Abstract

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) é amplamente utilizada em medicamentos populares. Glycyrrhizin, um composto activo de G. glabra, possui actividade anti-inflamatória. Este estudo investiga o extrato de G. glabra metanol e glicirrizina para o tratamento da neovascularização corneana (CNV). O G. glabra foi extraído em metanol aquoso a 70%. Testes fitoquímicos, cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia líquida de alta performance (HPLC) foram utilizados para a análise da composição química. A solução tópica do extrato de G. glabra metanol (2% p/v) e glicirrizina (1% p/v) foi preparada em solução salina normal. Após a queima da córnea (1 N NaOH), os animais ficaram sem tratamento durante uma semana para que a neovascularização aparecesse em todos os grupos. Os tratamentos começaram no dia 7 e continuaram pelos 21 dias consecutivos seguintes. Os animais foram tratados com 3 gotas de várias soluções tópicas três vezes ao dia. Para a avaliação do CNV foram utilizadas análises fotográficas digitais e estudos histológicos. A análise fitoquímica do extrato de G. glabra metanol mostrou a presença de saponinas, fenóis, carboidratos, flavonóides e proteínas. A TLC e HPLC confirmaram a presença de glicirrizina. A análise fotográfica do extrato e do grupo tratado com glicirrizina mostrou uma diminuição considerável no VCN. O estudo histológico dos grupos tratados com G. glabra e glicirrizina não mostrou vasos sanguíneos com fibras colágenas devidamente arranjadas. Este estudo mostrou que o G. glabra e a glicirrizina podem ser usados para o tratamento do CNV. O isolamento bio-ensaio guiado pode levar à preparação de soluções oftálmicas para o tratamento do CNV.

1. Introdução

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) é nativa da região mediterrânea, central ao sul da Rússia e Ásia, e agora é amplamente cultivada em toda a Europa e Oriente Médio. O alcaçuz tem um alto valor nutricional e era usado em alimentos desde os tempos antigos. Nos alimentos, é utilizado principalmente como adoçante. Tem também propriedades inibidoras da sensação de sede. O óleo de alcaçuz é aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) e tem aplicações em vários produtos alimentares, tais como bebidas, pasta de dentes, pastilhas elásticas e cosméticos. G. glabra tem sido amplamente utilizado na medicina popular para o tratamento de diferentes doenças . G. glabra folhas são usadas para o tratamento de raízes de feridas para diabetes, doença de Graves, flatulência e caule para o tratamento da tuberculose . Também é usada como afrodisíaco . O extrato de metanol das partes aéreas de G. glabra mostrou atividade antimicrobiana contra várias espécies bacterianas . O extrato aquoso de metanol de G. glabra inibiu a proliferação in vitro e in vivo de células tumorais da ascite Ehrlich e mostrou atividade antiangiogênica em ensaios in vivo, peritoneal e de membrana corioalantóica . O alcaçuz também mostrou efeitos de agregação antiplaquetária e também tem sido usado como erva medicinal para aliviar a tosse desde os tempos antigos. Descobriu-se que as raízes de alcaçuz chinesas inibiam o crescimento de Plasmodium falciparum e Leishmania donovani em estudos in vitro . Além disso, o alcaçuz foi relatado por ter atividades antibacterianas e antivirais .

G. glabra contém vários constituintes químicos, tais como saponina, flavonóides, isoflavonóides, estilbenoides e cumarinas. Os constituintes ativos nas saponinas são glicirrizina, ácido liquiritico e glicirretol. Nos flavonoides, os constituintes ativos incluem liquirtin, liquiritigenina e neoliquiritina. Nos isoflavonóides, eles são glabridina, glabrone, glizarina e galbreno. Os constituintes ativos em cumarinas são liqcoumarina e umbeliferona. Finalmente, nos estilbenoides, o componente ativo é diidróstilbenos. A glicirrizina é um sal de potássio e cálcio do ácido glicirrizínico. É um glicosídeo de saponina que, na hidrólise, produz ácido glicirretínico . A glicirrizina, também conhecida como ácido glicirrízico, é o principal constituinte ativo (10 a 25%) do extrato da raiz de G. glabra. A glicirrizina ajuda na inibição do câncer pulmonar e dos fibro sarcomas . No Japão, é utilizada para o tratamento da Hepatite C há mais de 60 anos. Além disso, a glicirrizina apresenta propriedades proapoptóticas em um modelo hepatocitário de lesão hepática colestática. O ácido glicirretínico foi encontrado como um potente inibidor da apoptose e necrose induzidas pelo ácido biliar . Foi descoberto que membros dos flavonóides como isoliquiritigenina e licochalcone possuem atividades antioxidantes, antitumor, anti-inflamatórias e antiangiogênicas .

