- Introduction
- Materiais e Métodos
- Indução da ICH
- Western Blotting
- Immunohistochemistry
- Enzyme Linked Immunosorbent Assay
- Genetic Knockdown of Galectin-3
- Análise Estatística
- Resultados
- Padrão de Expressão Temporal de Galectina-1 e Galectina-3 após ICH
- Localização celular de Galectina-1 e Galectina-3 Após ICH
- Galectina-1 e Galectina-3 Regulação mediada da resposta inflamatória
- Discussão
- Conclusão
- Declaração Ética
- Contribuições dos autores
- Funding
- Conflict of Interest Statement
- Material Suplementar
- A abreviaturas
Introduction
A hemorragia intracerebral é um subtipo de acidente vascular cerebral fatal (Qureshi et al, 2001a) que é responsável por uma taxa de mortalidade hospitalar e uma taxa de incapacidade de 40 e 80%, respectivamente (van Asch et al., 2010). A ICH é responsável por 10-15% de todos os AVC, e a incidência mundial de ICH é de 2 milhões de casos por ano (van Asch et al., 2010) com aproximadamente 120.000 casos por ano nos Estados Unidos (Ribo e Grotta, 2006; Broderick et al., 2007; Aguilar e Freeman, 2010). No entanto, espera-se que a incidência tenha duplicado até 2050 (Qureshi et al., 2001b) devido ao envelhecimento e ao uso de anticoagulantes em larga escala (Wang, 2010). Notavelmente, não há tratamento eficaz para a HIC e a fisiopatologia da doença é mal definida.
Neuroinflamação caracterizada pela ativação de microglia, as células neuroimunes do SNC, é um contribuinte chave para a lesão cerebral secundária induzida pela HIC e perda da função neurológica (Wang e Dore, 2007; Carmichael et al., 2008; Wang, 2010). A introdução de componentes sanguíneos, incluindo trombina, Hb e metabolitos Hb como o hemin no cérebro cria a base para respostas neuroinflamatórias após a ICH (Wang e Dore, 2007; Carmichael et al., 2008; Robinson et al., 2009; Wang, 2010; Cai et al., 2011; Dang et al., 2011; Babu et al., 2012; Lin et al., 2012; Weng et al., 2015; Min et al., 2017). Notavelmente, a ativação pró-inflamatória da microglia após a HIC correlaciona-se com lesão da barreira hematoencefálica, inchaço/edema cerebral, expansão do hematoma, deterioração neurológica e má recuperação funcional (Platt et al., 1998; Hickenbottom et al., 1999; Leira et al., 2004; Zhao et al., 2007). Além disso, a resposta inflamatória após a HIC também regula o recrutamento cerebral de monócitos/macrófagos derivados do sangue que são conhecidos por regularem o dano cerebral induzido pela HIC e, portanto, a recuperação funcional (Tessier et al., 1997; Shiratori et al., 2010; Starossom et al., 2012).
Galectinas são uma família de proteínas de ligação aos carboidratos conservados evolutivamente (Barondes et al., 1994a,b; Kasai e Hirabayashi, 1996) envolvidos na ativação, diferenciação, proliferação, migração e apoptose celular (Perillo et al., 1995; Yang et al., 1996; Perillo et al., 1998; Moiseeva et al., 1999; Vespa et al., 1999; Yamaoka et al., 2000; Goldring et al., 2002). Entre os vários membros da família Galectin, as evidências emergentes implicam papéis-chave da Galectina-1 e Galectina-3 nas respostas neuroimunes em várias condições neuropatológicas (Jeon et al., 2010; Starossom et al., 2012; Parikh et al., 2015). Contudo, existe uma lacuna crítica de conhecimento na compreensão da sua expressão e função celular após a ICH. O objetivo do manuscrito atual é elucidar a modulação induzida por hemorragia e a expressão celular da expressão da Galectina-1 e Galectina-3 no cérebro em um modelo pré-clínico da ICH.
