Cromatografia líquida rápida de proteínas (FPLC) e cromatografia líquida de alta performance (HPLC): dois métodos cromatográficos líquidos em comparação direta. Este artigo discute as diferenças entre as duas técnicas com ênfase particular nos requisitos dos respectivos analitos.
Os nomes de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) e cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) oferecem uma dica para as diferenças entre esses métodos cromatográficos. Enquanto a HPLC trabalha com alta pressão para analisar compostos químicos pequenos, a FPLC purifica biomoléculas grandes como proteínas ou DNA. A cromatografia de biomoléculas é muito exigente e sensível porque elas não suportam altas temperaturas, altas pressões ou os solventes normalmente utilizados em HPLC. Por estas razões, a separação de biomoléculas requer uma abordagem alternativa à HPLC.
Termos universais são comumente usados para cromatografia líquida de proteína rápida, como biochromatografia, biosseparação, ou biopurificação. Esta forma especial de cromatografia é aplicada para purificar biomoléculas grandes de vários kilodaltons (kDa) como proteínas, nucleotídeos ou peptídeos (Figura 1). O objetivo do usuário de FPLC é obter o máximo possível de produto puro e nativo. Os objetivos da HPLC clássica, por outro lado, são identificar e qualificar analitos, geralmente pequenos compostos que variam em tamanho desde poucos átomos até aproximadamente 3000 Da.
O desafio de obter uma proteína pura de um extrato celular
Tipicamente, biomoléculas são purificadas a partir de células bacterianas ou eucarióticas, que são embaladas com proteínas, DNA, RNA, e membranas celulares. Portanto, a purificação da proteína de interesse de um extrato celular pode ser muito desafiadora. Os bioquímicos aplicam vários truques: um deles é usar proteínas recombinantes, que são sobreexpressas pelas células. A superexpressão da proteína de interesse permite a purificação em maiores quantidades. O segundo truque é adicionar uma etiqueta à proteína de interesse, que é especificamente reconhecida pela resina (material da coluna). As proteínas sem tag não se ligam à coluna e eluem imediatamente, enquanto a proteína desejada é enriquecida e pode ser separada facilmente.
Biomolecules são purificadas dos lisados celulares, o que significa volumes de amostra muito maiores do que na HPLC analítica. Portanto, são usados loops de amostra maiores ou mesmo bombas com taxas de fluxo mais altas para injetar a amostra. Além disso, os materiais das colunas FPLC e HPLC diferem completamente. Para HPLC, são aplicadas contas de sílica com partículas de tamanho muito pequeno e com grande resistência a altas pressões, enquanto a FPLC requer agarose ou material polimérico com partículas de tamanho maior para a maioria dos métodos. As resinas utilizadas para FPLC não são tão estáveis à pressão como as esferas de sílica e são muito sensíveis às bolhas de ar. Além disso, não só o material da coluna, mas também as ferragens da coluna são diferentes. No HPLC clássico, são utilizadas colunas de aço inoxidável resistentes à pressão. Como já foi mencionado, a estabilidade de pressão não é importante para FPLC e por isso é possível trabalhar com colunas de vidro transparentes e biocompatíveis. Isto é uma grande vantagem, uma vez que o usuário pode verificar a coluna quanto a bolhas de ar ou monitorar o estado do material durante uma corrida de purificação.
Biomoleculas Diversas, Métodos Diversos de Purificação
As diferenças no material da coluna também refletem nos métodos. Na HPLC analítica, a cromatografia de fase reversa com fases estacionárias hidrofóbicas e fases polares móveis é o método de escolha, enquanto na FPLC uma maior variedade de métodos é aplicada (Figura 2). Um método de FPLC é a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), onde as moléculas são separadas de acordo com seu tamanho. Moléculas menores podem se difundir para os poros das contas, enquanto moléculas maiores passam através da coluna quase não retidas. As moléculas menores eluem posteriormente da coluna gerando um gradiente destas moléculas de acordo com o seu tamanho. Outra abordagem de separação é a cromatografia de troca iónica. As biomoléculas são separadas e purificadas de acordo com a sua carga específica, que depende do pH do tampão. Quanto mais carregada for a proteína, melhor ela se ligará à resina carregada de forma oposta. Para eluir a proteína da coluna, a concentração de íons salgados é aumentada durante a corrida. Os iões de sal competem com a proteína para se ligarem à resina. Outro método importante de FPLC é a cromatografia de afinidade onde a molécula de interesse pode se ligar especificamente à coluna enquanto as outras moléculas não podem e vão se eluir sem se ligar. Aqui são usadas colunas com meios especiais que reconhecem a biomolécula desejada. Uma forma especial de cromatografia de afinidade é a afinidade de íons metálicos imobilizados (IMAC). A proteína de interesse tem de ser geneticamente alterada pela adição de uma etiqueta à proteína, que normalmente consiste em seis histidinas. A resina IMAC reconhece especificamente esta “Hisâtag”. A eluição ocorre através do aumento da concentração de imidazol que compete com as proteínas de His-tagged. Além disso, as proteínas também podem ser separadas por sua hidrofobicidade específica usando o método de separação por interação hidrofóbica. A resina é composta de tal forma que as proteínas hidrofóbicas mais fortes se ligam à coluna e são eluídas diminuindo o gradiente de sal.
