Relatamos aqui um método para a determinação da pKa de histidina em sistemas complexos ou heterogêneos, não sendo possível a espectroscopia de NMR em estado sólido nem em solução. A síntese cuidadosa de um fluorenilmetiloxicarbonilo – e de uma histidina C2-detectada, protegida por trityl, produz um aminoácido equipado com sonda vibratória que pode ser prontamente incorporado em qualquer peptídeo acessível por métodos de fase sólida padrão. A frequência da única vibração de estiramento Raman-activa desta sonda C2-D é um repórter claro do estado de protonação da histidina. Nós investigamos aqui um peptídeo sensível ao pH que se auto-monta para formar um hidrogel em pH neutro. A pKa do resíduo solitário de histidina no peptídeo, que provavelmente é responsável por esse comportamento dependente do pH, não pode ser investigada pela espectroscopia da RMN devido à natureza supramolecular e suave do gel. Entretanto, após sintetizarmos um peptídeo contendo histidina eliminada por C2, conseguimos acompanhar o estado de protonação da histidina ao longo de uma titulação de pH usando a espectroscopia de diferença Raman, determinando assim com precisão a pKa de interesse.