3.4 Inosine Modification and mRNA Turnover

Adenosine to inosine (A-I) modification of mRNAs is catalyzed by adenosine deaminases that act on RNA enzymes (ADARs). Estas enzimas têm preferência por regiões de RNA de cadeia dupla, e a conversão de A-I (também descrita como edição nesta seção) irá alterar as propriedades de emparelhamento das bases modificadas, já que agora elas terão um par de bases semelhante à guanina. Como foi feito anteriormente, vamos separar os efeitos diretos da inosina sobre a estabilidade do mRNA daqueles que surgem de efeitos indiretos. A introdução da inosina em regiões de dupla cadeia do RNA pode desencadear degradação através do recrutamento de ribonucleases específicas para RNAs que contenham inosina. A primeira enzima proposta para mediar este efeito é a nuclease tudor-estafilocócica (SN), que demonstrou promover a clivagem de RNAs hipereditados de dupla cadeia em extratos. A maioria dos resultados descritos neste estudo demonstra uma atividade bioquímica para Tudor-SN em substratos hipereditados in vitro. Entretanto, não está claro, a partir destes estudos, que fração dos mRNAs contendo inosina está sujeita à clivagem por Tudor-SN in vivo, e se Tudor-SN foi ou não a endonuclease direta. Tudor-SN foi encontrado localizado em grânulos de estresse citoplasmáticos, portanto é possível que algumas de suas transcrições alvo possam ser reguladas preferencialmente durante condições de estresse. A segunda nuclease conhecida por ser específica para RNAs contendo inosina é a endonuclease V humana (hEndoV), que pode clivar uma variedade de substratos de RNA contendo inosina in vitro . Um estudo sugeriu que hEndoV é a endonuclease inosine real, com Tudor-SN fornecendo uma atividade estimulante para hEndoV . Curiosamente, o hEndoV também se localiza nos grânulos de estresse citoplasmáticos , sugerindo uma função semelhante ao Tudor-SN na regulação potencial dos níveis de mRNAs que contêm inosina durante o estresse. Em geral, embora seja claro que as atividades de nuclease específicas da inosina existem em células eucarióticas (Fig. 5), sua contribuição para a clivagem e o turnover do mRNA permanece mal compreendida. Portanto, o impacto fisiológico da clivagem do dsRNA hipereditário por Tudor-SN e/ou hEndoV precisa ser explorado mais profundamente.

As enzimasADAR também podem desempenhar um papel importante na estabilidade do mRNA regulando a ligação de proteínas de ligação ao RNA que influenciam a decadência do mRNA. A influência dos ADARs no nível dos seus mRNAs alvo foi medida globalmente, e em geral o seu impacto nos níveis de mRNA não se correlaciona bem com a sua capacidade de promover a formação de inosina nestes mRNAs . Pelo contrário, parece que o maior impacto dos ADARs na estabilidade do mRNA é através do recrutamento da proteína de ligação ao RNA HuR (ELAVL1), que é um regulador importante da decadência do mRNA. O ADAR1 interage com HuR de forma dependente do RNA, e a maioria dos mRNAs desregulamentados na ausência do ADAR1 contêm locais de ligação do HuR. Assim, o ADAR1 parece influenciar a estabilidade de seus alvos de mRNA através do recrutamento de HuR para locais alvo localizados nas proximidades. Os ADARs também podem regular os níveis de vários mRNAs e ncRNAs, evitando a ligação do fator de decaimento PARN, que é um nuclease poli(A)-específico. Esta função também parece independente da edição, pois um mutante ADAR catalítico inativo é capaz de cumprir as funções da enzima no controle do decaimento. Assim, o impacto dos ADARs na estabilidade de seus alvos de mRNA parece ser em grande parte independente de sua capacidade de promover a formação de inosina.