Materiais e Métodos
Indução da ICH
Explosão de hemorragia intracerebral foi induzida em camundongo CD-1 macho adulto (8-12 semanas; n = 43), como relatado anteriormente (Sukumari-Ramesh et al., 2012a,b, 2016; Bonsack et al., 2016; Sukumari-Ramesh e Alleyne, 2016; Ahmad et al., 2017; Chen-Roetling et al., 2017). Em resumo, o rato foi anestesiado (cetamina e xilazina) e foi feita uma pequena incisão para expor o crânio. Usando uma broca de alta velocidade, foi feito um furo de rebarbas (0,5 mm) no crânio aproximadamente 2,2 mm lateral a bregma. Em seguida, o mouse foi colocado sobre uma estrutura de cabeça estereotáxica e uma seringa Hamilton 26-G foi usada para injetar 0,04U de colagenase tipo IV bacteriana (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos) em 0,5 μL Buffer Salino Fosfato (pH 7,4; PBS) no striatum esquerdo (3,0 mm) sob orientação estereotáxica. Após a remoção da agulha, foi utilizada cera óssea para selar o orifício da rebarba. Os ratos foram mantidos a 37 ± 0,5°C usando um pequeno controlador de temperatura animal durante todo o procedimento. O padrão temporal do hematoma após ICH é fornecido (Figura Suplementar S1).
Western Blotting
Ratos foram anestesiados e transardialmente perfurados com PBS. O tecido cerebral Ipsilateral (tanto hematológico quanto peri-hematológico) foi coletado em tampão RIPA contendo inibidores de protease e fosfatase e submetido à sonicação. As amostras foram então centrifugadas a 14.000 rpm durante 5 min a 4°C para coletar o sobrenadante. Usando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, Estados Unidos) as concentrações de proteína foram estimadas, e 30-50 microgramas de amostras foram executados em um gel de 4-20% de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida e transferidos para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Os bloqueios foram incubados com o respectivo anticorpo primário, de um dia para o outro a 4°C. Seguiu-se uma incubação de 2-h com o respectivo anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor. Os blots foram lidos usando um sistema de imagem quase infravermelha Li-Cor Odyssey e a quantificação foi feita usando o software Quantity One (Bio-Rad, Foster City, CA, Estados Unidos).
Immunohistochemistry
Ratos foram anestesiados e transardialmente perfurados com PBS. Os cérebros foram coletados e colocados em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4°C, e depois congelados. Os cérebros foram então cortados em cortes coronais de 25 mm usando um criostato e montados em lâminas de vidro. As secções foram incubadas durante 2 h em 10% de soro normal de burro à temperatura ambiente. Isto foi seguido por uma incubação nocturna com o respectivo anticorpo primário a 4°C. Após a lavagem, os cortes foram incubados com o correspondente anticorpo secundário com o respectivo agente antiespumante Alexa à temperatura ambiente, durante 1 h. A imunofluorescência foi determinada usando um microscópio laser Zeiss LSM510 Meta confocal e a co-localização celular foi determinada, como descrito anteriormente (Laird et al., 2010). Foram analisadas três secções não consecutivas por animal e um mínimo de 3 campos aleatórios ao redor do hematoma.
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
RAW 264,7, uma linha de células de macrófagos murinos, foram cromadas numa placa de 24 poços e permitidas a incubação durante 48 h em DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) contendo 5% Soro Bovino Fetal, 5% Soro de Crescimento Bovino e 1% Penicilina/Streptomicina. As células foram então incubadas com Galectina-1 recombinante de rato (6,25 ou 12,5 μg/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos) durante 1 h e foi seguido por um tratamento de 18 h com LPS (100 ng/ml) ou hemin (30 μg/ml). O sobrenadante foi coletado e utilizado para a detecção de IL-6, por ELISA, conforme instruções do fabricante (Biolegend, San Diego, CA, Estados Unidos). Resumidamente, uma placa de 96 poços foi revestida durante a noite a 4°C com um anticorpo de captura específico. Após um bloqueio de 1 h, o sobrenadante de cultura celular foi adicionado aos poços e incubado durante 2 h à temperatura ambiente. Quaisquer materiais não ligados foram removidos por lavagem e uma solução de anticorpos de detecção foi adicionada aos poços e deixada incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem adicional, 100 μl de solução de Avidin- Horse Radish Peroxidase (HRP) foi adicionada a cada poço durante 30 min à temperatura ambiente. A solução de substrato foi adicionada aos poços após lavagem para o desenvolvimento da cor. Foi utilizada uma solução de paragem, e a placa foi lida a 450 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação (Bio-Tek, Epoch).