A córnea é um tecido transparente, avascular e externo do olho. Sua transparência é necessária para a claridade da visão. Em condições normais, a avascularidade corneana é mantida por um equilíbrio entre os fatores angiogênicos e antiangiogênicos. A mudança desse equilíbrio para fatores angiogênicos causa neovascularização corneana (VCN). A CNV é uma condição patológica na qual a transparência da córnea é perdida devido ao crescimento de novos vasos sanguíneos da região do limbo do olho. O desenvolvimento do CNV leva a uma redução na transparência da córnea e, consequentemente, causa uma deficiência visual, geralmente perda da visão central ou pode até resultar em cegueira .

Embora a causa exata do CNV ainda não esteja completamente identificada, várias condições patológicas como inflamação, infecção, degeneração e distúrbios traumáticos podem induzir o CNV. O uso de lentes de contato também induz hipoxia, que pode, em última instância, levar ao VCN. Entre esses fatores, as doenças infecciosas da córnea são a causa mais importante do CNV. Atualmente, as opções de tratamento para o CNV incluem medicamentos como antiinflamatórios não esteróides (AINEs), esteróides e ciclosporina , terapias a laser como fotocoagulação a laser de argônio térmico, transplante de membrana amniótica, e transplante de limbo. No entanto, todos os tratamentos disponíveis têm desvantagens como custo elevado, baixa eficácia e efeitos secundários graves.

Há uma necessidade extrema de encontrar um tratamento novo e alternativo para o CNV. No passado, observou-se que extratos e compostos com atividades antiinflamatórias e antiangiogênicas têm o potencial de tratar o VCN. Com base nas informações etnofarmacológicas e outras informações científicas sobre atividades antiinflamatórias e antiangiogênicas do extrato de G. glabra e seu principal constituinte químico, a glicirrizina, o estudo atual foi realizado para avaliar seu potencial para o tratamento do CNV. Verificou-se que o extrato de G. glabra parou efetivamente o VCN, mas a glicirrizina foi relativamente menos eficaz em parar o desenvolvimento do VCN em modelo animal.

2. Materiais e Métodos

2.1. Material Vegetal

G. raízes de glabra foram compradas em junho de 2015 de uma autêntica loja de ervas em Abbottabad, Paquistão. A identificação do espécime (voucher número gg-09-R/15) foi confirmada pelo Dr. Abdul Nazir, Professor Assistente, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Paquistão, e o espécime da planta foi depositado no Department of Pharmacy, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Paquistão.

2.2. Produtos químicos

Glycyrrhizin (pureza 75%) foi comprado da Sigma Aldrich, EUA. Ketamina HCl (Indus Pharma, Paquistão), xilazina HCl (FARVET, Peru), proparacaína HCl (Alcon Laboratories, Inc., EUA), e soro fisiológico normal (Otsuka Pakistan Ltd.) foram comprados em uma farmácia local.

2.3. Processamento e Extracção

O material vegetal seco foi moído e extraído por imersão do material em pó (745 g) em metanol aquoso a 70% (3 L) à temperatura ambiente. A mistura foi mexida ocasionalmente com uma vareta de aço inoxidável durante duas semanas para obter o extracto máximo. O extrato foi filtrado através de um pano de musselina seguido pelo papel de filtro Whatman número 42 (125 mm). O extrato foi concentrado utilizando um evaporador rotativo a vácuo (Evaporador Rotativo Yamato, RE 801; Coréia do Sul) com o banho de água regulado para 40°C. O rendimento percentual final do extrato foi de 12,2%.