Uma das principais conseqüências da modificação da inosina no turnover do mRNA é devido ao impacto da inosina na regulação gênica mediada por microRNA. A presença de inosina pode influenciar dois grandes passos desta via: (i) a biogénese dos microRNAs e (ii) a especificidade de focalização dos mRNAs pelos microRNAs. Em relação ao impacto da inosina na biogénese dos microRNAs, foi demonstrado que os precursores primários dos microRNAs podem ser editados por ADAR1 ou ADAR2 . A presença de inosina nestes precursores tem dois efeitos prejudiciais sobre a produção de microRNAs maduros. Primeiro, a inosina reduz a eficiência do processamento dos precursores primários por Drosha; segundo, os precursores contendo inosina agora se tornam um alvo para ribonucleases específicas da inosina como Tudor-SN e/ou hEndoV. Estes efeitos combinados da modificação da inosina nos precursores primários de microRNAs resultam numa diminuição dos níveis de microRNAs produzidos a partir destes precursores, com um aumento concomitante dos mRNAs alvo. Este processo pode ser regulado, pois os precursores dos microRNA miR-151 mostraram ser editados durante o desenvolvimento inicial, o que resulta na degradação dos precursores por Tudor-SN . Mais genericamente, os precursores de microRNAs contendo inosina são degradados durante os estágios pós-zigóticos em camundongos . Estes resultados mostram que a edição A-I de precursores de microRNAs pode regular sua biogênese durante o desenvolvimento, o que por sua vez afeta diretamente a expressão de seus alvos mRNA. No entanto, o efeito dos ADARs sobre a biogénese do microRNA é complexo, pois foi demonstrado que o ADAR1 também se heterodimeriza com o Dicer da enzima RNase III para aumentar a eficiência do processamento do microRNA, desempenhando assim um papel positivo na biogénese do microRNA. A complexidade dos efeitos diretos e indiretos dos ADARs na biogênese do pequeno RNA também foi demonstrada em Caenorhabditis elegans. Finalmente, ADAR1 também pode ligar siRNAs independentemente da edição do RNA em células de mamíferos, o que limita a eficácia do tratamento do siRNA. Portanto, os ADARs parecem ser uma espada de dois gumes para silenciamento de microRNA e pequenos genes mediados por RNA, já que o efeito supressivo da modificação da inosina no processamento e estabilidade do microRNA precursor pode ser contrabalançado pela capacidade dos ADARs de promover o processamento do microRNA através de sua associação com Dicer, e seu efeito na disponibilidade do siRNA. No entanto, estas enzimas desempenham funções chave no controle da diferenciação celular através da edição de precursores de microRNA. Por exemplo, a hiperedição do precursor do microRNA de Let-7 pelo ADAR1 na leucemia foi mostrada para promover a renovação das células-tronco da leucemia, destacando a importância da sintonia fina da edição dos precursores de microRNA durante a diferenciação celular.

Inosina também influencia a regulação do mRNA mediado pelo microRNA, afetando a formação de duplex de RNA, que é crítica na determinação da especificidade das interações microRNA-mRNA (Fig. 5). Isto foi demonstrado pela primeira vez mostrando que a introdução de inosina no microRNA miR-376 resultou na repressão de um grupo diferente de mRNAs em relação àqueles reprimidos pela miR-376 não modificada. Se o local editado reside na sequência de sementes do microRNA, a modificação resulta numa mudança de especificidade para os microRNAs porque os pares de base inosine preferencialmente com C. Reciprocamente, a edição A-I em 3′-UTR sequências de mRNAs irá alterar o alvo potencial destes UTRs por microRNAs e pode criar novos locais de ligação de microRNA . A edição regulada mostrou ser potencialmente importante na regulação de oncogenes e genes supressores de tumores através de microRNAs durante a transformação celular .

Finalmente, a inosina pode influenciar a estabilidade do mRNA através de efeitos indiretos. Verificou-se que os mRNAs contendo inosina estão restritos ao núcleo das células imunes estimuladas por LPS, prevenindo sua exposição à máquina de decaimento do mRNA citoplasmático. A retenção nuclear desses mRNAs, entretanto, os sujeitaria a degradação preferencial por vias de degradação nuclear, como o exossoma nuclear. Isto pode resultar num aumento ou diminuição da estabilidade, dependendo da eficiência relativa de cada uma dessas vias de degradação em mRNAs específicos. Inosine também impacta em emendas alternativas, o que, por sua vez, pode resultar em isoformas de mRNA com diferentes estabilidades. Isto é especialmente verdade se as espécies emendadas alternadamente contiverem sítios de ligação para proteínas de ligação ao RNA distintas que modulem a sua estabilidade. Portanto, inosina e ADARs podem afetar a estabilidade e expressão do mRNA de muitas maneiras através de uma combinação de efeitos diretos e indiretos.