Genetic Knockdown of Galectin-3
RAW 264.7 células foram transfectadas com siRNA de controle (ON-TARGET mais Pool não-alvo; GE Dharmacon) ou Galectin-3 siRNA (ON-TARGET mais Mouse Lgals3 siRNA; GE Dharmacon) usando o Reagente de Transferência HiPerFect (QIAGEN) de acordo com as instruções do fabricante. O knockdown de Galectin-3 foi verificado 48h após a transfecção por western blotting como descrito anteriormente.
Análise Estatística
Os dados foram analisados usando teste t ou análise de variância unidirecional seguida pelo teste post-hoc Student-Newman-Keuls e foram expressos como média ± Erro Padrão (SE). Um p-valor de < 0,05 foi considerado significativo.
Resultados
Padrão de Expressão Temporal de Galectina-1 e Galectina-3 após ICH
Para avaliar se a lesão hemorrágica resulta em modulação da expressão de Galectina-1 e Galectina-3 no cérebro, a ICH ou Sham foi induzida em camundongos usando o método de injeção de colagenase. Dado o papel emergente da Galectina-1 e da Galectina-3 nas respostas neuroimunes, as seções ipsilaterais do cérebro de camundongos xamânicos ou ICH foram submetidas a avaliação empregando tanto a análise de western blotting quanto a imuno-histoquímica em vários pontos de tempo, desde o primeiro dia até o sétimo dia após a cirurgia, um período de tempo pós-injúria, que exibiu notável indução tanto de ativação pró- como anti-inflamatória de microglia/macrófagos, bem como astrocitos após a ICH (Sukumari-Ramesh et al, 2012b, 2016; Bonsack et al., 2016).
Notadamente, cortes cerebrais de áreas cerebrais falsas ou contralaterais da ICH exibiram expressão muito marginal ou indetectável de Galectina-1 e Galectina-3, enquanto a expressão aumentada de Galectina-1 e Galectina-3 foi observada no terceiro dia, quinto dia e sétimo dia após a ICH (Figuras 1, 2). Nesta linha, o número de células imunopositivas de Galectina-1 aumentou significativamente em aproximadamente 4, 6 e 4 vezes nos dias 3, 5 e 7 pós -ICH, respectivamente, em comparação com a farsa (Figura 1B). Esta observação foi posteriormente validada através da análise de western blotting, que revelou uma notável e significativa indução de Galectina-1 a partir do terceiro dia ICH pós -ICH, em comparação com a farsa (Figuras 1C,D). Além disso, a indução de Galectina-3 (Figura 2) espelhou a expressão de Galectina-1 após a ICH e as células imunopositivas de Galectina-3 foram aproximadamente 15, 28 e 24 vezes maiores no dia 3, dia 5 e dia 7 após a ICH (Figura 2B) em comparação com a farsa e o western blotting seguido pela análise densitométrica confirmou o aumento da expressão de Galectina-3 após a ICH (Figuras 2C,D).
Figura 1. Aumento da expressão da Galectina-1 após a ICH. (A) Imagens confocais representando o padrão de expressão temporal da Galectina-1 após a ICH (barra de escala = 20 μm; n = 3-5 por grupo). (B) Número médio de células positivas de Galectina-1 por 0,1 mm2 no striatum ipsilateral. (C) O aumento da expressão de Galectina-1 foi confirmado pela mancha ocidental de tecido cerebral do estriato ipsilateral. (D) Análise densitométrica (n = 3-5 por grupo) dos dados do western blotting. ∗p < 0,05, ∗∗∗p < 0,001 vs. sham.
Figure 2. Expressão aumentada de Galectin-3 após ICH. (A) Padrão de expressão temporal da Galectina-3 na área perihematomal após a ICH. As imagens confocais representativas mostram um notável aumento na expressão da Galectina-3 após a ICH em comparação à Sham (barra de escala = 20 μm; n = 3-5 por grupo). (B) O número médio de células positivas de Galectina-3 por 0,1 mm2 no striatum ipsilateral. (C) A expressão temporal da Galectina-3 foi ainda mais confirmada usando o western blotting. (D) Análise densitométrica (n = 3-5 por grupo) dos dados de western blotting. ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 vs. sham.
