Conteúdo

>

>

Caption

Acima está uma imagem JMOL do MK-0518 bloqueando a extremidade de 3′ do DNA viral de ligar o local ativo. Observe os átomos de oxigênio quelante metálico no MK-0518 interagindo com os cátions de magnésio encontrados no local ativo.

HIV integrase tipo 1 é um alvo relativamente novo e novo para os inibidores. Em 2007, o primeiro inibidor da integrase do HIV-1, Raltegravir, foi aprovado pela FDA para uso no HIV-1 como terapia combinada. Os inibidores de transferência de estrangulamento funcionam impedindo a integração concertada do DNA viral no cromossoma hospedeiro. Após a entrada viral na célula hospedeira, a transcriptase reversa converte o ssRNA viral em dsDNA. Neste ponto, a integrase forma um complexo com o DNA viral, criando o complexo de pré-integração (intasome). O complexo de pré-integração é então acompanhado no núcleo, onde dois nucleotídeos são excisados a partir da extremidade de 3′. Em seguida, o DNA é então covalentemente integrado ao DNA hospedeiro. Os inibidores de transferência de fios interrompem este processo, impedindo a integração do ADN viral no cromossoma hospedeiro. Os inibidores de transferência de strand-transfer funcionam encaixando os cofactores de iões metálicos encontrados no local activo da integrase retroviral. Os átomos de oxigênio quelantes metálicos encontrados nos inibidores interagem diretamente com os cofatores metálicos, enquanto o grupo halobenzil cabe na bolsa criada pelo DNA viral 3′ deslocado no local ativo.

HIV e AIDS

Em 2010, mais de 25 milhões de pessoas morreram de AIDS, e estima-se que aproximadamente 33 milhões de pessoas estão vivendo com HIV.

Até hoje, mais de 25 milhões de pessoas morreram de AIDS, e estima-se que aproximadamente 33 milhões de pessoas estão vivendo com HIV hoje. Para inibidores de integrase retroviral ver Raltegravir e Inibidor de Integrase Retroviral Farmacocinética.

Impacto da Estrutura

Estruturas tridimensionais para certas proteínas de células hospedeiras críticas para compreender o mecanismo da infecção pelo HIV e virulência emergiram de análises cristalográficas de raios X. As estruturas protease e integrase do HIV estão entre as estruturas mais bem classificadas que contribuíram para salvar muitas vidas e adicionaram à qualidade de vida de muitos indivíduos infectados pelo HIV. É implementado no desenho de medicamentos baseados em estruturas para desenvolver inibidores de protease e de integrase, e é usado como um componente significativo da terapia anti-retroviral altamente activa (HAART).

Embora os agentes anti-retrovirais existentes melhorem a qualidade de vida, bem como prolonguem a vida de muitos pacientes, não conseguem erradicar a doença. Estudos em inibidores da integrase mostram que a combinação com outros medicamentos anti-retrovirais diminui as adaptações virais e pode ter o potencial de ser usada para a terapia de salvamento de pacientes que adquiriram resistência a outros medicamentos. Para mais, por favor veja

• AIDS Antes dos Inibidores de Protease & Inibidores de Protease do HIV: A Breakthrough
• Tratamentos: Inibidores de Integrase Retroviral Referências Farmacocinéticas.

Cristalização Intasome PFV

Para imitar os fins de DNA viral do HIV-1, Hare et al (2010) utilizaram preparações intasome de protótipos solúveis e totalmente funcionais (PFV), obtidas usando integrase PFV recombinante e oligonucleotídeos de dupla cadeia.