2,4. Análise Fitoquímica e Impressão Digital

O extrato bruto foi submetido a análise fitoquímica preliminar para todos os principais constituintes químicos usando testes químicos padrão . Para os alcalóides, o extrato (500 mg) foi agitado com 5 mL de HCl a 1% e aquecido suavemente durante 1 min usando um banho de água. Em seguida, 1 mL desta solução foi tomado e 0,5 mL de reagente de Wagner foi adicionado. O desenvolvimento de turbidez ou precipitados indicou a presença de alcalóides. Para os esteróides, foi utilizado o teste de Salkwoski no qual foram adicionados 2 mL de clorofórmio para dissolver 100 mg de extrato em um tubo de ensaio. Em seguida, 2 mL de H2SO4 concentrado foi adicionado cuidadosamente para formar a camada inferior. Uma cor verde formou-se na camada superior, indicando a presença de esteróides. Para as saponinas (teste de espuma), 3 mg de extrato foram dissolvidos em 10 mL de água destilada e sacudidos vigorosamente em um tubo de ensaio e deixados em repouso por 1 min. O desenvolvimento de espuma consistente indicava a presença de saponinas. Para os flavonóides (teste do acetato de chumbo), 1 mL de solução de acetato de chumbo (5%) foi adicionado a 1 mg de extrato de planta em um tubo de ensaio. A mistura foi autorizada a permanecer inalterada. A formação de precipitados de cor amarela indicou a presença de flavonóides. Para os fenóis (teste de cloreto férrico), 2 mg de extrato foram tomados em um tubo de ensaio e 3 gotas de 10% de cloreto férrico foram adicionadas. O aparecimento de uma cor negra-azulada indicou a presença de fenóis. Para os glicosídeos (teste do nitroprussiato), foi adicionado extrato de metanol com algumas gotas de hidróxido de sódio a 10% e, em seguida, nitroprussiato de sódio foi adicionado à solução acima. A aparência de uma cor azul indicava a presença de glicosídeos no extrato. Para reduzir os açúcares, a solução de Fehling (A e B) foi adicionada ao extrato aquoso de metanol (100 mg/mL) em um tubo de ensaio. A solução resultante foi aquecida em banho-maria durante 10 minutos. A formação de um precipitado vermelho alaranjado foi uma indicação positiva para a presença de açúcares redutores. Para a detecção de proteínas, o extrato vegetal foi tratado com poucas gotas de ácido nítrico concentrado. A formação de uma cor amarela indicou a presença de proteínas.

Cromatografia em camada fina (TLC) foi utilizada para a identificação de vários compostos, especialmente o principal constituinte químico, a glicirrizina. O extrato e a glicirrizina foram aplicados em placas de TLC revestidas com sílica gel (60 F254) e desenvolvidas em n-butanol, ácido acético e água destilada (12 : 3 : 5) como fase móvel. O sulfato cérico foi utilizado como reagente de pulverização para a visualização de compostos em placas de TLC.

Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) (Perkin Elmer, amostrador automático Série 200) foi utilizado para a análise de extrato e glicirrizina. As condições a seguir foram aplicadas durante a coleta das impressões digitais para HPLC: Detector UV-Vis (200-700 nm), coluna (C18) (5 μm, 150 mm × 4,6 mm), fase móvel que foi acetonitrilo e água na proporção de 10 : 90, volume de injeção que foi 20 μL, vazão que foi 1 mL/min, e filtro de membrana de 0,45 μm foram utilizados. Os compostos foram detectados a um comprimento de onda de 254 nm. Para o G. glabra, 100 mg do extrato foram tomados em 25 mL de metanol aquoso a 70% em um frasco volumétrico (50 mL) e sonicados por 50 min à temperatura ambiente. A solução padrão de glicirrizina foi preparada dissolvendo 5 mg de glicirrizina em metanol e o volume final foi feito em 10 mL com adição adicional de metanol. As soluções de reserva de G. glabra e glicirrizina foram filtradas e desgaseificadas ultra-sonicamente antes da análise.

2,5. Animais

Rabbits de qualquer gênero (1,5-2 kg) foram usados como modelo animal no estudo atual. Estes foram adquiridos no mercado local da cidade de Abbottabad. O protocolo experimental foi aprovado sob o regulamento do CIIT Abbottabad Ethical Committee for the animals with approval number PHM.Eth/SP.14-714-CIIT-ATD em 11 de julho de 2015, que segue todas as recomendações da Diretriz Ética Animal do NIH (1986). Os coelhos foram separados aleatoriamente em quatro grupos com um mínimo de cinco animais por grupo. Depois disso, cada coelho foi marcado na orelha dentro dos grupos para garantir sua separação durante todo o procedimento experimental. Os animais foram colocados na condição padrão e tiveram livre acesso a comida e água.