Localização celular de Galectina-1 e Galectina-3 Após ICH
Para determinar a localização celular de Galectina-1 e Galectina-3 após ICH, os cortes cerebrais foram submetidos a imunossintéticos de duplo rótulo. A expressão da Galectina-1 foi observada principalmente nos astrocitos GFAP-positivos (Figura 3A) e a contagem de células estereotáxicas revelou que 85% das células positivas de Galectina-1 co-expressas de GFAP após a ICH. Além disso, a expressão da Galectina-1 também foi observada na Iba1- microglia/macrófagos positivos após ICH (Figura 3B), mas apenas 12% das células positivas de Galectina-1 co-expressas de Iba1.
Figure 3. A expressão da Galectina-1 é observada principalmente nas células gliais após a ICH. As seções cerebrais foram duplamente imunizadas para (A) Galectin-1 e GFAP, (B) Galectin-1 e Iba1, (o painel mais baixo representa as imagens de alta ampliação) e (C) Galectin-1 e NeuN (barra de escala = 20 μm; n = 3 por grupo). A expressão da Galectina-1 foi observada principalmente em células positivas GFAP e em um subconjunto de células positivas Iba1. As células NeuN positivas não expressaram Galectina-1 (n = 3 por grupo).
Em contraste, a expressão da Galectina-3 foi em sua maioria confinada às células Iba1-positivas (Figura 4A) e a expressão da Galectina-3 esteve ausente nas células GFAP-positivas (Figura 5A) indicando a expressão celular diferencial da Galectina-1 e da Galectina-3 após a ICH. Além disso, a expressão da Galectina-3 foi observada em células pró-inflamatórias, marcador microglial M1 ou macrofágico, células CD16/32-positivas (Figura 4B) implicando um novo papel da Galectina-3 nas respostas neuroinflamatórias após a ICH. Notadamente, 88 e 92% das células positivas de Galectina-3 coexpressavam células Iba1 e CD16/32-positivas, respectivamente. De notar que a Galectina-3 expressando microglia ou macrófagos exibiu fenótipo fagocitário (Figuras 4A,B) implicando o seu papel inexplorado na fagocitose mediada por microglia ou macrófagos após a ICH. Além disso, células NeuN-positivas não expressaram Galectina-1 ou Galectina-3 (Figuras 3C, 5B).
Figura 4. Expressão da Galectina-3 em microglia/macrófagos após ICH. Os cortes cerebrais foram imunizados para (A) Galectin-3 e Iba1, e (B) Galectin-3 e CD 16/32. Tanto Iba1 (um marcador de microglia/macrófagos) quanto CD16/32 (um marcador de microglia ou macrófagos proinflamatórios M1) – células positivas, co expressado Galectin-3 (n = 3 por grupo).
Figure 5. Localização celular da Galectina-3 após a ICH. Seções cerebrais foram duplamente imunizadas com (A) Galectin-3 e GFAP, e (B) Galectin-3 e NeuN. A expressão da Galectina-3 estava ausente nas células GFAP-positivas ou NeuN-positivas. Barra de escala = 20 μm; n = 3 por grupo.
Galectina-1 e Galectina-3 Regulação mediada da resposta inflamatória
Para estabelecer o possível papel funcional da Galectina-1 e Galectina-3 após a ICH, realizámos estudos in vitro. A Galectina-1 recombinante (6,25 e 12,5 μg/ml) atenuou significativamente a liberação induzida por LPS de uma citocina pró-inflamatória, a Interleucina -6 (IL-6) das células RAW 264,7, conforme estimado pelo ELISA em comparação aos controles (Figura 6), implicando um papel regulador negativo da Galectina-1 na inflamação.
Figura 6. Galectina-1 recombinante e resposta inflamatória. Antes da estimulação LPS (100 ng/ml), as células Raw 264,7 foram tratadas com Galectina-1 recombinante, e a liberação de IL-6 foi medida usando ELISA, como detalhado nos métodos. A Galectina-1 recombinante reduziu significativamente a liberação de IL-6 induzida por LPS a partir de 246,7 células RAW (n = 4 por grupo). ∗∗∗p < 0,001 vs. LPS.
