Crescimento e produção de etanol de S. cerevisiae NCYC 2826 em hidrolisado de palha de trigo

Figure 1A mostra o crescimento de S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 cultivado a 30°C durante 36 h em cultura contendo um hidrolisado com concentração de glicose de 123 mM preparado como descrito na seção ‘Métodos’. A cepa de S. cerevisiae foi escolhida devido à sua alta tolerância ao etanol e robustez nas fermentações industriais. A Figura 1A mostra que quando S. cerevisiae NCYC 2826 foi cultivado apenas no hidrolisado de palha de trigo, houve um crescimento lento μ de 0,036 h-1 e uma densidade óptica final (DO) de 0,8. A adição de base de nutrientes de levedura (YNB) ao meio causou um aumento em μ de 0,135 h-1 e uma DO final de 1,5, enquanto que a adição de 2,3 mg ml-1 de uréia ao hidrolisado de palha de trigo deu um μ de 0,99 h-1 e uma DO final de 1,3. Estudos anteriores mostraram que os suplementos de ureia podem aumentar a produção de etanol na fermentação de leveduras e que a própria ureia é um componente essencial nos meios de crescimento mínimo de leveduras. Nossos resultados apoiam estas descobertas anteriores, confirmando a exigência da uréia para um crescimento próximo do ideal da levedura. Após 36 h, a concentração de etanol nas culturas foi medida e o rendimento de etanol obtido a partir de 123 mM de glucose foi de aproximadamente 90% do rendimento teórico total para todas as culturas. Enquanto o etanol foi produzido para um rendimento comparável sob estas três condições de cultura, o crescimento foi mais lento e a densidade óptica final foi menor no hidrolisado de palha de trigo do que quando se adicionou uréia ou YNB à cultura. Isto sugere que embora a glicose estivesse disponível para fermentação, o hidrolisado não continha elementos nutricionais suficientes para permitir que a cultura se dividisse na sua taxa máxima e atingisse uma densidade ótima.

Para investigar a causa da diminuição do crescimento celular no hidrolisado de palha de trigo, S. cerevisiae NCYC 2826 foi cultivado no hidrolisado feito usando 5%, 10%, 15% e 20% de concentração inicial de palha e suplementado com 2,3 mg ml-1 de uréia. A Figura 1B mostra que à medida que a concentração inicial de palha aumentou, a fase de retardamento do crescimento também aumentou para 20 h com uma concentração inicial de palha de 20%. A DO final também aumentou à medida que a concentração de palha aumentou, devido ao aumento das concentrações de glicose liberada. A fase de defasagem aumentada é característica da inibição do crescimento por compostos furanos frequentemente presentes nos hidrolisados de palha. A análise do conteúdo de furano do hidrolisado mostrou que o conteúdo de HMF era insignificante (dados não mostrados), mas a concentração de furfural presente aumentou com a concentração inicial de palha atingindo 0,5 mg ml-1 a 20% de conteúdo inicial de palha (Figura 2). Estes dados sugerem que o crescimento de S. cerevisiae NCYC 2826 no hidrolisado de palha de trigo é limitado pela concentração de furfural presente no hidrolisado.

Concentração de glicose (quadrados) e furfural (triângulos) presente nos hidrolisados de palha de trigo feitos como descrito na seção ‘ Métodos ‘ com uma concentração crescente de palha inicial.

Análise do crescimento do conjunto de cepas SGRP no furfural

A fim de identificar cepas de leveduras que podem ser resistentes ao furfural contaminante, o conjunto de cepas SGRP descrito nos métodos foi cultivado em YNB, 100 mM de glicose e a presença de 1,5 mg ml-1 de furfural. A Tabela 1 mostra a análise da tolerância do conjunto de cepas SGRP a 1,5 mg ml-1 furfural usando o sistema de pontuação descrito na seção “Métodos”. Um sistema de pontuação foi necessário no lugar de tempos médios de defasagem, uma vez que as cepas que não cresceram não tiveram uma fase de defasagem mensurável, mas ainda precisavam ser incluídas no conjunto de dados.

Tivemos observado anteriormente que o aumento do inóculo em culturas contendo furfural levou a uma diminuição na fase de defasagem, presumivelmente maximizando a quantidade de células de levedura viáveis introduzidas no meio, levando a um estabelecimento mais rápido da fase exponencial de crescimento (dados não mostrados). Portanto, para estas experiências, foi utilizado um volume inócuo de 5% de cultura nocturna. Os dados da Tabela 1 mostram que o crescimento em placas réplicas foi extremamente variável e também dependente da cepa, demonstrando que uma concentração de 1,5 mg ml-1 furfural é suficiente para distinguir a tolerância furfural em cepas de S. cerevisiae e S. paradoxus. Quando o crescimento das cepas foi testado em YNB contendo 100 mM de glicose e 2,0 ou 3,0 mg ml-1 furfural, houve muito pouco crescimento observado sob qualquer uma destas condições a partir de qualquer uma das cepas analisadas. Assim, foi decidido selecionar as cepas usando os dados de 1,5 mg ml-1 e submetê-las a uma tela furfural mais detalhada. A análise dos dados apresentados na Tabela 1 mostra que as cepas globais de S. cerevisiae cresceram melhor que as cepas de S. paradoxus em 1,5 mg ml – 1 furfural. Quase 20% das cepas de S. paradoxus testadas não receberam a pontuação máxima no sistema de pontuação, enquanto que para S. cerevisiae isso foi inferior a 10%, e também se refletiu na pontuação média geral mais alta para S. cerevisiae de 2,5 ± 1,4 em comparação com 2,1 ± 1,4 para S. paradoxus. Dentro de cada grupo de cepa, entretanto, houve variação significativa, com pontuação variando de 1,7 a 3,7 para S. cerevisiae e de 0,3 a 3,0 para S. paradoxus. As cepas que tiveram pontuação acima de 2,9 com um desvio padrão inferior a 1,5 foram consideradas como apresentando tolerância significativa ao furfural. Consequentemente, as cepas S. cerevisiae NCYC 3284 (ex solo, EUA), NCYC 3290 (ex vinho de bili, África Ocidental), NCYC 3312 (ex solo, Holanda) e NCYC 3451 (ex mosto, Irlanda), juntamente com S. paradoxus NCYC 3277 (ex casca de carvalho, Reino Unido) foram examinadas mais aprofundadamente numa tela furfural mais detalhada.

