Resultados

Análise de amostras clínicas.

Em setembro de 2006, o vírus da influenza A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) foi isolado de vários porcos de 5 a 6 semanas com broncopneumonia multifocal em um viveiro comercial de suínos de várias procedências. As lesões pulmonares incluíram broncopneumonia moderada, subaguda a crônica, purulenta e pneumonia intersticial com bronquiolite e peribronquite. O tecido pulmonar foi negativo para o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e Mycoplasma hyopneumoniae, mas foi positivo para Streptococcus suis. Devido às lesões características tipo influenza e aos sinais clínicos de pneumonia, o homogeneizado do tecido pulmonar foi inoculado nas células do rim canino Madin-Darby (MDCK). Os efeitos citopáticos foram detectados no terceiro dia pós-intinoculação (p.i.). O gene nucleoproteína (NP) do vírus da gripe foi detectado nas células infectadas por RT-PCR. O vírus não reagiu com os anti-soros suíno de referência (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) nos ensaios de inibição da hemaglutinação (HI), e multiplex RT-PCR não detectou nenhum gene H1N1 ou H3N2 (14). O vírus foi submetido ao National Animal Disease Center (NADC) em fevereiro de 2007 para subtipagem e seqüenciamento.

Após o isolado de setembro ter sido subtipado e seqüenciado (descrito abaixo), uma pesquisa de registros de casos revelou que outro isolado “atípico” da influenza havia sido submetido em abril de 2006. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) havia sido isolado de um porco de 12 semanas com doença respiratória em outra granja comercial de suínos produtores e acabadores. As lesões pulmonares eram histopatologicamente características da gripe suína (inflamação grave e subaguda de alvéolos e brônquios com necrose epitelial de células bronquiolares e metaplasia). O pulmão foi negativo para PRRSV, PCV2, e M. hyopneumonia, mas foi positivo para o vírus influenza A por RT-PCR (específico para o gene NP) e S. suis. O vírus foi submetido ao NADC em março de 2007 para subtipagem e seqüenciamento.

Subtipagem e Análise Filogenética.

Para identificar e caracterizar ambos os vírus da influenza, foram realizados seqüenciamento de ácidos nucléicos e análise molecular e filogenética. Ambos os vírus foram sequenciados diretamente de isolados de baixa passagem usando células MDCK, e as sequências foram confirmadas após a purificação e ressequenciação da placa. Foram identificados como vírus H2N3 pela sequência de nucleotídeos e uma pesquisa BLAST do Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov). O segmento do gene HA do Sw/4296424 mais parecido com o dos vírus H2 isolados de pallards na América do Norte. Seu segmento de NA estava intimamente relacionado ao de um vírus H4N3 da gripe aviária (AIV) isolado de marrecos de asas azuis (98,3% de identidade). Com exceção do gene da polimerase ácida (PA), seus genes internos eram derivados dos vírus contemporâneos da influenza suína tri-recorrentes, atualmente encontrados nos Estados Unidos. Estes vírus transportam genes internos de origem humana (PB1), aviária (PB2, PA), e vírus da influenza suína (SI Tabela 4). Seu segmento PA foi 99,2% idêntico ao do H6N5 AIV isolado de patos-reais (SI Quadro 4). Os vírus Sw/2124514 e Sw/4296424 apresentaram 99,3-99,9% de identidade total da sequência nucleotídica (SI Quadro 5). Ambos os isolados foram repetidamente clonados com placas, testados novamente e confirmados por sequenciamento para pertencerem ao subtipo H2N3. O subtipo H2N3 foi serologicamente confirmado pelos ensaios de inibição da hemaglutinação e de inibição da neuraminidase. A análise filogenética baseada nos genes HA e NA mostrou que esses dois vírus pertencem à linhagem aviária americana que é distinta das linhagens eurasiáticas e dos vírus H2N2 isolados de humanos após a pandemia de influenza de 1957 (Fig. 1).

Análise molecular das proteínas de superfície HA e NA.

