A abordagem usual para o estudo da função dos genes é inserir ou inativar o gene em uma célula ou indivíduo, e observar mudanças no comportamento biológico celular ou fenótipos individuais para identificar sua função.

>Por isso o estudo da função do gene pode ser realizado seguindo os dois tipos de estratégias a seguir:

• Perda de função

• Ganho de função

Perda de função

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Nocautecção do gene é um dos métodos mais frequentemente utilizados para estudar a perda de função em ratos. Gene knockout refere-se à descoberta das funções biológicas dos genes alvo através do estudo de organismos que carregam os genes alvo inactivados (knocked out). Esta técnica requer que sejam feitas alterações nas sequências parciais dos genes alvo, que desactivam as funções dos genes específicos e assim inactivam parte ou a totalidade da função do gene alvo. Gene knockout pode ser ainda dividido em convencional gene knockout e condicional gene knockout.

Conventional Gene Knockout

• Conventional Knockout (abreviação: KO) refere-se ao knockout de certos exons vitais, domínios funcionais do gene alvo, ou mesmo todos os exons, em todas as células do rato, resultando assim na perda de expressão do gene alvo.

• Ratos KO carregam as sequências engendradas do gene alvo em todos os tecidos e células. Os genes alvo não são expressos em ratos homozigotos

• Ratos KO são geralmente usados para estudar os efeitos dos genes alvo ou funções proteicas na fisiologia ou patologia.

Nocauteamento Condicional do Gene

• Nocauteamento Condicional (abreviação: CKO) é a engenharia temporal e espacial específica do genoma do rato, limitando a engenharia genética a certos tipos específicos de células do rato ou a um estágio específico de desenvolvimento

• O alvo genético é usado em ratos CKO para flanquear um ou vários exões importantes do gene alvo com sítios loxP. A expressão do gene alvo era normal antes de cruzar com a estirpe de recombinase-expressora de Cre. Quando criado com camundongos transgénicos que exprimem a recombinação Cre, o gene alvo pode ser eliminado num tecido ou tipo celular específico, e a sua expressão permanecerá normal noutros tipos de tecidos ou células.

• Ratos CKO são geralmente utilizados para estudar genes que causam letalidade embrionária, funções dos genes ou proteínas alvo num determinado tipo de tecido ou célula, ou o papel dos genes ou proteínas alvo num determinado período ou fase.

Case: Aplicação dos modelos de rato Drd2 KO e Drd2 CKO na investigação da resposta imunitária cerebral

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Ganho de função

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O estudo da função do gene através da observação de alterações nos traços biológicos da célula ou indivíduo, nos quais o gene alvo tinha sido introduzido para gerar novos ou mais altos níveis de expressão.

Trangene aleatório

Trangénese de inserção aleatória é a integração aleatória de um gene exógeno no genoma do rato para gerar modelos de rato com sobreexpressão do gene alvo. É usada para estudar os impactos da superexpressão do gene alvo na fisiologia e patologia.

Expressão do gene alvo

A sequência de DNA exógeno é estavelmente expressa em camundongos depois de ter sido batido no Gt do rato (ROSA) 26Sou também conhecido como locus do gene Rosa26. A expressão do gene exógeno também pode ser específica dos tecidos ou induzida por drogas.

• Utilizado para experimentos de superexpressão sobre a função do gene e da proteína

• Pode ser usado para experimentos de resgate de fenótipos KO

Bock-in do gene gene

Knock-in (abreviação: KI) refere-se à introdução de mutações específicas ou seqüências exógenas de DNA no local do gene alvo.

(1) Introdução de uma mutação de base no gene alvo para imitar um modelo de doença genética humana.

(2) Introdução de um gene repórter, como EGFP, RFP, mCherry, YFP, LacZ, e Luciferase, no gene endógeno murino para observar o padrão de expressão do gene alvo.