Para testar o papel funcional da Galectina-3, realizamos a derrubada genética mediada por siRNA da Galectina-3 em RAW 264.7 células e examinou a resposta inflamatória. O silenciamento genético com siRNA reduziu significativamente a expressão de Galectina-3 em 264,7 células RAW em 52,95% como evidenciado pela mancha ocidental (Figuras 7A,B). Notavelmente, o knockdown genético de Galectin-3 com siRNA medicado não modulou a liberação de IL-6 induzida por LPS (Figura 7C) enquanto que o knockdown genético de Galectin-3 aumentou significativamente o hemin (um metabolito de hemoglobina que se acumula em alta concentração nos hematomas intracranianos) -induziu a liberação de IL-6 (Figura 7D) implicando um papel inexplorado de Galectin-3 na modulação da resposta inflamatória após ICH.
Figura 7. Galectina-3 e resposta inflamatória (A) 246,7 células RAW foram tratadas com siRNA controle ou siRNA de Galectina-3 como detalhado nos métodos e o knockdown genético de Galectina-3 foi verificado usando (A) western blotting seguido por (B) análise densitométrica. ∗∗∗p < 0,001 vs. siRNA de controle. (C) O knockdown de Galectin-3 não modulou a liberação induzida por LPS de IL-6 (D) enquanto que a liberação significativamente não-regulada de IL-6 a partir de células RAW 246,7 em comparação ao controle (n = 3 por grupo). ∗∗p < 0,01 vs. hemin.
Discussão
Galectinas são uma família de proteínas de ligação endógena de carboidratos que desempenham papéis críticos tanto em condições fisiológicas como patológicas, interagindo com receptores glicosilados na superfície celular e modulando as vias de sinalização intracelular (Perillo et al, 1995, 1998; Yang et al., 1996; Moiseeva et al., 1999; Vespa et al., 1999; Yamaoka et al., 2000; Goldring et al., 2002; Laaf et al., 2019). As galectinas apresentam uma semelhança significativa de sequência no seu domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD) com uma afinidade acrescida com β-galactosídeos e são originalmente definidas pela sua capacidade de reconhecer o dissacarídeo N-acetillactosamina (Barondes et al., 1994a,b; Kasai e Hirabayashi, 1996). Entretanto, estudos recentes demonstram diferenças substanciais em suas propriedades de ligação aos carboidratos (Hirabayashi et al., 2002; Leffler et al., 2002; Carlsson et al., 2007).
Galectina-1, o membro mais ubíquamente expresso da família da galectina (Stillman et al., 2006) tem sido implicado na regulação da imunidade inata e adaptativa e está presente tanto em locais intracelulares quanto extracelulares (Verschuere et al., 2014). As funções extracelulares da Galectina-1 dependem em grande parte das propriedades de ligação dos carboidratos, enquanto as funções intracelulares envolvem principalmente interações independentes dos carboidratos (Verschuere et al., 2014). Consistente com o papel da Galectina-1 na resposta imune na periferia, a Galectina-1 é conhecida por suprimir a ativação de macrófagos (Barrionuevo et al., 2007), promove a apoptose seletiva de células T (Toscano et al., 2007), induz a secreção de citocinas anti-inflamatórias, IL-10 (van der Leij et al., 2004; Cedeno-Laurent et al., 2012), e atenua a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos (Correa et al., 2003).
Galectina-1 é amplamente expressa nos tecidos nervosos em estágios embrionários, mas torna-se restrita principalmente aos tecidos periféricos após a maturação (Horie e Kadoya, 2002). Consistentemente, o striatum cerebral não lesionado exibe expressão marginal de Galectina-1. No entanto, após uma lesão cerebral hemorrágica foi observada uma expressão muito notável de Galectina-1 em astrocídeos GFAP-positivos. Nessa linha, a Galectina-1 está implicada na diferenciação dos astrócitos e posterior liberação de BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro) após uma lesão cerebral que implica em um papel da Galectina-1 na neuroproteção (Sasaki et al., 2004; Qu et al., 2010). Além disso, a Galectina-1 é um dos principais reguladores da neurogênese de adultos através de sua capacidade de ligação de carboidratos e promove a recuperação funcional após acidente vascular cerebral (Ishibashi et al., 2007). A administração de Galectina-1 reduziu a apoptose dos neurônios, diminuiu o volume de infarto cerebral e melhorou a função neurológica induzida pela isquemia cerebral (Qu et al., 2011). Além disso, neurônios nativos e recombinantes da galectina-1 protegeram os neurônios cerebelares de camundongos e ratos dos efeitos neurotóxicos do glutamato (Lekishvili et al., 2006). De notar que a galectina-1 desactiva a microglia inflamatória e protege da neurodegeneração induzida pela inflamação (Starossom et al., 2012). Além disso, nossos estudos demonstraram que a Galectina-1 recombinante atenua a liberação de uma citocina pró-inflamatória, IL-6 de macrófagos murinos estimulados por LPS, RAW 264,7 em comparação aos controles que implicam um papel regulador negativo da Galectina-1 na inflamação.