Para purificar uma proteína desejada, uma combinação de métodos é normalmente utilizada. No primeiro passo, o chamado passo “captura”, a proteína é purificada a partir do extrato bruto. Tipicamente, a cromatografia de afinidade é utilizada para esta primeira etapa da purificação. A segunda etapa, a etapa “intermediária”, remove mais contaminação por cromatografia de troca iônica ou interação hidrofóbica. O objetivo da etapa final de “polimento” – geralmente uma etapa de cromatografia de exclusão de tamanho – é se livrar de todas as impurezas restantes para obter um produto de alta pureza. Esta estratégia de purificação de proteínas depende totalmente da biomolécula específica. Em alguns casos, uma etapa de purificação em duas etapas pode ser suficiente. Quanto mais métodos forem combinados, mais proteína de interesse é perdida durante a purificação, mas uma pureza mais elevada pode ser alcançada.
Após a purificação, a amostra obtida pode ser analisada para pureza, concentração e função ou atividade enzimática usando HPLC, sulfato de sódio poliacrilamida em gel eletroforese (SDS-PAGE), ensaios de atividade enzimática, ou espectrometria de massa.
FPLC Requerimentos
Proteínas são compostas de aminoácidos alinhados como uma cadeia. Esta cadeia é dobrada em uma estrutura tridimensional, que é a chave para a função e atividade de cada proteína. Portanto, é muito importante manter esta estrutura protéica durante o processo de purificação. Fatores externos como alta temperatura, alta pressão, pH extremo ou solventes podem perturbar a estrutura da proteína e, portanto, são evitados na FPLC. A temperatura de trabalho das proteínas é normalmente de 4 °C. É por isso que uma máquina de FPLC é frequentemente colocada dentro de uma câmara ou câmara fria onde é exposta não só à baixa temperatura, mas também à umidade condensada. Os componentes de um sistema de FPLC têm de ser especialmente concebidos para estas condições. Além disso, os componentes da FPLC encontram um desafio adicional, nomeadamente as soluções tampão salinas que são utilizadas como eluentes. O pH isosmótico e as concentrações de sal semelhantes às do ambiente celular são geralmente escolhidos. Os sistemas de cromatografia são geralmente feitos de aço inoxidável. Por um lado, o sal nos tampões pode levar à corrosão e, por outro, os íons metálicos do aço inoxidável podem interferir com as proteínas e perturbar a sua estrutura. Portanto, é importante evitar o aço inoxidável e utilizar material biocompatível como o poliéter éter-cetona (PEEK) cerâmica ou titânio ao realizar a FPLC. Tal como os sistemas HPLC, os sistemas FPLC também são controlados por software. Existem diferenças consideráveis entre os softwares de FPLC e HPLC. Este último é utilizado principalmente para analisar as amostras e contém uma série de ferramentas analíticas. Na FPLC, entretanto, não são necessárias muitas ferramentas analíticas e é comum gerar métodos baseados no volume ou mesmo no volume da coluna (Figura 3). Para a maioria das aplicações FPLC, os métodos baseados em volume de colunas são preferidos, facilitando o redimensionamento. O software FPLC é na sua maioria muito intuitivo e fácil de usar e inclui controle direto, o que permite ajustes dos parâmetros durante uma execução. Desta forma, o utilizador pode reagir a diferentes situações de forma muito espontânea.
É portanto claro que existem grandes diferenças entre estas duas áreas cromatográficas (Tabela 1). Métodos, hardware e software diferem muito, dependendo se a molécula é analisada ou purificada. Para aplicações FPLC, a natureza sensível das amostras e a ambição de mantê-las tão nativas quanto possível aumenta o desafio. Em geral, ambas as técnicas são áreas altamente interessantes que todos que trabalham no campo devem conhecer.
Stephanie Runde graduada pela Universidade Técnica de Munique, Alemanha, com um diploma em bioquímica. Ela obteve seu doutorado na Freie Universität Berlin, Alemanha, e atualmente trabalha na Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH como gerente de produto para FPLC.