Tipos de hemócitos em grilos

Figure 1A mostra uma imagem microscópica de contraste diferencial de interferência (DIC) de hemócitos de críquete, mostrando células de vários tamanhos e formas. Para identificação precisa destes hemócitos, aproximadamente 1.000 células foram classificadas pelo seu tamanho e morfologia (dados não mostrados) em seis tipos (Fig. 1B~G). Como mostrado na Fig. 1B, o granulócito típico foi observado na hemolinfa. Os granulócitos geralmente tinham forma redonda ou oval, e muitos grânulos polimórficos foram observados dentro do citoplasma. Pequenos pseudopodia ou filopodia foram observados na membrana plasmática do granulócito (Fig. 1B, indicada por setas brancas). A célula mostrada na Fig. 1C foi considerada plasmatócitos devido à sua forma típica de fuso e às estruturas longas, semelhantes a cabelos, observadas em ambas as extremidades da membrana plasmática (indicadas por setas brancas). A Figura 1D mostra um proematócito, que são as menores células redondas observadas na hemolinfa do inseto. Os núcleos eram grandes em relação ao tamanho celular e estavam localizados no meio da célula (Fig. 1D). Assim, o citoplasma e o núcleo dos proemócitos eram frequentemente indistinguíveis. A Figura 1E mostra um coagulócito contendo vários grânulos citoplásmicos. As membranas plasmáticas dos coagulócitos eram lisas, sem qualquer estrutura, e seus núcleos eram grandes e facilmente observáveis. Os enocitócitos eram o maior tipo de hemócito observado e eram escassos na hemolinfa (Fig. 1F). Os enocitóides geralmente tinham uma forma de ovo frito redondo com numerosos grânulos citoplásmicos. A Figura 1G mostra um esferulócito, que era redondo e de tamanho médio com muitos pequenos grânulos escuros ou brilhantes no citoplasma. Como mostrado na Figura 1D~G, nenhuma estrutura era visível nas membranas plasmáticas dos proemócitos, coagulócitos, enocitóides ou esferulócitos, que eram opticamente muito lisas.

Os seis tipos de hemócitos observados no sangue dos grilos. Forma geral e tamanho relativo dos hemócitos na hemolinfa (A). Os seis tipos de hemócitos encontrados em G. bimaculatus foram classificados como granulócitos (B ; GR), plasmatócitos (C ; PL), prohemócitos (D ; PR), coagulócitos (E ; CO), enocitóides (F ; OE), e esferulócitos (G ; AD) com base no tamanho e morfologia. As estruturas em forma de leque ou ameba na membrana plasmática de granulócitos e plasmatócitos são indicadas por setas brancas (B e C). Barra de escala = 25 µm (A) ou 10 µm (B~G).

Nodulação e encapsulamento por hemócitos

Em insetos, respostas imunes celulares como nodulação, encapsulamento e fagocitose são realizadas por hemócitos imunes como granulócitos e plasmatócitos. Após a exposição ao patógeno, estes hemócitos mudam de forma e desenvolvem grandes estruturas semelhantes a amebas ou em forma de leque nas suas membranas plasmáticas. Para observar estas rápidas mudanças morfológicas em tempo real, desenvolvemos uma técnica que nos permite o cultivo de hemócitos de insetos por 7 dias, preservando a atividade fisiológica (descrita nos Materiais e Métodos). Embora não pudéssemos estabelecer linhas estáveis de hemócitos que pudessem ser passadas durante vários anos, pudemos observar a morfologia dos hemócitos em resposta aos patógenos in vitro. O Filme Complementar C mostra apenas hemócitos após 12 h de incubação. A maioria das células cultivadas estavam em movimento ativo. Algumas células exibiram redes ao redor da membrana celular durante a cultura e foram encontradas presas às lâminas de cultura. Os hemócitos raramente agregaram ou formaram grandes grupos.

Figure 2A mostra hemócitos cultivados com E. coli (ver também o Filme Suplementar 1). Alguns hemócitos foram observados como sendo mais agregados e em movimento. À medida que o tempo de incubação aumentava, foram produzidas redes (pêlos semelhantes a amebas ou armadilhas extracelulares) por hemócitos específicos, e vários hemócitos foram reunidos por estas redes para formar grandes aglomerados (Fig. 2A-1~A-6; pêlos semelhantes a amebas ou armadilhas extracelulares indicadas por setas negras). Como mostrado na Fig. 2A-1, três grupos de hemócitos (indicados por círculos negros) foram finalmente atraídos para um aglomerado pelas redes (Fig. 2A-5 e A-6).

