Hipersecreção mucosa e doença respiratória crônica

Hipersecreção de muco nas vias aéreas é um importante contribuinte para a morbidade e mortalidade em muitos pacientes com doenças pulmonares crônicas graves, tais como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), asma e fibrose cística.35 O excesso de muco nas vias aéreas pode limitar o fluxo de ar; e sua presença é um fator de risco particular para os pacientes com DPOC que são propensos a infecções torácicas. A DPOC é uma doença inflamatória crônica grave do trato respiratório que compreende três condições, a saber: bronquite crônica (hipersecreção prolongada das vias aéreas), doença das vias aéreas pequenas e enfisema.36 Está aumentando mundialmente em prevalência e carga econômica.37,38 Na DPOC, pacientes com hipersecreção crônica de muco têm um risco significativamente maior de hospitalização e morte em comparação com pacientes sem um componente bronquítico marcado.39,40 Os tratamentos atuais para DPOC são paliativos e não interrompem a progressão da doença,41 e não há tratamento específico para a hipersecreção de muco.42 Na ausência de uma terapia eficaz para qualquer aspecto da fisiopatologia da DPOC, o desenvolvimento de tratamentos para a hipersecreção de muco é garantido. A capacidade de limpar o muco dos pulmões, através do movimento de cílios das vias aéreas, depende da sua viscocidade e elasticidade. Estas propriedades são determinadas pela proporção de glicoproteínas da mucina, pelo peso, que o muco contém.43 MUC5AC e MUC5B são as principais mucinas nas secreções normais e patológicas das vias aéreas humanas.44 Em pacientes com DPOC, os níveis das mucinas MUC5AC e MUC5B estão aumentados no muco respiratório, embora proporcionalmente mais MUC5B seja secretada.45 As mucinas são secretadas para as vias aéreas pelas células da taça no epitélio e glândulas seromucosas na submucosa.43 Uma possibilidade de inibição da secreção mucosa é utilizar a atividade inibitória das endopeptidases neurotóxicas clostridiais na fusão vesicular, direcionada para as células secretoras de mucina das vias aéreas, utilizando um ligante-alvo apropriado.

Para investigar se uma endopeptidase clostridial devidamente orientada fenderia as proteínas SNARE nas células epiteliais respiratórias humanas, inibindo assim a secreção mucosa, foi gerada uma proteína de fusão a partir de um gene recombinante que codifica o domínio LHN da BoNT/C e EGF, designado EGF-LHN/C, para visar receptores EGF nas células secretoras de mucina.34 O EGF foi selecionado como o protótipo ligante para a criação dessa proteína de fusão porque os receptores de EGF estão presentes nas células epiteliais respiratórias humanas46,47 e são upregulados no epitélio das vias aéreas de pacientes com asma e DPOC48 , assim como de fumantes.49 A proteína de fusão recombinante EGF-LHN/C clivou a relevante sintaxina da proteína SNARE em uma linha celular metastática mucoepidermóide humana, células H292, in vitro, de forma concentrada.34 O pré-tratamento de células H292 com EGF-LHN/C inibe a liberação estimulada de mucina em resposta a um estímulo combinado de EGF e fator de necrose tumoral-α (TNFα) de forma concentrada, com IC50 de aproximadamente 0,4 nM (Fig. 28-1). Isso se compara muito bem com o efeito inibitório previamente relatado do EGF-LHN/C sobre a liberação de mucina estimulada de outra linha de células epiteliais respiratórias, a linha de células alveolares tipo II humana A549, em resposta ao mesmo estímulo.34 Em ambos os tipos celulares, não houve efeito detectável do EGF-LHN/C sobre o nível basal de secreção de mucina. A inibição da secreção de mucina pelo EGF-LHN/C deve-se ao direcionamento de sua atividade endopeptidase através do receptor de EGF, e não é resultado de citotoxicidade celular ou antagonismo ou desregulação do receptor.34 O EGF-LHN/C também é capaz de inibir a liberação de mucina estimulada das células A549 em resposta a um coquetel estimulante de citocinas, uma combinação de 1 ng/mL de interferon (IFN)-γ, TNFα, e interleucina (IL)-1β, chamada cytomix (Fig. 28-2). Assim, o efeito do EGF-LHN/C sobre a liberação estimulada de mucina das células epiteliais respiratórias é independente da natureza precisa do estímulo utilizado. O exame histológico mostra que a mucina é retida dentro das células tratadas (Fig. 28-3). As células controle contêm mucina intracelular corada, enquanto as células estimuladas mostram uma coloração acentuadamente reduzida, indicando secreção de mucina. As células estimuladas pré-tratadas com EGF-LHN/C apresentam coloração intracelular retida, indicando inibição de secreção por EGF-LHN/C. Para avaliar a resposta das células a essa retenção de mucina intracelular, foi medido o efeito do pré-tratamento do EGF-LHN/C sobre os níveis de mRNA MUC5AC como indicador da síntese de mucina. O pré-tratamento do EGF-LHN/C está associado à inibição, dependente da concentração, da expressão do MUC5AC mRNA induzido por EGF-TNFα, com valor de IC50 de ∼0.1 nM (Fig. 28-4). Assim como a inibição da liberação de mucina estimulada das células, esse efeito do EGF-LHN/C se deve à liberação direcionada de sua atividade endopeptidase através do receptor EGF, pois nem um LHN/C sem ligante de EGF para direcioná-lo ao receptor EGF nem uma forma mutante da proteína de fusão na qual o domínio endopeptidase foi inativado por três alterações residuais na região catalítica (EGF-TE-LHN/C) inibem a expressão do mRNA da MUC5AC. Esse efeito do EGF-LHN/C sobre a expressão do mRNA MUC5AC sugere a existência de um possível mecanismo de feedback negativo entre a liberação de mucina e a síntese de mucina nas células epiteliais respiratórias, e também que a expressão gênica se desregula em resposta à inibição da secreção por uma endopeptidase clostridial recombinante.

Proteínas de fusão clostridial recombinante da endopeptidase que podem inibir a secreção de muco, como exemplificado pelo EGF-LHN/C, têm potencial de desenvolvimento como proteínas terapêuticas para o tratamento de DPOC, bronquite crônica, fibrose cística e outras condições respiratórias crônicas envolvendo excesso de produção de muco nas vias aéreas. A longevidade da atividade da proteína significaria que o produto só precisaria ser inalado com pouca freqüência, tornando-o bem adequado ao tratamento de doenças respiratórias crônicas deste tipo.