Câncer colorretal hereditário não-polipose (HNPCC) é uma desordem geneticamente heterogênea causada por mutações na linha germinal em um dos vários genes MMR (Jiricny, 1998a,b), embora as evidências atuais sugiram que as mutações da linha germinal no hMSH2 e hMLH1 são responsáveis pela maioria dos casos de HNPCC (Peltomäki e Vasen, 1997). Os portadores do gene HNPCC herdam uma mutação em um dos alelos que codificam um gene MMR, e a segunda cópia é mutada ou perdida como um evento precoce no desenvolvimento de um tumor. Este segundo evento torna deficiente o reparo da má combinação do DNA celular (MMR), presumivelmente levando ao rápido acúmulo de mutações que impulsionam o desenvolvimento do tumor. O que causa exatamente a predisposição subjacente ao câncer colorretal em indivíduos com HNPCC ainda não foi elucidado. Tem sido demonstrado que uma montagem precisa de complexos MMR humanos é essencial para uma MMR eficiente a fim de manter a integridade genómica (Drummond et al., 1997). Estes dados sugerem que, dependendo da natureza da mutação nos genes MMR, e da expressão destes, a composição, e com isso a atividade, dos complexos de reparação do DNA varia entre os indivíduos HNPCC. Também, o envolvimento de pelo menos hMLH1 e hMSH2 em outras vias celulares, como a recombinação do DNA e a regulação do ponto de controle do ciclo celular (Jiricny, 1998a,b), que controlam a estabilidade do genoma podem ser afetados por mutações nos genes hMLH1 e hMSH2. Portanto, o desenvolvimento tumoral e o curso da doença podem variar entre as famílias HNPCC (Jäger et al., 1997). A importância das interações proteína-proteína nos complexos reparadores é suportada pelos achados de que hMSH2 existe em complexo com hMSH6 (hMutSα) ou hMSH3 (hMutSβ) e a proteína hMLH1 em complexo com hPMS2 (hMutLα), hPMS1 (hMutLβ) ou hMLH3 (Drummond et al., 1995; Li e Modrich, 1995; Lipkin et al., 2000; Palombo et al., 1995; Papadopoulos et al., 1995; Räschle et al., 1999). A proteína hMSH2 também demonstrou interagir com a exonuclease humana 1 (hEXO1) (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998). Embora não se saiba se a hEXO1 está envolvida em MMR, as cepas de levedura deficientes em atividade de exonuclease 1 mostram taxas de mutação espontânea aumentadas e um pequeno aumento na recombinação quando o intermediário heterodúplexo contém desajustes de base ou pequenos loops (Nicholson et al., 2000; Tischkoff et al., 1997, 1998). Sabe-se que tanto a exonuclease 1 (EXO1) como as proteínas MMR estão envolvidas na recombinação homóloga (Fiorentini et al., 1997; Saparbaev et al., 1996; Sugawara et al, 1997) e que a levedura EXO1 desempenha um papel no reparo de quebra de dupla cadeia e no cruzamento meiótico (Tsubouchi e Ogawa, 2000).

Muitos estudos do HNPCC têm focado na identificação de mutações nos genes hMLH1 e hMSH2. Entretanto, a análise mutacional desses genes não determina os defeitos moleculares e bioquímicos subjacentes a essa doença. Para melhorar a compreensão da relação entre a perda da função do gene hMLH1 e o HNPCC, caracterizamos interações protéicas específicas dos complexos hMutLα e hMLH1-hEXO1, usando formas mutantes de hMLH1 encontradas em pacientes com HNPCC. Utilizamos o sistema bi-híbrido de levedura, bem como um ensaio de interação glutationa S-transferase (GST)-fusão (pull-down) para estudar tais interações protéicas in vivo e in vitro, respectivamente.