Vírus Influenza A contêm duas proteínas de superfície: a HA é a glicoproteína de ligação ao receptor e de fusão membranar, e a NA é uma enzima destruidora do receptor. O HA viral é um fator crítico da especificidade da espécie hospedeira dos vírus da gripe (15). Para caracterizar os resíduos dentro do HA que podem estar associados à adaptação de um vírus aviário ao hospedeiro mamífero, comparamos as sequências de aminoácidos do HA suíno com as dos putativos vírus aviários de referência. A comparação molecular das moléculas de HA dos dois isolados de H2N3 suíno revelou que elas diferem do suposto vírus H2N3 de referência isolado dos pato-real por seis substituições comuns de aminoácidos (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I e L506V) (SI Tabela 6). A substituição Q226L foi encontrada em ambos os isolados de H2N3 suínos, enquanto a posição 228 continha G, idêntica à sequência de consenso aviário (Tabela 1) (16). Em contraste, moléculas humanas de HA do subtipo H2 contêm 226L e 228S, enquanto os primeiros isolados humanos de H2 contêm 226L e 228G (Tabela 1), semelhantes aos isolados de suínos. As posições 36N, 274I, 316I e 419I são exclusivas dos dois isolados de H2N3 suínos (Tabela SI 6), enquanto as respectivas posições nos isolados humanos e aviários descritos na Fig. 1 a são 36D, 274T, 316V e 419L. Para os isolados de influenza descritos na Fig. 1 a, a posição 506V é conservada entre humanos, dois isolados de H2N3 suínos e os isolados aviários, exceto para A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), como mostra a Tabela SI 6. Foram encontradas duas alterações comuns de aminoácidos na sequência de aminoácidos NA de ambos os isolados de suínos, quando comparados com o vírus H4N3 de referência isolado a partir de marrecos de asas azuis: H47Y e H253Y (SI Quadro 7). A posição 47Y em ambos os isolados de suíno H2N3 é a mesma que o respectivo aminoácido nos isolados de aves eurasiáticas descritos na Figura 1 b; inversamente, a posição nos isolados de aves norte-americanos é 47H. A posição 253Y é exclusiva dos isolados de H2N3 do suíno, e a posição 253H é conservada nos isolados aviários eurasiáticos e norte-americanos descritos na Fig. 1 b. Curiosamente, Sw/4296424 (H2N3), isolado 5 meses depois do Sw/2124514 (H2N3), teve duas substituições adicionais (P162S e L321V) na molécula HA, e teve três substituições adicionais (V30I, I49T e A135T) na molécula NA quando comparado com o HA e NA do Sw/2124514 (Tabelas SI 6 e 7). A posição 30I (Sw/4296424) na molécula de NA é similar aos isolados eurasianos, enquanto a posição 30V (Sw/2124514) é conservada nos isolados aviários norte-americanos.

Patogenicidade e Transmissibilidade dos Vírus da Gripe Suína H2N3 em Suínos.

Para investigar a extensão da adaptação do vírus suíno H2N3, investigamos sua patogenicidade neste hospedeiro inoculando 20 porcos de 4 semanas com 2 × 106 50% de dose infecciosa em cultura de tecidos (TCID50) do vírus Sw/4296424. Apenas um vírus H2N3 foi escolhido, devido à alta identidade entre os dois isolados. Doze porcos-controle foram inoculados com sobrenadante de cultura de células não-infecciosas. Avaliamos a transmissibilidade através da coabitação de 10 porcos de contato de idade com os porcos inoculados, a partir do dia 3 p.i. Todos os porcos utilizados para o estudo foram seronegativos no dia 0 para anticorpos contra os vírus H1N1, H1N2, H2N3 e H3N2 pelo ensaio de HI. Cinco porcos inoculados e três porcos controle foram eutanizados para necropsia nos dias 3, 5 e 7 p.i. Os 10 porcos de contato e 5 porcos inoculados com vírus foram testados sorologicamente pelo ensaio de HI com H2N3 no dia 24 após o contato ou no dia 27 p.i., respectivamente. Não foram observados sinais respiratórios agudos. A necropsia revelou lesões pulmonares macroscópicas graves (áreas de cor de ameixa, consolidadas) em suínos inoculados, mas não revelou nenhum em suínos controle (Tabela 2). O escore histopatológico (0-3) expressando a extensão dos danos à arquitetura pulmonar foi >2 em porcos inoculados (Tabela 2). Os pulmões de suínos inoculados eutanizados no dia 3, 5 ou 7 p.i. exibiram pneumonia intersticial leve a moderada e bronquiolite necrosante aguda a subaguda com ligeiro acúmulo linfocitário de bronquíolos e vasos (Fig. 2). O vírus foi titulado em fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) e isolado a partir de amostras de esfregaço nasal. Os títulos de vírus no pulmão variaram de 104,3 a 106,5 TCID50/ml nos dias 3 e 5 p.i. (Tabela SI 8) e foram negativos no dia 7 p.i. No grupo inoculado com H2N3, o vírus foi isolado de amostras de esfregaço nasal em 25% (5 de 20) dos suínos no dia 3, 67% (10 de 15) no dia 5 e 20% (2 de 10) no dia 7 p.i.; no grupo de contacto, 10% (1 de 10) das amostras foram positivas nos dias 5 e 7 após o contacto. Em contraste, 100% (10 de 10) dos suínos de contato foram soropositivos após 24 dias de contato com suínos inoculados (Tabela SI 9). Alguns porcos de controle tiveram um foco ocasionalmente pequeno de pneumonia intersticial leve (Tabela 2), mas foram negativos para a infecção pelo vírus da gripe suína. Todos os porcos foram negativos para PRRSV e M. hyopneumoniae por PCR. Nossos resultados indicam que o vírus H2N3 é patogênico em suínos e é transmissível entre suínos.