2,6. Indução de queimadura de córnea no olho do coelho

Para a indução do CNV, os olhos direitos de todos os animais experimentais foram danificados por queimadura alcalina (solução de hidróxido de sódio 1 N) usando o protocolo relatado . Resumidamente, os animais de experimentação passaram fome durante 12 h antes de iniciar o experimento. Os animais foram anestesiados usando uma injeção intramuscular de cetamina HCl (50 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) em combinação. Depois disso, o olho direito do coelho foi aberto com um espéculo de arame para que a queimadura alcalina pudesse ser induzida adequadamente. Aproximadamente, 2 min antes da queimadura, algumas gotas de HCl proparacaína foram instiladas no olho direito de cada coelho para minimizar a irritação na córnea. Um punção de papel foi usado para produzir um disco de 7 mm de papel filtro de Whatman. Os discos de papel de filtro foram suavemente mergulhados em solução de hidróxido de sódio 1 N por cerca de 90 s e posteriormente colocados centralmente na córnea por 2 min para induzir queimaduras graves. Os olhos foram lavados com soro fisiológico normal para humedecer e para obter esterilidade. Após a queimadura da córnea, os coelhos foram mantidos por uma semana para o desenvolvimento do CNV sem tratamentos adicionais.

2,7. Preparações de gotas para os olhos e protocolos de tratamento

A solução tópica de extrato de G. glabra (2% p/v) foi preparada em soro fisiológico normal com 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) e algumas gotas de Tween-80 e misturada com misturador vortex. Da mesma forma, a solução de glicirrizina (1% p/v) foi preparada em soro fisiológico normal. Para a preparação do veículo, o dimetil sulfóxido (DMSO) (10% v/v) e algumas gotas de Tween-80 foram misturados em soro fisiológico normal. A dexametasona (0,1%) (ALCON-COUVREUR, Bélgica) foi obtida no mercado local e utilizada como controle positivo. Todas as soluções tópicas foram embaladas em gotículas especiais adquiridas no mercado local e armazenadas a 4°C. Os tratamentos foram iniciados no 7º dia das queimaduras da córnea e continuaram pelos 21 dias consecutivos seguintes. Os olhos de diferentes grupos de animais foram tratados topicamente com 3 gotas de várias soluções três vezes ao dia. O primeiro grupo recebeu tratamento com extrato de G. glabra enquanto o segundo grupo foi tratado com glicirrizina. O terceiro grupo recebeu o veículo e o quarto grupo tratado com dexametasona (0,1%) foi considerado como um controle positivo.

2,8. Análise Microscópica e Fotográfica

A progressão do CNV em todos os grupos foi monitorada periodicamente através de um microscópio com lâmpada de fenda (Olympus-CX21) com uma fonte de luz artificial acoplada manualmente. As fotografias foram tiradas com uma câmara fotográfica digital (DSC-W70, Sony, Japão) com ampliação ×12, distância da lente de 85 mm, taxa de zoom de 100%, e distância de disparo de 29 cm. As fotografias foram tiradas nos dias 1, 7, 14, 21 e 28 e armazenadas no computador para uso posterior.

2,9. Estudos Histológicos de Tecidos Corneanos

No último dia do experimento, os animais foram sacrificados com luxação cervical. Os olhos inteiros foram extraídos e preservados em formalina neutra a 10%. Após as conservas, amostras de tecido corneal foram retiradas do olho inteiro por meio de lâminas cirúrgicas. Os tecidos foram então transferidos para frascos perfurados (cápsula) usando fórceps. Estes tecidos foram imersos em formalina (15%) e depois em formaldeído salino alcoólico (15%) durante 3 h cada. Os tecidos foram então desidratados com álcool (etanol) de grau ascendente. Durante esse processo, os tecidos foram tratados com 70% e 80% de álcool por 2 h cada e, finalmente, com 100% de álcool por 6 h. Na etapa seguinte, as amostras foram clareadas em xileno puro por 6 h (3 trocas a cada 2 horas em frascos diferentes). Os tecidos foram então embutidos em cera de parafina usando uma cabine automática a quente com uma faixa de temperatura de 58 ± 5°C. Os tecidos foram mergulhados em cera de parafina durante 4 h (2 h em 2 turnos e em diferentes frascos). Depois disso, foram obtidas secções de 4 μm de tecidos córneos utilizando um micrótomo rotatório (Thermo Fisher Scientific, Alemanha). Para uma fixação adequada, foram colocadas gotas de albumina de ovo sobre as lâminas e uma única secção de tecido foi montada sobre a mesma. Em seguida, as lâminas foram colocadas durante 2 h numa incubadora de convicção mecânica de precisão (aquecedor de lâminas) (Modelo 4EM Cat. número 31574). A coloração histológica de hematoxilina & eosina (H&E) foi realizada através de diferentes passos incluindo desparafinação, hidratação, coloração de hematoxilina, descoloração (coloração de eosina) e desidratação.