A proteína hMLH1 existe predominantemente em um complexo com hPMS2 também conhecido como o heterodímero hMutLα (Li e Modrich, 1995). A formação de um complexo hMutLα é essencial para a atividade MMR (Baker et al., 1995, 1996; Edelmann et al., 1996) e, portanto, a incapacidade das proteínas HNPCC-hMLH1 de formar um complexo com hPMS2 poderia resultar em atividade MMR ineficiente em indivíduos com HNPCC. Para investigar a causa potencial subjacente ao HNPCC, examinamos se três mutantes hMLH1 identificados em pacientes dinamarqueses com HNPCC (Figura 1) eram capazes de interagir com o hPMS2. As mutações incluíram uma mutação de falta de metionina a mísseis no códon 117 (T117M) do hMLH1 e duas novas mutações do HNPCC, uma mutação sem sentido (CAG a TAG) no códon 426 (Q426X) e uma mutação frame-shift (inserção de A no nucleotídeo 1813) resultando em uma parada prematura no códon 609 (1813insA) (Figura 1). O ensaio de tracção com proteínas HNPCC recombinantes marcadas com GST e transcritas e traduzidas in vitro (IVTT) hPMS2 revelou como esperado a formação de um complexo entre hMLH1 e hPMS2 (Figura 2a, faixas 5 e 10). Além disso, detectamos a formação de um complexo entre HNPCC-hMLH1 (T117M) e hPMS2 (Figura 2a, pista 11). Embora tenhamos encontrado que a proteína HNPCC-hMLH1 (T117M) é expressa em células NIH3T3 eucarióticas (dados não mostrados), não conseguimos reproduzir a interação com hPMS2 no ensaio de levedura bi-híbrida (Figura 3a). Uma explicação para esta discrepância poderia ser a tripla redução da formação de complexos entre hPMS2 e a proteína mutante HNPCC-hMLH1 (T117M) em comparação com as proteínas hPMS2 e hMLH1 como quantitativo com um fosfoimager (dados não mostrados) (Figura 2a, faixas 10 e 11). Em contraste, formações complexas entre as proteínas hMLH1, HNPCC-hMLH1 (Q426X) e HNPCC-hMLH1 (1813insA), e hPMS2 não foram detectadas em nenhum dos ensaios (Figura 2a, faixas 12 e 13 e Figura 3a). Uma banda fraca na reação de pull-down contendo HNPCC-hMLH1 (1813insA) e hPMS2 foi visível (Figura 2a, pista 13) mas a intensidade foi semelhante à banda obtida na reação contendo apenas a proteína hPMS2 (Figura 2a, pista 3) e é, portanto, improvável que represente um verdadeiro complexo entre HNPCC-hMLH1 (1813insA) e hPMS2.

(a) Alinhamento sequencial da família MutL. hMLH1: homólogo humano MutL hMLH1, yMLH1: Saccharomyces cerevisiae MutL homólogo MLH1, MutL: Escherichia coli MutL. Os resíduos conservados são mostrados em negrito. O alinhamento sequencial foi realizado utilizando o ClustalW Alinhamento de Sequências Múltiplas. (b) Estruturas das proteínas hPMS2, hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X), HNPCC-hMLH1 (1813insA), hEXO1a/HEX1, hEXO1b, hEXO1a/HEX1-N-terminal, hEXO1a/HEX1-C-terminal e hEXO1b-C-terminal (Y5). Três famílias dinamarquesas diagnosticadas com HNPCC foram identificadas através do registo dinamarquês HNPCC. Duas novas mutações do HNPCC, uma mutação sem sentido (CAG para TAG) no códon 426 (Q426X) e uma mutação frame-shift (inserção de A no nucleotídeo 1813) resultando em uma parada prematura no códon 609 (1813insA) do hMLH1, foram identificadas em famílias que preenchiam os critérios de Amsterdam. A terceira mutação, uma mutação de três linhas para a falta de metionina no códon 117 (T117M) do hMLH1, foi previamente descrita (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm). A região de codificação do hMLH1 foi clonada no site EcoRI do pcDNA3 e utilizada como modelo para a mutação primer-mediated mutagenesis para construir as três diferentes mutações do HNPCC no hMLH1, T117M, Q426X, e 1813insA. A sequência de DNA de todas as mutações sintéticas e fragmentos amplificados por PCR foram confirmados por sequenciamento de DNA. As outras construções usadas neste estudo são hPMS2 (cDNA de comprimento total), HEX1-N (1355 bp N-terminal region of HEX1/hEXO1a), HEX1-C (1182 bp C-terminal region of HEX1/hEXO1a), e hEXO1b-C (Y5) (1952 bp C-terminal region of hEXO1b). Todas as construções do HEXO1 são descritas em detalhes em Rasmussen et al., 2000)