Galectina-1 é um dos ligantes endógenos da CD45 (Walzel et al., 1999), que regula a ativação de microglia/macrófagos. Além disso, a interação da Galectina-1 com a CD45 leva à retenção desta glicoproteína na membrana plasmática e ao aumento de sua atividade fosfática. Estudos recentes demonstraram que a CD45 regula negativamente a ativação proinflamatória da microglia M1, mas promove o fenótipo antiinflamatório M2 através da modulação da proteína cinase mitogênica ativada p38 (p38MAPK), ligação do elemento de resposta cAMP (CREB) e fator nuclear kappa-light-chain-enhancer das células B ativadas (NF-kB) sinalizando vias (Starossom et al., 2012). Este efeito envolveu a ligação de Galectina-1 ao núcleo 2 O-glycans em CD45 sugerindo que a expressão de moieties de glicanos em microglial/macrófagos ativados é necessária para a ligação e função da Galectina-1 (Starossom et al., 2012). Além disso, sugere-se que a Galectina-1 suprimiu a neuroinflamação induzida por metanfetaminas nas células endoteliais microvasculares do cérebro humano (Parikh et al., 2015) e a Galectina-1 esteja envolvida no crescimento neurite e na conectividade sináptica. No total, os dados sugerem que a indução de Galectina-1 em astrocitos reativos após a HIC pode ser um mecanismo de comunicação intercelular facilitando a regulação da neuroproteção mediada por astrocitos após a HIC, o que justifica investigação adicional.
Galectina-3 é uma proteína do tipo quimérico 25-35 kDa com funções fortemente dependentes da localização (Thomas e Pasquini, 2018). A expressão da Galectina-3 foi encontrada no núcleo, e citoplasma (Liu et al., 2002). Além disso, macrófagos e microglia ativada podem liberar Galectina-3 no espaço extracelular levando à remodelação da matriz extracelular e alteração da resposta inflamatória, respectivamente (Li et al., 2008; Jeon et al., 2010). Ao invés da clássica via endoplasmática de retículo/Golgi de secreção, a Galectina-3 segue uma via alternativa de secreção e exportação (Mehul e Hughes, 1997) e ao ser liberada, a Galectina-3 interage com vários receptores extracelulares. No entanto, a Galectina-3 está intimamente ligada à cascata inflamatória das reacções; o papel funcional preciso da Galectina-3 na neuroinflamação é muito controverso. No entanto, é relatado que a galectina-3 liberada pela microglia atuou como um ligante endógeno TLR-4 (Toll Like Receptor-4) (Burguillos et al., 2015). Além disso, a deleção genética da Galectina-3 reduziu a perda neuronal e a administração do anticorpo Galectina-3 exerceu efeitos neuroprotetores em um modelo pré-clínico de lesão cerebral traumática (Yip et al., 2017), implicando em conjunto um papel prejudicial da Galectina-3 após uma lesão cerebral. Em contraste, a deleção dirigida da Galectina-3 exacerbou o dano cerebral isquêmico e a neurodegeneração após a isquemia cerebral (Lalancette-Hebert et al., 2012) sugerindo um papel neuroprotetor da Gelectina-3 após o dano cerebral. Além disso, a Galectina-3 contribui para a angiogênese e neurogênese implicando seu possível papel no reparo cerebral pós-isquêmico (Yan et al., 2009). A Galectina-3 também promoveu a diferenciação oligodendroglia, contribuindo para a recuperação funcional após desmielinização (Pasquini et al., 2011). Estes papéis funcionais conflitantes da Galectina-3 após a neuropatologia podem ser devidos à expressão diferencial subcelular da Galectina-3 ou devido à diferença na fisiopatologia dos distúrbios cerebrais que justifique uma investigação mais aprofundada.