Patogenicidade do vírus da gripe suína H2N3 em ratos.

Para testar a capacidade do vírus H2N3 Sw/4296424 de se replicar em ratos, inoculámos intranasalmente ratos BALB/c de 6 a 7 semanas com 102-106 TCID50. Camundongos inoculados com 104 TCID50 ou mais mostraram sinais de doença (por exemplo, respiração em trabalho de parto, pêlo áspero, perda de peso e letargia) (Tabela SI 10). Setenta e cinco por cento dos ratos que receberam 106 TCID50 morreram, mas não houve mortes em doses mais baixas. O RNA viral foi detectado por RT-PCR (17) em tempo real nos pulmões de ratos após a inoculação com 106 ou 105 TCID50 (Tabela SI 10). Histopatologicamente, o vírus H2N3 induziu focos múltiplos ou coalescentes de pneumonia intersticial e alveolite proliferativa caracterizada por hipertrofia proeminente de pneumócitos e infiltração das paredes alveolares com uma população mista de macrófagos, linfócitos e neutrófilos (SI Fig. 3). Alguns lúmenes alveolares continham coágulos de fibrina e exsudados leucocíticos mistos leves. Em conjunto, esses achados indicam que o H2N3 é patogênico em ratos sem adaptação prévia.

Transmissibilidade do vírus da gripe suína H2N3 em furões.

Para causar uma pandemia, um vírus emergente da gripe A deve infectar humanos e ser transmitido eficientemente entre humanos. Para investigar o potencial de transmissão do vírus reortante H2N3 em sistemas de mamíferos, utilizamos o modelo de contato de furões (18). Três furões de 18 semanas, alojados em gaiolas separadas, foram inoculados com 102,5 TCID50 do vírus H2N3 Sw/2124514. Após 24 h, um animal de contato foi colocado em cada gaiola. Lavagens nasais foram feitas nos dias 1, 4 e 7 p.i., e o vírus foi titulado em ovos embrionados. O vírus foi detectado em todos os furões inoculados e de contacto, mas nenhum mostrou sinais clínicos óbvios (Tabela 3). Estes resultados indicam que o vírus da gripe H2N3 infectou furões e foi transmitido através de contato eficientemente.

Investigação serológica dos vírus da gripe suína H2N3 em fazendas de surtos.

Para investigar mais a propagação dos vírus H2N3, realizamos um levantamento sorológico limitado dos animais associados aos dois sistemas de produção afetados. No primeiro estudo, na Primavera de 2007, foram recolhidas amostras de soro de porcas de quatro explorações que forneceram leitões para as explorações de criação durante o surto de Setembro de 2006. Noventa por cento (54 de 60) foram seropositivos para a presença de anticorpos para Sw/4296424 (SI Tabela 11). Alguns dos animais testados estavam presentes na altura do caso índice, e não é claro se estavam infectados nessa altura ou se foram infectados posteriormente. Os dados mostram, no entanto, que o vírus estava presente tanto em porcas como em viveiros e que o vírus se transmitia eficientemente entre os animais. Todas as porcas nesta operação tinham títulos de anticorpos >1:40 para H1N1 e H3N2 vírus da gripe suína, porque tinham sido previamente vacinadas com uma vacina bivalente H1N1 e H3N2 contra a gripe suína.

Amostras de soro também foram coletadas na primavera de 2007 de 30 porcas e 90 porcos desmamados associados ao surto de abril de 2006, e foram testadas para a presença de anticorpos para Sw/2124514 usando o ensaio de HI. Das 30 porcas e 90 leitões desmamados amostrados, 1 das 30 e 26 das 90 foram seropositivas (Tabela SI 11), respectivamente.