FRAP também pode ser usada para monitorizar proteínas fora da membrana. Após a proteína de interesse tornar-se fluorescente, geralmente por expressão como uma proteína de fusão GFP, um microscópio confocal é usado para fotobleach e monitorar uma região do citoplasma, fuso mitótico, núcleo, ou outra estrutura celular. A fluorescência média na região pode então ser plotada versus o tempo desde a fotobleaching, e a curva resultante pode render coeficientes cinéticos, tais como os das reações de ligação da proteína e/ou coeficiente de difusão da proteína no meio onde ela está sendo monitorada. Muitas vezes as únicas dinâmicas consideradas são as interacções de difusão e binding/unbinding, no entanto, em princípio as proteínas também podem mover-se através do fluxo, ou seja Isto pode ser devido ao fluxo do citoplasma ou nucleoplasma, ou ao transporte ao longo de filamentos na célula como microtúbulos por motores moleculares.

A análise é mais simples quando a recuperação da fluorescência é limitada pela taxa de difusão para a área branqueada ou pela taxa na qual as proteínas branqueadas se desacoplam dos seus locais de ligação dentro da área branqueada, e são substituídas por proteínas fluorescentes. Vejamos estes dois limites, para o caso comum do branqueamento de uma proteína de fusão GFP numa célula viva.

Recuperação de fluorescência limitada por difusãoEditar

Para um ponto de branqueamento circular de raio w {\displaystyle w}

e recuperação dominada pela difusão, a fluorescência é descrita por uma equação derivada por Soumpasis (que envolve funções de Bessel modificadas I 0 {\displaystyle I_{0}}

e I 1 {\i1}displaystyle I_{1}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) 2\tau _{D}/t}{D esquerda(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t){direita)}

with τ D {\i}displaystyle {D}tau _{D}}

a escala de tempo característica para difusão, e t {\i1}displaystyle t

é o tempo. f ( t ) f(t)}displaystyle f(t)}

é a fluorescência normalizada (vai para 1 como t {\displaystyle t}

vai para o infinito). A escala de tempo de difusão para um ponto descolorido de raio w {\displaystyle w}

é τ D = w 2 / ( 4 D ) {\i1}displaystyle \i _{\i}=w^{2}/(4D)}

, com D o coeficiente de difusão.

Note que isto é para uma lixívia instantânea com um perfil de função passo, ou seja, a fracção f b b {\displaystyle f_{b}}

de proteína supostamente branqueada instantaneamente no momento t = 0 {\displaystyle t=0}

é f b ( r ) = b , r < w {\i1}displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, e f b ( r ) = 0 , r > w {\i}displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, para r {\i}displaystyle r}

é a distância do centro da área branqueada. Assume-se também que a recuperação pode ser modelada por difusão em duas dimensões, que também é uniforme e isotrópica. Em outras palavras, que a difusão está ocorrendo em um meio uniforme de modo que a constante de difusão efetiva D é a mesma em toda parte, e que a difusão é isotrópica, ou seja, ocorre na mesma velocidade ao longo de todos os eixos do plano.

Na prática, em uma célula nenhuma destas suposições será estritamente verdadeira.

1. Bleaching não será instantâneo. Particularmente se um branqueamento forte de uma grande área for necessário, o branqueamento pode levar uma fração significativa do tempo de difusão τ D {\displaystyle {\displaystyle {\displaystyle {\displaystyle {\d}}
   

   . Então uma fração significativa da proteína branqueada irá se difundir para fora da região branqueada na verdade durante o branqueamento. Se isto não for levado em conta, um erro significativo será introduzido em D.

2. O perfil branqueado não será uma função de passo radial. Se o ponto branqueado for efectivamente um único pixel, então o branqueamento em função da posição será normalmente limitado por difracção e determinado pela óptica do microscópio de varrimento a laser confocal utilizado. Esta não é uma função de passo radial e também varia ao longo do eixo perpendicular ao plano.
3. Células são naturalmente tridimensionais e não bidimensionais, assim como o volume branqueado. Negligenciar a difusão para fora do plano (tomamos este como sendo o plano xy) será uma aproximação razoável apenas se a fluorescência se recuperar predominantemente por difusão neste plano. Isto será verdade, por exemplo, se um volume cilíndrico for branqueado com o eixo do cilindro ao longo do eixo z e com este volume cilíndrico passando por toda a altura da célula. Então a difusão ao longo do eixo z não causa recuperação da fluorescência, pois toda proteína é branqueada uniformemente ao longo do eixo z, e assim negligenciá-la, como faz a equação de Soumpasis, é inofensiva. Entretanto, se a difusão ao longo do eixo z contribui para a recuperação da fluorescência, então ela deve ser contabilizada.
4. Não há razão para esperar que o citoplasma ou nucleoplasma da célula seja completamente uniforme espacialmente ou isotrópico.