Ensaio de proteína de fusão GST para estudar a interação entre as proteínas hMLH1 e hEXO1b ou hPMS2. (a) Pista 1, proteína hPMS2 rotulada de ITV; pista 2,+GST; pista 3,+BL21 lisado; pista 4,+ proteína GST purificada; pista 5,+ proteína GST-hMLH1 purificada; pista 6, proteína GST-hMLH1 purificada e vetor ITV rotulado; pista 7, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) purificada e rotulada vetor IVTT; pista 8, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) purificada e rotulada vetor IVTT; pista 9, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) purificada e rotulada vetor de TV IV; pista 10, proteína GST-hMLH1 purificada e rotulada de TV IVTT hPMS2; pista 11, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (T117M) purificada e rotulada de TV IVT hPMS2; pista 12, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) purificada e rotulada de proteína IVTT hPMS2; e pista 13, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) purificada e rotulada de proteína IVTT hPMS2. (b) Pista 1, proteína IVTT hEXO1b; pista 2,+GST contas; pista 3,+BL21 lisado; pista 4,+ proteína GST purificada; pista 5,+ proteína GST-hMLH1 purificada; pista 6, proteína GST-hMLH1 purificada e rotulada vetor IVTT; pista 7, proteína GST-hMSH2 purificada e rotulada proteína IVTTT hEXO1b; pista 8, proteína GST-hMLH1 purificada e rotulada IVTTT hEXO1b; pista 9, proteína GST-HNPCC-hMLH1 purificada (T117M) e rotulada IVTTT hEXO1b; pista 10, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (Q426X) purificada e proteína IVTTT hEXO1b rotulada; e pista 11, proteína GST-HNPCC-hMLH1 (1813insA) purificada e proteína IVTTT hEXO1b rotulada. Todas as reacções de tradução de transcrição in vitro foram realizadas utilizando o sistema de lisado reticulocitário acoplado a TNT (Promega). Resumidamente, os lisados foram incubados com 1 μg de DNA, mistura de aminoácidos sem cisteína, 35S-Cisteína e T9 RNA polimerase, durante 90 min a 30°C, de acordo com as instruções do fabricante. O vetor pGEX (Pharmacia-Amersham) foi utilizado para construir GST-hMLH1, GST-hMLH1 (T117M), GST-hMLH1 (Q426X), GST-hMLH1 (1813insA), e GST-hMSH2. Todas as construções do pGEX são proteínas de fusão de GST-terminal N. A sequência de ADN da região de codificação completa confirmou todos os construtos. As proteínas de fusão foram purificadas conforme descrito por Guerrette et al. (1998), exceto pelo uso de culturas de E. coli não-induzidas. Os ensaios de arrancamento foram realizados conforme descrito por Guerrette et al. (1998), exceto para incubação das proteínas durante 2 h a 30°C antes da carga das misturas de reação nos géis