Imagens de células vivas de hemócitos de críquete infectados com E. coli ou contas de Sephadex. (A) Imagens microscópicas leves mostrando hemócitos cultivados com E. coli. À medida que o tempo de incubação aumentava, redes (pêlos semelhantes a amebas ou armadilhas extracelulares; indicadas por setas negras) eram produzidas por hemócitos específicos. Todos os seis tipos de hemócitos foram agregados em grandes grupos por estas redes (A-1~A-6; indicado por caixas pretas). Filme disponível como Filme 1 (tempo em minutos pós-inoculação). (B) Imagens microscópicas leves mostrando hemócitos cultivados com contas de Sephadex. As contas de sephadex ao redor dos hemócitos foram rotuladas aleatoriamente como SP1, SP2, SP3, SP4, e SP5. Com o tempo, as esferas de sephadex (SP1, SP2, SP3 e SP4) foram circundadas por hemócitos e encapsuladas por vários tipos de redes (B-1~B-9; indicadas por setas pretas). Filme disponível como Filme 2 (tempo em minutos pós-inoculação). Barra de escala = 25 µm (A e B). O Filme C mostra hemócitos cultivados sozinhos, sem contas de Sephadex. A maioria dos hemócitos estava em movimento ativo. Algumas células foram ligadas às lâminas de cultura por redes de membrana plasmática. Contudo, não foram observados grandes grupos de hemócitos.

No entanto, não foi possível determinar se a recolha dos hemócitos descritos acima foi desencadeada por E. coli. Para abordar esta questão, os hemócitos foram activados com contas de Sephadex (120 μm diâmetro), que podem ser facilmente observadas com um microscópio DIC (Fig. 2B, Filme Suplementar 2). Como mostrado na Fig. 2A, as contas de Sephadex foram capturadas pelas redes geradas por hemócitos específicos (Fig. 2B; redes indicadas por setas pretas nas caixas amarelas). As contas de sephadex ao redor dos hemócitos foram rotuladas aleatoriamente SP1, SP2, SP3, SP4, e SP5. Como pode ser visto comparando as figuras 2B-2 e B-3, SP1, SP2 e SP3 foram desenhadas juntas e dentro da área indicada pela caixa amarela. Além disso, SP1 acabou ficando completamente rodeada por vários hemócitos (Fig. 2B-9). O grânulo rotulado SP4 também foi incorporado ao aglomerado com SP1, SP2 e SP3 (Fig. 2B-4~B-9; indicado pela caixa amarela). Com o tempo, todas as esferas de Sephadex (SP1, SP2, SP3 e SP4) tornaram-se rodeadas por muitos hemócitos. Em contraste, observou-se que os hemócitos individuais estavam em contato com SP5, mas não foram atraídos para a área indicada pela caixa amarela, mesmo estando em uma posição semelhante à SP1. Portanto, a nodulação por hemócitos parecia ocorrer aleatoriamente.

Ativação de cranulócitos por contas de látex de poliestireno modificado com carboxilato

Próximo, investigamos quais hemócitos produziram as redes e participaram das várias etapas da resposta imunológica, incluindo encapsulamento e nodulação. Para este fim, foram utilizadas contas de látex de poliestireno modificado com carboxilato, que podem ser facilmente observadas com um microscópio DIC, no lugar de patógenos, e foram coletadas imagens em tempo real dos hemócitos. A Figura 3A mostra hemócitos estimulados com contas de látex de poliestireno modificado com carboxilato durante 12 h (Filme Suplementar 3). As redes produzidas pelos hemócitos (indicadas por setas pretas) movimentaram-se ativamente ao redor das contas de látex (indicadas por setas vermelhas) (Fig. 3A-1). Com o tempo, as contas foram engolidas pelas redes e eventualmente puderam ser vistas dentro do citoplasma dos hemócitos (Fig. 3A-2~A-4). No entanto, nem todas as contas de látex de poliestireno modificado com carboxilato que encontraram uma rede foram fagocitose. Assim, o movimento dos hemócitos ativados não parecia corresponder precisamente ao movimento das esferas.

