III+IV, respectivamente.

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