3. Resultados

3.1. Análise fitoquímica de G. glabra

Análise fitoquímica do extrato de G. glabra foi realizada para descobrir a presença das principais classes de constituintes fitoquímicos. Os resultados revelaram a presença de flavonóides, carboidratos, proteínas, saponinas e fenóis, como mostrado na Tabela 1. A presença de alcalóides, fitoesteróis e glicosídeos não foi confirmada no presente estudo (Tabela 1).

Os resultados obtidos a partir de testes químicos foram posteriormente confirmados através da análise TLC. O extrato foi padronizado com referência ao seu principal constituinte químico, a glicirrizina. Os resultados foram mostrados na Figura 1. Os valores do fator de retenção (Rf) dos constituintes do extrato foram comparados com a glicirrizina. Como mostrado na Figura 1, o valor de Rf para o ponto visível A em G. extrato de glabra foi de 0,43 enquanto para B foi de 0,15. O valor de Rf para a glicirrizina (mancha visível C) também foi 0,15. Com base nestes resultados, pode-se confirmar que a glicirrizina estava presente no extrato como um dos principais compostos.

Figura 1

perfil TLC para a análise de G. glabra e glicirrizina utilizando placas de TLC revestidas de sílica gel e n-butanol : ácido acético : água (12 : 3 : 5) como fase móvel.

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HPLC análise do extrato bruto derivado de G. glabra e glicirrizina foi realizada para obter os picos principais de vários constituintes químicos nos extratos e para confirmar a presença do composto principal (glicirrizina). O cromatograma resultante mostrou vários picos em diferentes tempos de retenção para o extrato de G. glabra, como mostrado na Figura 2(b). O cromatograma também mostrou um pico em um tempo de retenção de 40 min para a glicirrizina, como mostrado na Figura 2(a). Similar à glicirrizina, um pico também foi observado no cromatograma para o extrato no mesmo tempo de retenção (40 min), como mostrado na Figura 2(a). Os resultados confirmaram a presença de glicirrizina como o componente principal no extrato de G. glabra.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Cromatograma HPLC de (a) glicirrizina e (b) G. extrato de glabra. As condições HPLC foram comprimento de onda (254 nm), fase móvel (acetonitrilo : água), volume de injeção (20 μL) e vazão (1 mL/min).

3.2. Análise CNV do Extrato de G. glabra, Glicirrizina, Veículo e Grupos de Tratamento de Controle Positivo

Para observar a eficácia do extrato de G. glabra e do tratamento com glicirrizina, a progressão do CNV foi monitorada sob microscópio e através de análise fotográfica em diferentes dias de tratamento. As fotografias tiradas em diferentes dias de tratamento foram mostradas na Figura 3 para grupos tratados com extrato e veículo. Foi observado ao microscópio e também pode ser visto em fotografias que, mesmo na primeira semana de tratamento, a espessura do neovessel (NV) aumenta no grupo tratado com extrato. No entanto, uma diminuição mais rápida foi observada na espessura do vaso após a segunda semana (Figura 3) e continuou até o final do experimento. Os resultados obtidos mostraram que o extrato de G. glabra desapareceu quase completamente do VCN no dia 28 do experimento, em comparação com o grupo de controle do veículo (Figura 3). O grupo tratado com dexametasona (controle positivo) (Figura 3) também mostrou a mesma tendência que o grupo tratado com extrato de G. glabra. Também foi revelado pela observação microscópica, bem como pela análise fotográfica, que a glicirrizina também mostrou efeitos positivos no bloqueio do VCN. Quando os olhos foram analisados utilizando um microscópio de alta resolução, verificou-se que há um desvanecimento gradual dos vasos sanguíneos e retomada a sua forma normal no último dia de tratamento (Figura 3) com a presença de apenas poucos NV. Estes resultados mostraram que a atividade anti-CNV da glicirrizina foi ligeiramente inferior à do extrato bruto.