Interacção do hMLH1, HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X), e HNPCC-hMLH1 (1813insA) com hPMS2 ou hEXO1 no sistema bi-híbrido de levedura. (a) A atividade β-galactosidase, listada como unidades Miller, foi determinada conforme descrito em Rasmussen et al. (2000). (b) e (c) Estirpes contendo vários plasmídeos foram estriadas em placas SD-LEU-TRP+X-gal. Os plasmídeos contidos em cada estirpe testada são indicados no topo de cada coluna e à esquerda de cada linha. AD: domínio de ativação, BD: domínio de vinculação. Os vetores de levedura pAS2-1, pBRIDGE e pACT2 (CLONTECH) foram usados para construir as proteínas de fusão GAL4. Os ensaios de levedura bi-híbrida foram realizados como descrito anteriormente (Rasmussen et al., 2000). Em resumo, as regiões codificadoras do hMLH1 ou HNPCC-hMLH1 foram amplificadas por PCR e clonadas nos sítios EcoRI e BamHI da pBRIDGE ou nos sítios NcoI e BamHI da pACT2. hPMS2 foi amplificado por PCR utilizando pREP4-hPMS2 (Risinger et al., 1998) como modelo e clonado nos sítios NdeI e BamHI da pAS2-1 e SmaI e EcoRI da pACT2. Todos os outros plasmídeos são descritos em Rasmussen et al. (2000). Nenhum dos plasmídeos mostrou interação com os dois vetores híbridos sem inserção

Consistentemente, foi previamente demonstrado por mutagênese de deleção que a interação hMLH1 e hPMS2 é mediada pela parte terminal C do hMLH1 (aminoácidos 506-756) e a parte terminal C do hPMS2 (aminoácidos 675-850) (Figura 1b) (Guerrette et al, 1999). A mutação HNPCC-hMLH1 (T117M) foi relatada em nove famílias HNPCC não relacionadas de diferentes partes do mundo (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm e dados não mostrados) sugerindo, como já demonstrado em leveduras (Shcherbakova e Kunkel, 1999; Shimodaira et al., 1998), que a mutação não é um polimorfismo ligado. O HNPCC-hMLH1 (T117M) mapeia a mutação para uma sequência conservada (Figura 1), que se acredita estar diretamente envolvida na ligação e/ou hidrólise de ATP (Ban et al., 1999). Assim, a mutação de falta HNPCC-hMLH1 (T117M) pode inativar a atividade de MMR alterando a capacidade desta proteína mutante de ligar e/ou hidrolisar ATP e com aquela formação complexa com outras proteínas MMR. Em concordância com esta hipótese, mostramos que indivíduos HNPCC portadores das mutações HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) e HNPCC-hMLH1 (1813insA) são prejudicados na formação do heterodímero hMutLα, o que leva a um defeito na atividade do MMR quando o segundo alelo hMLH1 é perdido ou inativado.

Numa tentativa de identificar fatores associados à MMR tecidual específica, nós e outros identificamos recentemente uma exonuclease humana que interage com hMSH2 (Rasmussen et al, 2000; Schmutte et al., 1998; Tishkoff et al., 1998; Wilson III et al., 1998). Demonstramos que hMSH2 interage com ambas as formas de hEXO1, hEXO1b e hEXO1a/HEX1, e que essa interação é mediada através de seus domínios C-terminais. Em contrapartida, não detectamos nenhuma interação entre hMSH6 e hEXO1 no sistema bi-híbrido (Rasmussen et al., 2000). Não se sabe se o hEXO1 desempenha um papel no MMR ou se sua interação com o hMSH2 é importante para a recombinação. Mostramos que a proteína hMLH1, como a hMSH2, interage com ambas as formas de hEXO1 (hEXO1b e hEXO1a/HEX1) e que esta interação é mediada através dos domínios terminais C das exonucleases (Figura 2b, faixas 5 e 8 e Figura 3). Não detectamos nenhuma interação entre hPMS2 e hEXO1 (Figura 3a,c). Nossos dados preliminares sugerem que a presença das proteínas hMLH1 e hPMS2 não impediu a ligação do hEXO1 ao hMLH1 (dados não mostrados). Portanto, não acreditamos que a formação hMutLα bloqueie necessariamente a ligação do hEXO1 ao hMLH1. Para melhor caracterizar a interação hMLH1-hEXO1, construímos fusões de proteínas fluorescentes tanto de hMLH1 como de hEXO1 e as introduzimos em células NIH3T3 (Figura 4). Nossos resultados revelam que a CFP-hMLH1 está principalmente presente no núcleo, mas também detectamos uma fração desta proteína no citoplasma (Figura 4, painel 1). Em contraste, detectamos apenas YFP-hEXO1 no núcleo (Figura 4, painel 2). Na cotransfecção com YFP-hEXO1, entretanto, o CFP-hMLH1 foi inteiramente nuclear (Figura 4, painéis 3 e 4).