Consistente com outras condições neuropatológicas, observamos uma expressão elevada de Galectina-3 após a ICH e a expressão foi predominantemente observada nas células Iba1 positivas, as células inflamatórias do SNC. As células Iba1 positivas após a ICH podem ser microglia ou macrófagos infiltrantes, que desempenham papéis na resposta imune inata. Estudos recentes demonstram que as microglia e os macrófagos podem ter papéis diferenciais após a patologia cerebral (Gao et al., 2017). Nesta linha, estudos com cultura microglial primária documentam um papel pró-inflamatório da Galectina-3 (Burguillos et al., 2015), enquanto estudos com macrófagos demonstram um papel anti-inflamatório (MacKinnon et al., 2008), o que justifica uma investigação mais aprofundada. Além disso, a derrubada genética de Galectina-3 em células RAW 246,7 aumentou a liberação induzida por hemenina de IL-6, uma citocina pró-inflamatória que implica um papel da Galectina-3 nas respostas inflamatórias após a ICH. Além disso, a Galectina-3 expressando microglia ou macrófagos exibiu fenótipo fagocitário implicando seu papel inexplorado na fagocitose microglial ou mediada por macrófagos, que desempenha um papel fundamental na resolução do hematoma e subsequente recuperação cerebral após a HIC. Consistentemente, relatórios recentes sugerem que macrófagos que se acumulam no SNC durante a infecção parasitária expressam abundantemente Galectina-3 (Quenum Zangbede et al., 2018) e células microglia fagocitosas ativadas via Galectina-3 (Nomura et al., 2017). Além disso, níveis elevados de Galectina-3 plasmático foram fortemente associados à inflamação, gravidade e maus resultados em pacientes com ICH aguda (Yan et al., 2016). Portanto, mais estudos são necessários elucidando os papéis funcionais da Galectina-3 após a ICH.
Conclusão
Galectina-1 e Galectina-3 exibiram uma expressão muito profunda e aumentada do 3º ao 7º dia após a ICH, na região cerebral perihematômica, em comparação com Sham. Além disso, a expressão da Galectina-1 foi observada principalmente nos astrocíticos GFAP positivos, enquanto a expressão da Galectina-3 foi observada principalmente nas células Iba1 e CD16/32 positivas, as células inflamatórias do SNC. Além disso, estudos genéticos revelaram um papel regulador negativo tanto da Galectina-1 quanto da Galectina-3 na liberação de uma citocina pró-inflamatória, a IL-6, dependendo do estímulo. No total, os dados sugerem que a Galectina-1 e a Galectina-3 poderiam ser direcionadas na modulação das respostas gliais e, portanto, do dano cerebral após a ICH, o que justifica uma investigação mais profunda.
Declaração Ética
Estudos anímicos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Uso Animal para Pesquisa e Educação da Universidade Augusta, em conformidade com as diretrizes do NIH e USDA.
Contribuições dos autores
FB realizou os estudos imunohistoquímicos, de cultura de células e western blotting e participou da análise dos dados. SS-R concebeu e desenhou os experimentos, conduziu as cirurgias em animais, estudos genéticos e análise de dados, e redigiu o manuscrito. Ambos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Funding
Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (R01NS107853) e da Associação Americana do Coração (14SDG18730034) à SS-R.
Conflict of Interest Statement
Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Material Suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2019.00157/full#supplementary-material
FIGURA S1 | O padrão temporal do hematoma após a HIC.
A abreviaturas
CD16/32, Cluster of Differentiation 16/32; CD45: Cluster of Differentiation 45; CNS, sistema nervoso central; ELISA, ensaio imunossorbente enzimático; GFAP, proteína glial fibrilária ácida; Hb, hemoglobina; Iba1, molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada 1; ICH, hemorragia intracerebral; LPS, lipopolissacarídeo; NeuN, núcleos neuronais; PBS, tampão fosfato salino; RIPA, radioimunoprecipitação.
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