Imagens de células vivas de granulócitos estimuladas com esferas de látex de poliestireno modificado com carboxilato. (A) Imagens microscópicas leves mostrando hemócitos cultivados com contas de látex de poliestireno carboxilado-modificado durante 12 h. A-1~A-4, hemócitos cultivados após 12~18 min. As redes produzidas pelos hemócitos (setas pretas) podiam ser vistas formando ao redor das contas de látex (indicadas por setas vermelhas). As contas de látex foram engolfadas pelas redes e eventualmente capturadas dentro do citoplasma dos hemócitos (A-4). Filme disponível como Filme 3 (tempo em minutos após a estimulação). Barra de escalas = 40 µm. (B) Imagens ampliadas. (B-1) Após 4 h, muitas contas de látex de poliestireno modificado com carboxilato foram capturadas por hemócitos (contas de látex, setas vermelhas; e hemócitos específicos, círculos brancos). (B-2~B-6) Granulócitos cultivados a 0, 2, 4, 12, e 48 h após a estimulação. (B-2) Granulócitos em repouso, que são redondos ou de forma oval. (B-3) Aos 2 h após a estimulação, os granulócitos começaram a mostrar alterações morfológicas, e podem ser vistas estruturas de membrana plasmática tipo leque ou ameba (setas brancas). (B-4 e -5) Um grande número de contas de látex tinha-se acumulado no citoplasma dos granulócitos às 4 e 12 h pós-infecção. (B-6) Por 48 h pós-infecção, muitas contas de látex tinham se acumulado no citoplasma do granulócito, mas as redes não eram mais observadas, e muitos granulócitos pareciam estar inertes. Barra de escala = 15 µm (B-1) ou 10 µm (B-2~B-6).

Observações detalhadas foram feitas usando um microscópio confocal de alta magnificação (Fig. 3B). Em 4 h pós-infecção, as contas de látex de poliestireno modificado com carboxilato puderam ser observadas dentro de certos hemócitos (Fig. 3B-1; contas indicadas por setas vermelhas, e hemócitos específicos indicados por círculos brancos). Em seguida, observamos quais células específicas engoliram as esferas de látex com mais detalhes (Fig. 3B-2~B-6). A figura 3B-2 mostra granulócitos em repouso, que geralmente tinham forma redonda ou oval, com muitos grânulos escuros polimórficos dentro do citoplasma. Às 2 h após estimulação com contas de látex poliestireno modificado com carboxilato, os granulócitos começaram a mostrar alterações morfológicas, incluindo protusões da membrana plasmática em forma de leque ou de ameba (Fig. 3B-3; indicado por setas brancas). Foram observados grânulos de látex poliestireno modificado com carboxilato dentro do citoplasma granulócito em 4 h após a estimulação, e um grande número de grânulos de látex tinha se acumulado no citoplasma de muitos granulócitos por 12 h após a estimulação (Fig. 3B-4 e B-5; grânulos indicados por setas vermelhas, e redes indicadas por setas brancas). Além disso, as redes foram observadas a se tornarem maiores e mais largas com o tempo (Fig. 3B-4 e B-5). Com 48 h após a estimulação, muitas contas de látex se acumularam no citoplasma dos granulócitos, mas as redes não puderam mais ser vistas, e muitos granulócitos pareciam estar inertes (Fig. 3B-6; contas indicadas por setas vermelhas).

Como mostrado na Fig. 2, os granulócitos pareciam se fixar não só a outros granulócitos, mas também a diferentes tipos de hemócitos usando estas redes. Não observamos fagocitose em nenhum outro tipo celular, exceto para um pequeno número de plasmatócitos (dados não mostrados). Além disso, não observamos nenhuma atividade imunológica ou alterações morfológicas em nenhum outro tipo celular além dos granulócitos e um pequeno número de plasmatócitos.

Granululócitos lisossomos foram ativados por injeção de E. partículas de E. coli

Para investigar se os vacúolos observados dentro dos granulócitos eram fagosomas relacionados ao patógeno, grilos foram injetados com partículas de E. coli, que são usados principalmente como marcadores de fagocitose e fluorescem verde quando atingem organelas acidificadas como lisossomos intracelulares. Ao mesmo tempo, os hemócitos totais foram corados com LysoTracker Red, que rotula os lisossomas. Como mostrado na Fig. 4A-1, um sinal fluorescente verde (partículas de E. coli fagocitose) foi observado no citoplasma do granulócito imediatamente após a injeção das partículas. Ao mesmo tempo, um sinal fluorescente vermelho, que indica a formação de lisossomas activados, também foi observado (Fig. 4A-2). Após 4 h de injecção, foram observados vacúolos altamente polimórficos em muitos granulócitos (Fig. 4A-4 e A-5). Imagens fundidas do sinal fluorescente verde (partículas de E. coli fagocitadas) e do sinal fluorescente vermelho (lisossomas ativados) são mostradas (Fig. 4A-6). Às 12 h após a injecção, o sinal fluorescente verde começou a escurecer, enquanto o sinal fluorescente vermelho permaneceu (Fig. 4A-7~A-9). Às 24 h após a injecção, ambos os sinais fluorescentes tinham escurecido (Fig. 4A-10~A-12). Entretanto, o sinal fluorescente vermelho em granulócitos foi observado novamente às 48 h pós-injeção (Fig. 4A-13~A-15). A figura 4Aa~Ao mostra os insertos nos painéis A-1~A-15 (indicados por caixas brancas) com uma ampliação maior. Grilos que foram injetados apenas com tampão PBS foram negativos para fluorescência vermelha e verde em todos os pontos de tempo pós-injeção (Fig. 4B).