Localização nuclear das proteínas de fusão CFP-hMLH1 e YFP-hEXO1b. No dia do tratamento as células murinas NIH3T3 foram transitoriamente transfectadas com 3,5 μg CFP-hMLH1 (painel 1) ou de YFP-hEXO1b (painel 2) ou ambas as construções (painéis 3 e 4). As células foram incubadas durante a noite e no dia seguinte a localização subcelular das proteínas de fusão foi examinada por microscopia de varredura a laser confocal. As células transfectadas são mostradas, além disso, na imagem Nomarski correspondente. O cDNA hMLH1 foi clonado nos sítios EcoRI e BamHI do vetor pECFP-C2 (CLONTECH) e o cDNA hEXO1b foi clonado nos sítios BamHI e SalI do vetor pEYFP-C1 (CLONTECH). Ambas as construções das proteínas fluorescentes são N-terminal fusions

Em resumo, estes resultados demonstram que pelo menos duas proteínas MMR, nomeadamente, hMSH2 e hMLH1, interagem com a exonuclease humana 1 enquanto que duas outras proteínas MMR, hPMS2 e hMSH6, não estão directamente envolvidas na interacção hEXO1 quando avaliadas no ensaio in vivo de duas híbridas.

Para examinar se as interações hMLH1 e hEXO1 podem ser afetadas em pacientes com HNPCC, a associação das três proteínas mutantes hMLH1 descritas acima com hEXO1 foi caracerizada. A interação positiva só foi demonstrada entre HNPCC-hMLH1 (T117M) e a proteína hEXO1b completa através do ensaio in vitro pull-down (Figura 2b, pista 9). No entanto, utilizando o ensaio in vivo de interação protéica de dois híbridos entre as proteínas HNPCC-hMLH1 e as construções exonuclease 1 testadas não puderam ser detectadas (Figura 3). Não foi possível estudar a interação entre as proteínas hEXO1 de comprimento total fundidas ao domínio de ativação GAL4 e as proteínas hMLH1, uma vez que estes construtos não são funcionais no ensaio de levedura bi-híbrida (Rasmussen et al., 2000). Da mesma forma, verificamos que o hMLH1 e os derivados hMLH1 fundidos ao domínio de ativação GAL4 resultaram em proteínas de fusão não funcionais no ensaio bi-híbrido (Figura 3 e dados não mostrados).

Em conclusão, nossos resultados revelam que três novas mutações HNPCC-hMLH1 conhecidas por co-regregar com suceptibilidade ao câncer em pacientes com HNPCC levam a um defeito na montagem do heterodímero hMutLα que poderia resultar em redução da atividade MMR. Da mesma forma, as proteínas mutantes HNPCC-hMLH1 também são incapazes de interagir com a proteína hEXO1 recentemente identificada, uma proteína que agora parece interagir com hMLH1 e hMSH2, mas não com hMSH6 e hPMS2. Atualmente, os caminhos biológicos precisos e as contribuições gerais dessas interações documentadas permanecem pouco claros, em grande parte porque a hMLH1 tem desempenhado um papel tanto no MMR quanto na recombinação. A dissecção dos defeitos moleculares no HNPCC através de testes de proteínas MMR patogênicas em ensaios funcionais concebidos para quantificar as interações nos complexos proteicos deve, juntamente com a triagem mutacional, a imunohistoquímica e a análise de microsatélites, ajudar no desenvolvimento de estratégias para diagnosticar e tratar portadores de HNPCC.