Assim, a equação de Soumpasis é apenas uma aproximação útil, que pode ser usada quando as suposições listadas acima são boas aproximações à situação real, e quando a recuperação da fluorescência é de fato limitada pelo tempo de difusão τ D {\displaystyle \tau _{D}}

. Note que só porque o Soumpasis pode ser ajustado adequadamente aos dados não implica necessariamente que as suposições sejam verdadeiras e que a difusão domine a recuperação.

Recuperação limitada por reaçãoEditar

A equação que descreve a fluorescência como uma função do tempo é particularmente simples em outro limite. Se um grande número de proteínas se liga a locais num pequeno volume, de tal forma que o sinal de fluorescência é dominado pelo sinal das proteínas ligadas, e se esta ligação está num único estado com uma taxa de off koff, então a fluorescência em função do tempo é dada por

f ( t ) = 1 – e – k off t {\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{\text{\text{off}}t}}}

Nota que a recuperação depende da constante de taxa para desobrigação, koff, apenas. Não depende da taxa de encadernação. Embora dependa de uma série de pressupostos

1. A taxa de ligação deve ser suficientemente grande para que a concentração local de proteína ligada exceda em muito a concentração local de proteína livre, e assim permitir-nos negligenciar a contribuição para f da proteína livre.
2. A reacção é uma reacção bimolecular simples, onde a proteína se liga a locais localizados que não se movem significativamente durante a recuperação
3. A troca é muito mais lenta do que a difusão (ou qualquer mecanismo de transporte responsável pela mobilidade), como só então a recuperação da fracção difusora se recupera rapidamente e depois actua como fonte de proteína fluorescente que se liga e substitui a proteína branqueada ligada e assim aumenta a fluorescência. Com r o raio do ponto descolorado, isto significa que a equação só é válida se a vida útil limitada 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{\text{\text{off}}>>r^{2}/D} No entanto, outras dinâmicas podem dar curvas de recuperação semelhantes a exponenciais, portanto encaixar um exponencial não implica necessariamente que a recuperação seja dominada por uma simples reação bimolecular. Uma forma de distinguir entre recuperação com uma taxa determinada pela desobstrução e recuperação limitada pela difusão, é notar que a taxa de recuperação para a recuperação desobstruída é independente do tamanho da área branqueada r, enquanto que ela se escalona como r – 2 ^{\i1}- estilo r^{-2}
   

   , para recuperação limitada por difusão. Assim, se uma área pequena e uma grande forem branqueadas, se a recuperação for limitada por desbobinamento então as taxas de recuperação serão as mesmas para os dois tamanhos de área branqueada, enquanto que se a recuperação for limitada por difusão então será muito mais lenta para a área branqueada maior.

   Difusão e reaçãoEditar

   Em geral, a recuperação da fluorescência não será dominada por difusão isotrópica simples, ou por uma única taxa de desbobinamento simples. Haverá tanto difusão como ligação, e na verdade a constante de difusão pode não ser uniforme no espaço, e pode haver mais de um tipo de sítios de ligação, e estes sítios também podem ter uma distribuição não uniforme no espaço. Os processos de fluxo também podem ser importantes. Este comportamento mais complexo implica que um modelo com vários parâmetros é necessário para descrever os dados; modelos com apenas uma única constante de difusão D ou uma única constante de taxa de desvio, koff, são inadequados.

   Existem modelos com difusão e reação. Infelizmente, uma única curva FRAP pode não fornecer evidências suficientes para se ajustar de forma confiável e única (possivelmente ruidosa) aos dados experimentais. Sadegh Zadeh et al. mostraram que curvas FRAP podem ser ajustadas por diferentes pares de valores da constante de difusão e da constante de taxa ou, em outras palavras, que se ajustam ao FRAP não são únicas. Isto é em três parâmetros (constante on-rate, constante off-rate e constante de difusão) encaixa. Os ajustes que não são únicos, não são geralmente úteis.

   Assim, para modelos com vários parâmetros, um único experimento FRAP pode ser insuficiente para estimar todos os parâmetros do modelo. Então mais dados são necessários, por exemplo, por áreas de branqueamento de diferentes tamanhos, determinando alguns parâmetros do modelo independentemente, etc.