Figura 3

Fotos representativas do CNV em G. extrato de glabra, glicirrizina, veículo, e grupo tratado com dexametasona (controle positivo) nos dias 0, 7, 14, 21, e 28. Há uma diminuição gradual no diâmetro e espessura do NV, e quase desapareceu no último dia da experiência. O grupo tratado com glicirrizina também mostrou diminuição no diâmetro e espessura do NV, mas a atividade foi menor que a do extrato de G. glabra.

3.3. Análise histológica da córnea tratada com G. glabra e Glycyrrhizin em comparação com veículo e grupo controle positivo

A análise histológica foi realizada para conhecer a presença de inflamação, recuperação das fibras corneanas e a existência de vasos sanguíneos. As microfotografias representativas da coloração H&E foram mostradas na Figura 4. A histologia do olho esquerdo de cada animal foi considerada como um tecido de referência, pois não foram induzidas queimaduras alcalinas e foram mantidas em condições normais. Na córnea de referência, não houve crescimento epitelial e NV, assim como não houve alterações na morfologia, como mostrado na Figura 4. No grupo controle de veículos (Figura 4), houve extensos vasos sanguíneos e ruptura de colágeno, o que mostrou o desenvolvimento do VCN. Por outro lado, a histologia dos extratos de G. glabra da córnea tratada mostrou que a região corneana quase se recuperou ao normal com vasos sanguíneos quase diminuídos e colágenos em forma normal. A análise histológica do grupo tratado com glicirrizina (Figura 4) mostrou que, embora a região corneana tenha se recuperado em sua forma normal, há algumas indicações de que os danos ainda estão presentes. Houve alguns sinais de hipertrofia epitelial e menos vasos sanguíneos também foram observados. Estes resultados mostraram que a glicirrizina é eficaz na inibição do VCN, mas em menor grau que o extrato de G. glabra. Em comparação, a microfotografia das lâminas coradas com H&E da córnea tratada com dexametasona (Figura 4) mostrou redução do crescimento epitelial e da formação de vasos sanguíneos na região corneana, mas as fibras de colágeno estavam de alguma forma em estado destruído e dispostas ao acaso.

Figura 4

Microfotografia histológica de G. grupo tratado com glabra e glicirrizina em comparação ao controle de veículos e controle positivo.

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4. Discussão

CNV é uma das principais causas de cegueira no mundo. Foi estimado que cerca de 4,14% da população mundial é afectada por esta doença. A principal causa molecular do VCN é o desequilíbrio entre fatores angiogênicos e antiangiogênicos. Entre esses fatores, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) promove a propagação, a passagem e a formação de tubos das células endoteliais vasculares . Portanto, existe a possibilidade de tratar o VCN com agentes anti-VEGF; no entanto, ele não pode ser completamente tratado apenas com a terapia anti-VEGF, pois também existem alguns reguladores adicionais de angiogênese. Além disso, a inflamação e a angiogênese são processos interdependentes e, portanto, o tratamento anti-VEGF pode não ser bem sucedido. No passado, observou-se que extratos e compostos com atividade antitumoral e antiinflamatória são úteis na inibição de NV e CNV . O extrato bruto de G. glabra mostrou um efeito anti-inflamatório enquanto o extrato aquoso de G. glabra inibiu a angiogênese em ensaios in vivo . Portanto, foi feita a hipótese de que o extrato de G. glabra e seu principal constituinte químico, a glicirrizina, pode ter a capacidade de controlar o CNV e, portanto, o estudo atual foi realizado.

É importante conhecer a composição química de qualquer extrato antes de avaliá-lo para atividades biológicas. Portanto, foi realizada análise fitoquímica do extrato de G. glabra, que revelou que contém importantes constituintes químicos como flavonóides, carboidratos, proteínas, saponinas e fenóis. Estudos anteriores relataram a presença de saponina, flavonóides, alcalóides, terpenóides, taninos e glicosídeos, mas não foram detectados carboidratos, proteínas, clobataninas, compostos fenólicos e antraquinonas. Outro estudo mostrou a presença de carboidratos, compostos fenólicos e proteínas juntamente com outros constituintes no extrato de G. glabra . As razões para estas diferenças podem ser a estação e a idade das plantas coletadas.