A notável estabilidade dos complexos integrase-DNA foi determinada pela observação das reações de transferência de cordões in vitro, que foram classificadas em três modos de migração de desproteção: (1) eventos únicos concertados: plasmídeo alvo linearizado; (2) eventos múltiplos concertados: esfregaço; (3) eventos de meio local: ADN circular aberto. A caracterização adicional do intasome do PFV também exibiu substancialidade estrutural que implicou fortes interações proteína-proteína e proteína-ADN apesar da incubação prolongada sob condições de alta resistência iônica. Ensaios compreensivos de cristalização efetuaram uma configuração cristalina viável que difratou os raios X para uma resolução de 2,9 Angstroms. Uma estrutura tridimensional foi finalmente determinada. A unidade assimétrica continha um único dímero integrase com uma molécula viral de DNA estavelmente ligada, e um par de dímeros integrase consolados com simetria, que formava um tetrâmero oblongo. A interface do dímero é estabilizada por interações intermoleculares dos domínios do amino terminal e do núcleo catalítico (subunidade interna da subunidade). A forma geral do tetrâmero oblongo é única, embora com semblantes para complexos integrase HIV-1 previamente relatados.

Técnica de cristalização

Os complexos proteína-DNA foram formados usando o PFV IN de comprimento total, tipo selvagem e dsDNA sintético que modelou a extremidade viral.

O intasome foi cristalizado usando a técnica de difusão de suspensão de vapor-droping. A solução do reservatório consistiu de sulfato de amônio 1,35 M, glicerol 25% (v/v), 1,6-hexanodiol 4,8% (v/v) e ácido etanossulfônico (MES) 50mM 2-(N-morpholino) a pH 6,5. Os cristais de proteínas-DNA também foram embebidos na presença de MK0518, GS9137, Mg(II), e/ou Mn(II). A estrutura cristalina foi resolvida usando substituição molecular.

Estatísticas Cristalográficas e de Refinamento

Hare et al (2010) publicaram dados sobre sete estruturas cristalinas. Estes dados incluem o complexo PFV IN (apo form) e seis estruturas adicionais, incluindo o complexo ligado a Mg, Mn, Mg/MK0518, Mn/MK0518, Mg/GS9137, e Mn/GS9137. Todas as sete estruturas pertencem ao grupo espacial P41212. Elas foram refinadas entre 2,85 e 3,25 Å resolução.

Arquitetura geral & Componentes

Estrutura

A estrutura geral do intasome PFV montado é um modelo de tetrâmero baseado em duas estruturas de domínio com uma interface dimer-dímero. Modelos intasome anteriores descrevem uma estrutura similar, mas mais flexível, enquanto o intasome PFV mostrou ser altamente limitado. Usando a modelagem homológica, Hare et al (2010) propõem que ligadores interdomínios mais curtos podem ser um fator de flexibilidade, especificamente na integrase do HIV-1. As subunidades internas do tetrâmero estão implicadas na tetrâmerização geral e na ligação do DNA viral. Os domínios centrais catalíticos das subunidades externas podem funcionar como suportes, mas como os domínios amino- e carboxi-terminais não estão resolvidos nos mapas de densidade de elétrons, sua função permanece inconclusiva. O domínio do núcleo catalítico e o ligador do domínio carboxi-terminal adotam uma conformação estendida para a maior parte do seu comprimento, e estão localizados paralelamente ao domínio amino-terminal e ligador do domínio do núcleo catalítico da subunidade interna. Os ligadores interdomínio Os ligadores interdomínio (CCD-CTD linker e NTD-CCD linker) unem as duas metades do intasome, e a estrutura é ainda mais estabilizada por um par de domínios carboxi-terminais interagindo com ambos os domínios do núcleo catalítico interno.

Interacções de integração e ADN

Interacções proteína-DNA fortes estão localizadas dentro dos seis nucleótidos terminais. Cada domínio terminal carboxi interage com a espinha dorsal do fosfodiéster de ambas as moléculas de DNA viral. Além disso, o domínio amino-terminal de extensão e o domínio amino terminal interagem com o DNA viral no local ativo do núcleo catalítico oposto.

Site ativo

Carboxilatos do local ativo são cadeias laterais do Asp 128, Asp 185, Glu 221.

Um átomo de zinco cada um está localizado perto dos locais ativos.

• .
• .

Inibidores de integração

Veja também Inibidor da Integrase Retroviral Farmacocinética.