Efeitos do aumento das concentrações de furfural no crescimento e produção de etanol

Figure 3 mostra crescimento na presença de quantidades variáveis de furfural (0,1 a 4,0 mg ml-1) para as cepas S. cerevisiae NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 e NCYC 3451 e S. paradoxus cepa NCYC 3277 identificada na Tabela 1 do conjunto de cepas SGRP como tendo aumentado a resistência ao furfural. Arquivo adicional 1: A Figura S1 mostra os dados de crescimento correspondentes traçados em uma escala de log. A cepa de controle S. cerevisiae NCYC 2826 também foi incluída para fins comparativos. Para todas as seis cepas, como a concentração de furfural aumentou, as curvas de crescimento começam a mostrar aumentos na fase de defasagem, como visto anteriormente nos crescimentos contendo furfural. Todas as cepas testadas foram capazes de crescer com YNB suplementado com 100 mM de glicose e 0,1 a 1,5 mg ml-1 de furfural. S. cerevisiae NCYC 2826, nossa estirpe de controle, só foi capaz de crescer em até 1,5 mg ml-1, o que levou a uma redução de 30% na DO final quando comparado com o crescimento em 0,1 mg ml-1 furfural. A tabela 2 mostra que a produção de etanol por NCYC 2826 sob estas condições foi consideravelmente reduzida em comparação com o rendimento de aproximadamente 90% observado quando cultivado apenas com YNB e glicose ou com hidrolisado de palha de trigo. S. cerevisiae NCYC 2826 foi isolada do mosto de uva e por isso é improvável que tenha evoluído a capacidade de crescimento e fermentação durante a exposição ao furfural.

No seu estudo de genômica populacional, Liti et al. identificaram cinco linhagens bem definidas e geograficamente isoladas de S. cerevisiae (malaia, norte-americana, Saké, africana ocidental e “vinho/europeia”), bem como muitas linhagens recombinantes (mosaico) diferentes destas linhagens. A partir dos resultados do presente estudo, é evidente que a resistência furfural não é uma característica fenotípica específica de nenhuma linhagem particular de S. cerevisiae. Das quatro linhagens de SGRP S. cerevisiae resistentes ao furfural identificadas, NCYC 3284 (YPS128) pertence à linhagem norte-americana, NCYC 3290 (DBVPG 6044) à linhagem da África Ocidental, NCYC 3312 (DBVPG 1373) à linhagem ‘Wine/European’, enquanto NCYC 3451 (um derivado de um único esporo de NCYC 361) é uma linhagem recombinante.

S. cerevisiae NCYC 3451 mostrou a maior resistência ao furfural (Figura 3F, arquivo adicional 1: Figura S1F) e foi capaz de crescer na presença de até 3,0 mg ml-1 de furfural. Além disso, a produção de etanol nesta linhagem não pareceu inibida pelo furfural, com o maior rendimento de etanol (95 ± 15%; Tabela 2) alcançado a uma concentração (furfural) de 3,0 mg ml-1. Como já mencionado, NCYC 3451 é uma cepa recombinante e demonstrou ter um genoma semelhante ao mosaico derivado de pelo menos três linhagens diferentes, a saber: Saké, África Ocidental e “Wine/European” (Liti et al. ). Embora registada como isolada do mosto como uma levedura de cerveja estragada, a estrutura genómica altamente complexa desta estirpe sugere fortemente, embora não comprovada, que é de origem industrial (por exemplo, uma estirpe de panificação ou de fermentação). Entre as quatro cepas restantes de SGRP testadas, as cepas de S. cerevisiae NCYC 3290 e NCYC 3312 foram ambas capazes de crescer em 2,5 mg ml-1 furfural (Figura 3D,C, Arquivo adicional 1: Figura S1D e S1C, respectivamente), enquanto que a S. cerevisiae NCYC 3284 (Figura 3E, Arquivo adicional 1: Figura S1E) e a S. paradoxus NCYC 3277 (Figura 3B, Arquivo adicional 1: Figura S1B) só puderam crescer em 2,0 mg ml-1 furfural. Em geral, a produção de etanol nas cinco cepas do SGRP não foi significativamente afetada pela presença do furfural. De fato, para NCYC 3312, a presença de 0,5 mg ml-1 furfural levou a um notável aumento na produção de etanol, de 41 ± 8% da produção esperada para 75 ± 5% (Tabela 2). Isto também foi observado para a cepa de deterioração da cerveja NCYC 3451, mas em menor grau (apenas 14% de aumento no rendimento; Tabela 2). De fato, foi recentemente demonstrado que pequenas quantidades de álcool furfurílico, um produto de desidratação furfural em leveduras, pode na verdade levar a um aumento na produção de etanol .