… (Zhang et al., 2009), causou graves problemas de caracterização das proteínas Flv4 e Flv2. Foi especulado que tal associação de membranas ocorre através da proteína Sll0218, que é uma proteína de membrana integral com quatro hélices transmembranas previstas. Entretanto, isto não foi o caso, pois a Flv4 permaneceu em grande parte na fração membrana mesmo na ausência da proteína Sll0218 (D fl v2 , D sll0218-19 , e D sll0218- 19/ fl ag – fl v4 mutantes) (dados não mostrados). Além disso, a proteína Sll0218 está associada a um grande complexo de membranas independentemente do heterodímero Flv2/Flv4 ( Figura 4). Finalmente, modificando o método de partição bifásica para subfração da membrana, a proteína Sll0218 foi localizada à membrana tilóide, enquanto Flv4 e Flv2 nesse sistema tendem a se associar com a membrana plasmática (Figura 2D). Esta última associação parece ser fortemente dependente de cátions (Figuras 2B e 2C). Comportamento semelhante foi relatado recentemente para outra proteína Synechocystis, embora o mecanismo de associação da membrana não esteja claro (Carmel et al., 2011). Com base no modelo heterodímero Flv2/Flv4 e no alinhamento da sequência, alguns locais putativos de ligação de metais envolvendo os resíduos de His, Asp e Glu foram reconhecidos na superfície da proteína. Metais ligados à superfície também foram encontrados em estruturas homólogas. Por exemplo, o domínio tipo fl avodoxin de Synechococcus sp (PDB ID: 3HLY) tem um Ca 2+ , e M. thermoacetica FprA (PDB ID: 1YCF, 1YCG, e 1YCH) tem vários Zn 2+ ligados na superfície (Silaghi-Dumitrescu et al., 2005). Os íons metálicos nas estruturas são originários da solução de cristalização, mas alguns dos resíduos de ligação do metal são conservados ou substituídos por resíduos similares em nosso modelo (ver Tabela Complementar 2 online). Tomados em conjunto, esses resíduos podem ser responsáveis pela associação catiônica dependente de Flv2 e Flv4 à fração membrana. Com base na análise do potencial eletrostático da superfície do modelo, o monômero Flv4 tem uma superfície com carga mais negativa (Figura 8B) e contém mais locais de ligação metálica na superfície do que o monômero Flv2 (veja a Tabela Suplementar 2 online). Levando em consideração o fato de que a concentração de cátions utilizada no tampão de isolamento é muito maior que as condições fisiológicas reais (Figuras 2B a 2D), a ligação de Flv2/Flv4 à membrana in vivo pode ser transitória e reversível. Especificar a cidade de Flv2/Flv4 para membrana plasmática na quebra da célula (Figura 2D) também pode estar relacionada à sua carga superficial, uma vez que a superfície interna da membrana plasmática é mais negativa do que a membrana tifóide do lado direito (Barber, 1982; Körner et al., 1985). Entretanto, a carga superficial da membrana tifóide pode ser drasticamente alterada durante a fotossíntese, que pode mediar a ligação em trânsito de Flv2/Flv4 também com a membrana tifóide. A proteína Sll0218 foi inequivocamente localizada em um complexo de massa molecular alta na membrana tilóide. Entretanto, o estranho comportamento da proteína Sll0218 no sistema convencional de partição bifásica das subfrações da membrana sugeriu que a proteína Sll0218 não é distribuída uniformemente na membrana tilóide. Ela está associada a um grande complexo, que é apenas marginalmente menor do que o maior dímero PSII. O desprendimento da razão entre o dímero PSII e os complexos monômeros PSII ocorre apenas nos mutantes que não possuem a proteína Sll0218 ( D sll0218-19 e D fl v4 ), mas não em D fl v2 (Figura 5, Tabela 1). Portanto, postulamos que a Sll0218 pode funcionar como um acompanhante na estabilização do dímero PSII montado sob condições de nível de ar de CO 2 . Embora o complexo PSII tenha sido isolado tanto na forma monomérica quanto dimérica (Rögner et al., 1987; Hankamer et al., 1997; Adachi et al., 2009), é amplamente aceito que in vivo o complexo PSII funciona como um dímero em cianobactérias, bem como em plantas superiores (Hankamer et al, 1999; Kuhl et al., 2000), enquanto que a PSII monomérica pode ser um intermediário da montagem e reparação normal da PSII (Aro et al., 2005; Nixon et al., 2010). Embora a dimerização in vivo da PSII em cianobactérias tenha sido questionada devido ao uso de detergentes para solubilização e análise in vitro dos complexos tiacóides (Takahashi et al., 2009; Watanabe et al., 2009), há evidências convincentes para a formação de dímeros por abordagens mutantes. De fato, pequenas subunidades PSII PsbM e PsbT, localizadas em interface monomomomo-monômero, têm se mostrado cruciais para a montagem e reparo adequados das PSII (Ohnishi e Takahashi, 2001; Iwai et al., 2004; Bentley et al., 2008). Como a proteína Sll0218 é expressa apenas sob condições de baixo CO 2 (isto é, nível de ar), postulamos que a montagem dos dímeros PSII difere dependendo da presença ou ausência das proteínas Sll0218 (ver abaixo). A otimização da fotossíntese requer uma regulação rigorosa entre absorção e conversão da energia solar em energia química e sua utilização pelas vias metabólicas a jusante. Para fotoautotrofos aquáticos, tais como as cianobactérias, o CO 2 é um substrato essencial, mas muitas vezes de fi cient. Em ambientes naturais, a insuficiente disponibilidade do CO 2 , especialmente quando combinado com alta irradiação, resulta em alta pressão de excitação nos fotossistemas (Huner, 1998) e limita a taxa de fotossíntese. Para lidar com isso, vários mecanismos de concentração de CO 2 são fortemente induzidos em condições de baixa Ci em cianobactérias para aumentar a concentração de CO 2 ao redor da ribulose-1,5-bis-fosfato-carboxilase/oxigenase e, ao mesmo tempo, induzir a fl ow cíclica de elétrons para gerar mais ATP (revisado em Kaplan e Reinhold, 1999; Giordano et al., 2005; Badger et al., 2006; Price et al., 2008). Estudos microarray e proteômicos revelaram um estimulante de baixo CO 2 (Wang et al., 2004; Eisenhut et al., 2007; Battchikova et al., 2010), incluindo também o operon sll0217-19 ( fl v4- fl v2 ), que é regulado tão fortemente quanto os genes induzíveis do mecanismo de concentração de CO 2. Os genes fl v2 e fl v4 também têm uma alta resposta à luz (Hihara et al., 2001; Zhang et al., 2009). Os mutantes de inativação fl v4 e fl v2 revelaram uma alta suscetibilidade à fotoinibição do PSII sob condições de concentração de CO 2 no ar (Zhang et al., 2009). Além disso, nossos estudos recentes sobre a expressão do ópero revelaram uma regulação apertada deste ópero fl v4- fl v2 por pequenos RNAs reguladores (M. Eisenhut, J. Georg, S. Klähn, I. Sakurai, H. Silén, P. Zhang, W.R. Hess, e E.-M. Aro, dados não publicados). Tão forte indução e regulação por RNAs antisense do operon fl v4- fl v2 junto com a proteção observada de PSII sob nível de ar de CO e alto …