LysoTracker Rotulagem vermelha de lisossomos granulócitos em grilos injetados com partículas de E. coli fluorescentes verdes. (A) Desenvolvimento de lisossomos de granulócitos a 0 h, 4 h, 12 h, 24 h, e 48 h pós-injeção de partículas de E. coli. (A-1, A-4, A-7, A-10, e A-13) As partículas de E. coli, que são usadas como marcadores de fagocitose, fluorescem a verde quando atingem organelas acidificadas como os lisossomos intracelulares. (A-2, A-5, A-8, A-11, e A-14) Imagens de microscópio fluorescentes confocais de granulócitos corados com LysoTracker Red (um marcador lisossômico). (A-1 e A-2) Os sinais fluorescentes verde e vermelho podem ser observados no citoplasma do granulócito a partir de 1 h após a injecção. (A-4 e A-5) Muitos granulócitos mostraram fluorescência verde e vermelha nos vacúolos altamente polimórficos dos granulócitos a 4 h após a injecção. (A-7 e -8) Às 12 h após a injecção, o sinal fluorescente verde tinha diminuído mas o sinal fluorescente vermelho permaneceu. (A-10 e A-11) Às 24 h após a injecção, os sinais fluorescentes verde e vermelho tinham quase desaparecido. (A-13 e A-14) Às 48 h após a injecção, o sinal fluorescente verde tinha desaparecido completamente, mas o sinal fluorescente vermelho foi observado novamente. São mostradas imagens fundidas dos sinais fluorescentes verde e vermelho (A-3, A-6, A-9, A-12, e A-15). (a~o) Os insets nos painéis A-1 ~A-15 (indicados por caixas brancas) com maior ampliação. (B) O sinal fluorescente vermelho em granulócitos de grilos que foram injetados com PBS (controle negativo). (C) A análise citométrica de fluxo a 1 h~48 h pós-injeção. (C-1 e C-2) O sinal fluorescente verde foi de 2,08% a 1 h pós-injeção e aumentou para 24,6% a 4 h pós-injeção. (C-3~C-5) O sinal fluorescente verde diminuiu gradualmente, para 10,87% às 12 h, 3,98% às 24 h, e 1,74% às 48 h. (C-1-1~C-4-1) O sinal fluorescente vermelho aumentou para 69,54% às 12 h após a injecção e diminuiu para 5,78% às 24 h após a infecção. (C-5-1) O sinal fluorescente vermelho aumentou novamente, para 30,25%, às 48 h após a injecção. (C-1-2~C-5-2) O sinal fluorescente vermelho em granulócitos de grilos que foram injetados apenas com tampão PBS. (D) As análises citométricas de fluxo foram repetidas três vezes.

Para quantificar os sinais fluorescentes verdes e vermelhos nos grilos PBS- ou E. coli-challenged, os hemócitos foram analisados por citometria de fluxo em 0~48 h pós-injeção (Fig. 4C). A 0 h pós-injeção, 2,08% dos hemócitos foram positivos para fluorescência verde, e esta aumentou para 24,36% a 4 h pós-injeção (Fig. 4C-1 e C-2). O sinal fluorescente verde diminuiu gradualmente para 10,87% dos hemócitos às 12 h, 3,98% às 24 h e 1,74% às 48 h (Fig. 4C-3~C-5). Estes resultados indicam que as partículas de E. coli foram ativamente engolfadas e digeridas por granulócitos e foram completamente limpas por 48 h pós-injeção. Às 12 h pós-injecção, 69,54% foram positivas para fluorescência vermelha, e o sinal diminuiu para 5,78% dos hemócitos às 24 h pós-injecção (Fig. 4C-1-1~C-4-1). Consistente com as nossas observações microscópicas, o sinal fluorescente vermelho aumentou para 30,25% dos hemócitos a 48 h após a injecção. Em contraste, os grilos que foram injetados com PBS foram negativos para fluorescência verde e vermelha em todos os pontos de tempo (Fig. 4C-1-2~C-5-2). A análise citométrica de fluxo foi repetida três vezes (Fig. 4D).