TLC e HPLC confirmaram a presença de glicirrizina no extrato bruto. Os cromatogramas de TLC e HPLC do extrato revelaram um composto no valor Rf (0,15) e tempo de retenção (cerca de 40 min) como o da glicirrizina padrão. Estes resultados são um pequeno desvio das observações anteriores nas quais a glicirrizina padrão foi encontrada a 0,22 . A principal razão para isto pode ser o uso de diferentes reagentes e condições no estudo anterior e no presente. No estudo anterior, clorofórmio, metanol e água foram usados como fase móvel e ácido anisaldeído sulfúrico como reagente de pulverização, enquanto no presente estudo o n-butanol, ácido acético e água destilada foram usados como fase móvel e sulfato cérico como reagente de pulverização.

Glycyrrhizin, um dos principais componentes da G. glabra, foi relatado possuir atividades anti-inflamatórias e anticancerígenas . Os resultados do presente estudo revelaram que o extrato de G. glabra foi bem sucedido na inibição do VCN, pois os NV foram quase diminuídos após 21 dias de tratamento (Figura 3). Sendo o composto principal, pensou-se que a inibição do VCN poderia ser devida à glicirrizina. A análise anti-CNV da glicirrizina mostrou alguns efeitos positivos sobre a inibição do VCN, mas foi incapaz de diminuir completamente os vasos sanguíneos na região da córnea (Figura 3). A glicirrizina é um glicosídeo triterpenoide (saponina) com ácido glicirretínico. Anteriormente, foi relatado que o ácido glicirretínico tem efeito direto sobre os receptores mineralocorticóides e produz efeitos semelhantes aos inflamatórios, o que pode ser uma das razões para os efeitos mais baixos da glicirrizina. Este estudo sugere que juntamente com a glicirrizina alguns outros compostos podem ser responsáveis pela inibição do VCN no extrato de G. glabra.

Também foi importante estudar os efeitos do extrato de G. glabra e da glicirrizina na anatomia microscópica (microanatomia) do tecido corneal. Portanto, a análise histológica foi realizada e seus resultados confirmaram os efeitos anti-CNV do extrato de G. glabra. Além disso, não houve sinais claros de toxicidade, pois as fibras de colágeno foram dispostas em uma matriz na córnea animal tratada com o extrato de G. glabra. A anatomia microscópica da córnea tratada com o extrato de G. glabra foi muito semelhante à do controle normal. Por outro lado, não havia sinais de vasos sanguíneos na córnea tratada com dexametasona (controle positivo), mas as fibras colágenas ainda estavam em desarranjo, o que mostrou que a dexametasona pode ter alguns efeitos tóxicos sobre a córnea. Embora estudos anteriores também tenham relatado efeitos tóxicos da dexametasona, mais pesquisas são necessárias para confirmar este fenômeno a nível microanatômico. Também é importante mencionar que embora a glicirrizina tenha tido grande sucesso no controle do VCN, ela não foi capaz de recuperar completamente a córnea danificada por álcali e alguns vasos sanguíneos também foram observados.

5. Conclusões

Pode-se concluir dos resultados que as gotas oftálmicas do extrato cru de G. glabra inibiram o crescimento dos vasos na região corneana, o que indica que ela seria eficaz no tratamento do VCN. Além disso, o composto principal de G. glabra, glicirrizina, foi incapaz de impedir completamente o CNV. Isto significa que alguns outros constituintes também podem ser responsáveis, juntamente com a glicirrizina, pela atividade anti-CNV do extrato. Para este fim, é necessária mais pesquisa sobre o bioensaio guiado de isolamento para a identificação do(s) principal(is) componente(s) responsável(is) pela inibição do CNV. Além disso, estudos moleculares também serão úteis para descobrir o mecanismo molecular exato do extrato de G. glabra no tratamento do CNV.

Conflitos de Interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Contribuições dos autores

Syed Luqman Shah e todos os outros autores contribuíram igualmente para este trabalho. O trabalho final é aprovado por todos os autores.

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Administrações

Os autores desejam agradecer a Christie Ronge, Departamento de Farmácia, Froedtert & ao Medical College of Wisconsin, 9200 West Wisconsin Avenue, Milwaukee, WI, por sua assistência em correções lingüísticas/gramáticas.