Reactivação dos lisossomas granulocitários a 48 h pós-injecção

A reactivação dos lisossomas granulocitários a 48 h pós-injecção foi investigada mais detalhadamente por observação microscópica (Fig. 5A e B). Como mostrado na Fig. 4A, o sinal fluorescente verde (partículas de E. coli fagocitadas) e o sinal fluorescente vermelho (lisossomos ativados) foram vistos em 4 h pós-injeção (Fig. 5A-1~A-3). Os sinais fluorescentes foram diminuídos por 24 h pós-infecção (Fig. 5A-4~A-6). Às 24 h pós-infecção, observamos que as células podiam ser vistas dentro do citoplasma dos granulócitos (Fig. 5A-4~A-6; indicado por setas brancas). Este fenómeno foi mais aparente às 48 h pós-infecção (Fig. 5A-7~A-9; indicado por setas brancas). Além disso, os lisossomas ao redor destas células engolfadas a 48 h pós-infecção foram ativados (Fig. 5A-8). Como mostrado na Fig. 4A-14, 4C-5-1, estas observações microscópicas parecem explicar o aumento do sinal fluorescente vermelho a 48 h pós-infecção. Para confirmar isto, os núcleos dos granulócitos foram corados com 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a 48 h pós-infecção. Como mostrado na Fig. 5B-1, foram observados frequentemente granulócitos com dois núcleos. Ocasionalmente, também foram observados granulócitos contendo mais de dois núcleos, ou núcleos deformados (Fig. 5B-2 e B-3; indicados por setas brancas).

Reactivação de lisossomas granulocitários a 48 h pós-injecção. (A) Imagens de microscópio fluorescente de granulócitos às 4 h, 24 h, e 48 h pós-injeção. (A-1 e A-2) Os granulócitos mostraram sinais fluorescentes verdes e vermelhos nos vacúolos altamente polimórficos às 4 h após a injecção. (A-4 e A-5) Às 12 h após a injecção, o sinal fluorescente verde tinha diminuído, mas o sinal fluorescente vermelho permaneceu. Além disso, algumas células foram observadas dentro do citoplasma dos granulócitos (setas brancas). (A-7 e A-8) Este fenómeno foi observado com maior frequência às 48 h pós-injecção. Além disso, os lisossomas que circundam estas células engolfadas foram activados (A-8). São mostradas imagens fundidas dos sinais fluorescentes verde e vermelho (A-3, A-6, e A-9). (B) Granulócitos corados com DAPI a 48 h pós-injecção. (B-1) Dois núcleos foram observados no citoplasma do granulócito. (B-2 e B-3) Ocasionalmente, dois ou mais núcleos, ou núcleos deformados, foram observados no citoplasma do granulócito (indicado por setas brancas). Barra de escala = 10 µm (A) ou 20 µm (B).

Morte de células granulocitárias relacionadas à necrose a 48 h pós-infecção

Como mostrado nas Figs. 3B-6 e 5A-8, o acúmulo de fagosomas nos granulócitos alterou sua forma e induziu a morte celular. Aos 48 h pós-infecção, os hemócitos foram corados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) – anexo conjugado em V e iodeto de propidium (PI) para confirmar a morte apoptótica ou necrótica das células (Fig. 6A). O sinal fluorescente verde (anexina V) aumentou apenas ligeiramente entre 12 h e 48 h (Fig. A-10, A-7 e A-10), mas o sinal fluorescente vermelho (IP) mostrou forte coloração às 12 h pós-infecção (Fig. 6A-5). Com 24 e 48 h de pós-infecção, o sinal fluorescente vermelho persistiu (Fig. 6A-8 e A-11). Imagens fundidas do sinal fluorescente vermelho (PI) e das imagens DIC são mostradas (Fig. 6A-3, A-6, A-9, e A-12). Figura 6Aa~Ad mostra os insets nos painéis A-3, A-6, A-9, e A-12 indicados pelas caixas com uma ampliação maior. Estes resultados indicam que o acúmulo de fagosomas nos granulócitos não induziu a típica morte apoptótica das células, mas sim a morte celular relacionada à necrose. Para quantificar a coloração da PI, os hemócitos foram corados e examinados por citometria de fluxo às 0 h, 12 h, 24 h e 48 h pós-infecção. Com 12 h pós-infecção, 71,29% dos granulócitos foram corados com PI, comparado com 13,52% com 0 h (Fig. 6B-1 e B-2). Com 24 h pós-infecção, a coloração com IP diminuiu ligeiramente, para 45,97%, mas novamente aumentou para 76,24% com 48 h (Fig. 6B-3 e B-4). A análise da citometria de fluxo foi repetida três vezes (Fig. 6C).